KR102005434B1

KR102005434B1 - 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 바실러스 서틸리스 af11

Info

Publication number: KR102005434B1
Application number: KR1020180021349A
Authority: KR
Inventors: 송홍규; 이혜은; 조정섭; 임태빈; 권혁도
Original assignee: 강원대학교산학협력단; (주)에코비즈넷
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2019-07-30

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11) 균주, 이를 포함하는 항진균/진균 독소 분해용 조성물 및 이를 포함하는 진균의 방제방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서틸리스 AF11 균주 및 이를 포함하는 항진균/진균 독소 분해용 조성물은 아스퍼질러스 플라버스의 방제 및 이에 의해 생성된 진균 독소(아플라톡신)의 분해가 요구되는 식품 및 농업 분야에서 항진균 활성이 높은 생물학적 방제 기술로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11{Bacillus subtilis AF11 against Aspergillus flavus strain producing aflatoxin}

본 발명은 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 신규 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아플라톡신 생성 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11), 이를 포함하는 항진균/진균 독소 분해용 조성물 및 이를 포함하는 진균의 방제방법에 관한 것이다.

진균 및 진균 독소의 오염은 농업에서 주된 관심사 중 하나인데, 곡물에 피해를 일으킬 뿐만 아니라 이를 섭취한 동물에 악영향을 미치는데 특히 오염사료로 인한 가축 및 가금류 중독과 폐사를 유발한다고 알려져 있다 (Wang C., Wang Z., Qiao X., Li Z., Li F., Chen M., Wang Y., Huang Y., Cui H. 2013. Antifungal activity of volatile organic compounds from Streptomyces alboflavus TD-1. FEMS Microbiology Letters, 341 (1), 45-51). 사료 오염은 주로 Aspergillus, Penicillium 및 Fusarium 속에 의해 발생하며, 특히 진균에 의해 생성되는 2차 대사 산물인 진균 독소는 사람과 가축에게 매우 유독한 물질이며 아플라톡신 [aflatoxins (AFs)]이 그 대표적인 종류이다. 이 진균 독소들은 열에 안정하여 조리, 가공 후에도 제거되지 않아 전 세계적으로 공중 보건 및 경제적 문제를 야기하는데, 일 예로, 서유럽에서 빵의 진균오염과 관련된 경제적 손실이 연간 2억 유로 이상으로 추산되었다 (Legan J. D. 1993. Mould spoilage of bread: the problem and some solutions. International Biodeterioration & Biodegradation, 32 (1-3), 33-53). 이에 농작물, 사료 및 식품에서의 진균 오염에 대한 방제가 필요하며, 그 방법에는 물리, 화학 및 생물학적 방법이 있는데 그 중에서 소비자에게 안전하고 비용이 적게 드는 미생물을 이용한 생물학적 방법이 주목받고 있다.

다양한 미생물 중에서 Bacillus spp., Pseudomonas spp., 및 Streptomyces spp.는 여러 항진균 물질을 생산한다고 알려져 있어 생물학적 방제제로 널리 사용되고 있다 (Ferreira J. H. S., Matthee F. N., Thomas A. C. 1991. Biological control Eutypa lata on Grapevine by an antagonistic strain of Bacillus subtilis. Phytopathology, 81, 283-287). 그 중 Bacillus 종은 토양에 흔히 존재하는 항균물질 생성 세균으로 내생포자를 형성하여 다양한 물리·화학적 환경에서 생존이 가능하다 (Silo-Suh L. A., Lethbridge B. J., Rafeel S. J., He H., Clardy J., Handelsman J. 1994. Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85. Applied and Environmental Microbiology, 60(6), 2023-2030). Bacillus 종은 다양한 항진균 기작을 통해 진균의 생장을 제어하는데, 대표적으로 토양 내 존재하는 철 성분을 선택적으로 흡수하는 시데로포어[siderophore (Nagarajkumar M., Bhaskaran R., Velazhahan R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiological Research, 159, 73-81)]와 진균의 세포벽을 구성하고 있는 키틴 (chitin)을 분해할 수 있는 키티나제 (chitinase)와 β-1, 3-글루카나제 (β-1, 3-glucanase) 등의 물질을 생성한다고 알려져 있다 (Patil 등, 2013). 몇몇 연구에서 Bacillus subtilis가 Aspergillus 종의 생장을 저해한다고 보고되었다 (Foldes T., Baanhegyi I., Herpai Z., Varga L., Szigeti J. 2000. Isolation of Bacillus strains from the rhizosphere of cereals and in vitro screening for antagonism against phytopathogenic, food-borne pathogenic and spoilage micro-organisms. Journal of Applied Microbiology, 89 (5), 840-846).

항진균성 Bacillus subtilis 균주의 이러한 특성은 진균 독소를 생성하는 Aspergillus flavus의 생장을 제어하는 미생물제로 각종 농작물에 대해 사용할 경우 독소 생성 진균을 방제할 수 있어 진균 생장으로 인한 피해 및 독소 오염을 사전에 차단할 수 있을 것이며 또한 항진균성 균주로부터 생성되는 항진균 물질로부터 항진균제의 개발도 가능할 수 있다.

미국특허 US4931398A (1990.06.05) 한국공개특허 특2000-0063185호 (2000.11.06) 한국공개특허 제10-2013-0113037호 (2013.10.15)

Plant Pathol. J. 32(3) : 209-215 (2016)

본 발명의 발명자들은 진균 독소인 아플라톡신을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스 균주를 효율적으로 억제하는 기술에 대하여 연구하던 중, 신규한 바실러스 서틸리스 균주가 높은 아스퍼질러스 플라버스 억제 활성 및 아플라톡신 분해 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 아스퍼질러스 플라버스 균주를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11) 균주, 이를 포함하는 항진균/진균 독소 분해용 조성물 및 이를 포함하는 진균의 방제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, 아스퍼질러스 플라버스를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11, 수탁번호 KCTC18658P) 균주가 제공된다.

일 구현예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자를 갖는 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 아스퍼질러스 플라버스의 생장, 이의 포자 생성 및 포자 발아를 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있으며, 시데로포어 생산 활성을 갖는 것일 수 있으며, 키티나제 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 바실러스 서틸리스 AF11 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 항진균 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 항진균 조성물은 pH 5-8일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 바실러스 서틸리스 AF11 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 진균 독소 분해용 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 진균 독소는 아플라톡신일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 항진균 조성물을 방제 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는 진균의 방제방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 진균 독소 분해용 조성물을 분해 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는 진균 독소의 분해방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 진균 독소는 아플라톡신일 수 있다.

본 발명에 의해, 아플라톡신 분해용 균주 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11, 수탁번호 KCTC18658P)가 독소 생성 균주인 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) 3종류 균주 모두에 대하여 균사 생장과 포자 생성을 억제하였고, 포자 생성을 3종류의 진균에 대해서 모두 84% 이상 억제하였고, 진균의 포자 발아 및 진균 자체의 생장을 저해하였으며, pH 5.5에서 진균 생장을 가장 높게 저해하였으며, 보고된 타 균주보다 10배 높은 시데로포어 생성량을 나타냈으며, 키티나제 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 바실러스 서틸리스 AF11 균주 및 이를 포함하는 항진균/진균 독소 분해용 조성물은 아스퍼질러스 플라버스의 방제 및 이에 의해 생성된 진균 독소(아플라톡신)의 분해가 요구되는 식품 및 농업 분야에서 항진균 활성이 높은 생물학적 방제 기술로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 영양 한천 평판 상에 형성된 균주 AF11 콜로니의 사진이다.
도 2는 아플라톡신 B1을 생성하는 아스퍼질러스 플라버스 KACC44986(A), KACC45068(B)와 KACC45146(C)에 대한 아가 스팟 어세이(agar spot assay)에서 바실러스 서틸리스 AF11의 생장저해대의 생성 사진이다.
도 3은 25℃에서 120 시간 동안 PDA 상에서 배양된 아플라톡신 생성 진균인 A. flavus KACC44986 (A), KACC45068 (B) 및 KACC45146 (C)를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11의 저해 활성 사진이다.
도 4는 NB 배지에서 바실러스 서틸리스 AF11의 시데로포어 (siderophore) 생성 그래프이다.
도 5는 기본 염분 배지 (Basal salt medium)에서 바실러스 서틸리스 AF11의 키티나제 (chitinase) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 바실러스 서틸리스 AF11의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과이다.

상기 균주의 16S rRNA 유전자에 대하여 서열분석한 결과, 서열번호 1의 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 균주는 NA 배지에서 방사형으로 퍼지는 집락의 모양을 지녔다 (도 1 참조).

상기 균주는 독소 생성 균주인 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) 3종류 균주 모두에 대하여 균사 생장과 포자 생성을 억제하고, 포자 생성을 3종류의 진균에 대해서 모두 84% 이상 억제하며, 진균의 포자 발아 및 진균 자체의 생장을 저해하며, pH 5.5에서 진균 생장을 가장 높게 저해하며, 보고된 타 균주보다 10배 높은 시데로포어 생성량을 나타내고, 키티나제 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 바실러스 서틸리스 AF11 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 항진균 조성물이 제공된다. 상기 진균은 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus)이다.

일 구현예에서, 상기 항진균 조성물은 pH 5-8, 바람직하게는 pH 5-7일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 진균은 아스퍼질러스 플라버스이고, 상기 진균 독소는 아플라톡신일 수 있다.

상기 AF11 균주는 아스퍼질러스 플라버스의 생장 저해 뿐만 아니라, 아스퍼질러스 플라버스가 생성하는 아플라톡신을 최대 100% 분해하는 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

일 구현예에서, 상기 진균은 아스퍼질러스 플라버스이고, 상기 방제 대상물은 식품 또는 사료일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 진균은 아스퍼질러스 플라버스이고, 상기 진균 독소는 아플라톡신일 수 있다. 또한, 상기 분해 대상물은 식품 또는 사료일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

Ⅰ. 재료 및 방법

1. 항진균능을 가진 세균 균주의 분리 및 동정

항진균 활성을 지닌 세균을 분리하기 위한 시료는 진균이 있을 것으로 예상되는 토양시료와 야생 및 사육 동물의 분변 (잉꼬, 사슴, 삵, 너구리 및 고라니 등)에서 채취하였다. 채취한 시료는 50 ml 코니칼 튜브(conical tube)에 5-10 ml까지 담아 0.85% NaCl 용액 30 ml를 넣고 30분 동안 추출 교반기(extraction shaker)로 진탕하였다 [300 stroke per minute (spm)]. 현탁된 시료의 상등액 200 μl는 Guan 등 (Guan S., Ji C., Zhou T., Li J., Ma Q., Niu T. 2008. Aflatoxin B₁ degradation by Stenotrophomonas maltophilia and other microbes selected using coumarin medium. International Journal of Molecular Sciences, 9, 1489-1503)의 쿠마린 한천(coumarin agar) 배지 조성을 변형시킨 배지 (coumarin 1 g, KH₂PO₄ 0.25 g, NH₄NO₃ 1 g, CaCl₂ 0.25 g, MgSO₄7H₂O 0.25 g, FeSO₄ 1 mg, agar 15 g, 증류수 1 L)에 도말하여 37℃에서 3-7일간 암조건으로 배양하였다. 자라난 세균은 새로운 쿠마린 한천 배지에서 총 3번의 계대 과정을 거쳐 순수분리 후, 영양 한천(nutrient agar, NA) 배지 (yeast extract 3 g, peptone 5 g, glucose 6 g, NaCl 10 g, agar 15 g, 증류수 1 L, pH 7)에 획선 배양하였다 (2-5일, 37℃, 암조건). 각 균주의 OD₆₀₀=1.00의 세균 집락수는 평판 배지에서 계수하여 CFU/ml로 나타내었다.

아플라톡신 B₁(AFB₁) 분해능 및 독소 생성 진균 저해능을 가진 분리 균주는 NA 배지에 48시간 배양하여 (주)마크로젠에 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석에 이용된 유니버설 프라이머(universal primer)는 785F 5’ (GGATTAGATACCCTGGTA) 3’ 및 907R 5’ (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT) 3’이다. 의뢰하여 얻은 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 등록 균주의 염기서열과 99%이상 일치하며 가장 높은 상동성을 가진 균주로 동정하였고, 추가적으로 API kit (50CH, 20E, Biomerieux, France)를 이용한 생리·생화학적 시험을 수행하였다.

2. 항진균 활성

모든 실험에 이용된 아플라톡신(AFs) 생성 진균은 국립농업과학원 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection: KACC)으로부터 분양받은 Aspergillus flavus 3개 균주이다 (KACC44986, KACC45068 및 KACC45146). 실험에 사용된 배지는 영양 한천(nutrient agar, NA), 포테이토 덱스트로오스 한천 (potato dextrose agar, PDA) [(Difco Lab, USA) 39 g, 증류수 1 L] 및 15% 효모 추출물 자당 [yeast extract sucrose (YES; yeast extract 20 g, sucrose 150 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 0.5 g, 증류수 1 L, pH 6.2±0.2)]이다. 진균은 PDA에서 배양하여 (7일, 30℃), 포자를 0.05% (v/v) 트위 80 (Tween 80) 용액으로 평판 배지로부터 회수하였고 뉴바우어 챔버 [Neubauer chamber (Paul Merienfeld GmbH & Co., Germany)]를 이용하여 계수하여 사용하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

1) 아가 스팟 어세이 (Agar spot assay)

항진균능을 조사하기 위해 수행된 아가 스팟 어세이는 Cabo 등 (Cabo M. L., Braber A. F., Koenraad P. M. F. J. 2002. Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria against Penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. Journal of Food Protection, 65 (8), 1309-1316), Hassan과 Bullerman (Hassan Y. I., Bullerman L. B. 2008. Antifungal activity of Lactobacillus paracasei ssp. tolerans isolated from a sourdough bread culture. International Journal of Food Microbiology, 121, 112-115) 그리고 Sangmanee와 Hongpattarakere (Sangmanee P., Hongpattarakere T. 2014. Inhibitory of multiple antifungal components produced by Lactobacillus plantarum K35 on growth, aflatoxin production and ultrastructure alterations of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Food Control, 40, 224-233)의 방법을 수정하여 이용하였다. 이 실험은 두 가지의 한천 층을 겹쳐 수행한 방법으로, 아래는 선별 세균 균주 그리고 위는 진균의 생장 배지를 이용하였다. 미리 배양한 선별 균주의 배양액 (48시간, 37℃)은 NA 배지 가운데의 두 점에 5 μl 점적 후 48시간 배양하였고, 세균 집락이 제대로 형성되지 않은 경우 37℃에서 120시간까지 배양하였다. 선별 균주의 집락이 형성된 NA 배지에 0.8%의 한천이 포함된 10 ml의 PDA (최종 포자 농도: 10⁵ spores/ml)를 겹쳐 굳힌 후, 30℃에서 120시간 동안 배양하였다. 선별 균주가 진균 생장을 억제한 정도로 항진균능을 평가하였다.

2) 진균 생장 및 포자 생성 억제

독소 생성 진균의 생장 및 포자 생성 억제에 대한 선별 균주의 효과를 조사하기 위해 Veras 등 (Veras F. F., Correa A. P. F., Welke F. E., Brandelli A. 2016. Inhibition of mycotoxin-producing fungi by Bacillus strains isolated from fish intestines. International Journal of Food Microbiology, 238, 23-32)의 방법을 이용하였다. 실험에 사용된 세균은 미리 배양한 액체배지를 원심분리 (3,000 g, 30분, 4)하여 회수 후, 0.85% NaCl에 현탁하였다. 각 세균 현탁액은 15 ml의 액체 상태의 PDA와 섞어 페트리 디쉬(petri dish)에 부었다. 배지를 식혀 굳힌 후, 멸균된 페이퍼 디스크 (paper disc, 지름 5 mm)를 플레이트(plate) 가운데 올리고 진균 포자 현탁액 (10⁶ spores/ml) 10 μl를 분주하였다. 대조구는 세균 없이 동일하게 진행하였고, 모든 평판 배지는 25에서 10일 동안 배양하였다. 진균 집락의 직경은 24시간마다 직각으로 측정하여 두 값의 평균을 내었다. 균사의 생장이 보이지 않는 평판 배지는 100% 저해된 것으로 간주하였고, 진균 생장 저해 정도는 하기 수식 1을 이용하여 계산하였다.

[수식 1]

생장 저해율 (%) =[(Dc - Dt) / Dc] x 100

(Dc는 대조구의 진균 집락 직경이고, Dt는 처리구의 진균 집락 직경이다.)

생장을 평가한 후, 모든 실험구는 진균 포자 생성에 대한 세균의 효과를 분석하였다. 진균 집락의 모든 포자는 15 ml의 Tween 80 (0.05%, v/v) 용액으로 씻어내고 뉴바우어 챔버 (Neubauer chamber)를 이용하여 계수하였다 (spores/ml). 포자 생성 저해 정도는 하기 수식 2를 이용하여 계산하였다.

[수식 2]

포자 생성 저해율 (%) = [(Nc - Nt) / Nc] x 100

(Nc는 대조구의 진균 포자 생성 수이고, Nt는 세균을 포함하고 있는 처리구의 포자 생성 수이다.)

3) 포자 발아 저해

진균의 포자 발아 저해에 대한 선별 균주의 효과를 조사하기 위해 Droby 등 (Droby S., Wisniewski M. E., Cohen L., Weiss B., Touitou D., Eilam Y., Chalutz E. 1996. Influence of CaCl₂ on Penicillium digitatum, grapefruit peel tissue, and biocontrol activity of Pichia guilliermondii. Phytopathology, 87, 310-315), Wang 등 (Wang Y., Bao Y., Shen D., Feng W., Yu T., Zhang J., Zheng X. D. 2008. Biocontrol of Alternaria alternata on cherry tomato fruit by use of marine yeast Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman. International Journal of Food Microbiology, 123, 234-239) 및 Veras 등 (Veras F. F., Correa A. P. F., Welke F. E., Brandelli A. 2016. Inhibition of mycotoxin-producing fungi by Bacillus strains isolated from fish intestines. International Journal of Food Microbiology, 238, 23-32)의 방법을 수정하여 이용하였다. 진균 포자 현탁액 (10⁶ spores/ml) 100 μl는 800 μl의 15% YES 배지가 담긴 원심분리기 튜브 (microcentrifuge tube, 1.5 ml)에 첨가하였고, 100 μl의 세균 현탁액 (10⁷ CFU/ml 또는 OD₆₀₀=1.00)을 더하였다. 대조구는 세균 현탁액 대신 0.85% NaCl 용액을 100 μl 첨가하였다. 모든 실험구는 25에서 24시간 동안 배양하였고, 그 후 분생포자 (conidia)의 발아를 광학현미경으로 관찰하였으며, 발아관의 길이가 분생포자의 길이와 같거나 길 때, 발아한 것으로 간주하였다. 각 실험구 당 100개의 포자를 관찰하였으며 실험은 2반복으로 수행하였다. 포자 발아의 정도는 하기 수식 3을 이용하여 계산하였다.

[수식 3]

포자 발아율 (%) = [(Gc - Gt) / Gc] x 100

(Gc는 대조구에서의 포자 발아를 백분율로 나타낸 것이고, Gt는 처리구의 포자 발아를 백분율로 나타낸 값이다.)

4) 액체배지에서의 진균 생장 및 독소 농도 변화

액체배지에서의 진균 생장 및 독소 농도 변화 조사는 El-Gendy 와 Marth (1981) 및 Sun 등 (2016)의 방법을 수정하여 수행하였다. 멸균된 45 ml의 15% YES 배지에 A. flavus KACC44986, KACC45068 및 KACC45146의 포자 현탁액 (포자 최종 농도: 10⁵ spores/ml)을 첨가하였고, 세균은 OD₆₀₀=1.00으로 보정한 배양액을 배지의 10%만큼 접종하였다. 대조구는 세균을 더하지 않은 것으로 하였다. 모든 처리구는 30에서 5일간 배양 (200 rpm, 암조건)하였으며, 24시간 주기로 Whatman No. 1 여과지로 진균 균사체를 걸러냈다. 대조구에 비해 진균 생장 및 독소 농도 변화가 가장 큰 분리 균주에 대해 다양한 온도, 진탕 속도 및 pH 조건에서의 효과를 조사하였다. 균사체의 건조 중량은 후드에서 질량 변화가 없을 때까지 건조시킨 후 측정하였으며 실험은 3반복으로 수행하였다. 균사 생장 저해 정도는 하기 수식 4로 계산하였다.

[수식 4]

균사 생장 저해율 (%) = (대조구 질량 - 처리구 질량) / 대조구 질량 x 100

독소 추출은 각 플라스크로부터 얻어진 배양액을 250 ml 분별깔때기로 옮긴 후, 배양액의 두 배 되는 양의 클로로포름 (chloroform)을 넣어 진탕 (20분, 300 spm)하여 추출하였고, 유기상 (organic phase)은 평바닥 플라스크(flat bottom flask)로 옮겼다. 이 과정을 총 두 번 반복 후, 회전식 감압 증발기로 유기용매를 모두 증발시켰다 (55℃). 50% 메탄올 (v/v)을 첨가하여 재용해 시킨 후, 시린지 필터 (Hyundai micro, 0.2 μm, hydrophobic)로 여과하여 high performance liquid chromatography (HPLC; Breeze Model, Waters Co., USA)로 컬럼 [Gemini 5 μ C18 column (150 x 4.6 mm) (Phenomenex, USA)]을 이용하여 분석하였다. 분석에 이용한 이동상은 50% 메탄올 (v/v)이며, 시료 주입량은 10 μl, 유속은 0.85 ml/min으로 하여 UV검출기 (Waters 2487, USA)에서 360 nm의 파장으로 30분간 분석하였다. 검량선은 AFB₁ 표준물질 (Cayman Chemical Co., USA)로 작성하여 AFB₁을 정량하였다. 독소 농도 변화는 하기 수식 5를 이용하여 계산하였다.

[수식 5]

독소 농도 변화율 (%) = (대조구의 독소 양 - 처리구의 독소 양) / 대조구의 독소 양 x 100

3. 항진균 물질 생성능

1) 시데로포어

시데로포어 (Catechol type) 활성 조사는 Nagarajkumar 등 (Nagarajkumar M., Bhaskaran R., Velazhahan R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiological Research, 159, 73-81)의 방법을 수정하여 수행하였다. 미리 배양한 선별 균주의 배양액 (24시간, 37)은 OD₆₀₀를 1.00으로 보정 후 새로운 NB에 10% 접종하였다 (최종 부피: 100 ml). 접종액은 24시간마다 15 ml씩 회수하여 원심 분리 (3,000 g, 15분, 4)하였다. 얻어진 10 ml의 상등액은 1 M의 HCl을 이용하여 pH 2.9로 보정 후, 10 ml의 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)를 첨가하여 300 spm에서 30분간 진탕하였다. 추출액의 유기상 5 ml는 새로운 코니칼 튜브 (50 ml)에 옮겨 동량의 Hathway 용액 (0.1 M의 HCl로 제조한 0.1 M FeCl₃ 1 ml, 0.1 M potassium ferricyanide 1 ml, 증류수 98 ml)을 첨가하여 암조건에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 시료는 분광광도계 (Shimadzu UV-1700, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 700 nm에서 흡광값을 측정하였으며, 디히드록시 벤조산 (dihydroxy benzoic acid)을 이용하여 검량선을 작성하여 정량하였다. 대조구로는 NB배지를 이용하였고 실험은 3반복으로 수행하였다.

2) 키티나제

키티나제 활성 조사는 Nagpure과 Gupta (Nagpure A., Gupta R. K. 2013. Purification and characterization of an extracellular chitinase from antagonistic Streptomyces violaceusniger. Journal of Basic Microbiology, 53, 429-439)의 방법을 수정하여 수행하였다. Basal salt 액체 배지 [K₂HPO₄ 0.7 g, KH₂PO₄ 0.3 g, MgSO₄ 0.5 g, FeSO₄ 0.01 g, ZnSO₄ 0.001 g, MnSO₄ 0.001 g, (NH₄)₂SO₄ 0.25 g, yeast extract 1 g, 0.1% (w/v) colloidal chitin, 증류수 1 L]에서 미리 배양 (37, 150 rpm)한 선별 균주의 배양액은 OD₆₀₀=1.00으로 보정하여 새로운 basal salt 액체 배지 (45 ml)에 10% 접종하였다. 배양액은 24시간 간격으로 3 ml씩 회수하여 원심분리 (5,000 g, 20분, 4) 후, 상등액을 얻었다. 상등액 500 μl는 1%의 키틴 (chitin)이 첨가된 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) 500 μl와 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액 100 μl는 DNS 용액 (3, 5-dinitrosalicylic acid 10 g, sodium hydroxide 0.3 M, rochelle salt 250 g, 증류수 1 L) 200 μl와 혼합하여 100℃에서 10분간 반응시킨 후, 5분간 냉각하여 반응을 종료시켰다. 시료의 흡광도는 575 nm에서 측정하였고 실험은 3반복으로 수행하였으며, N-acetyl-D-glucosamine (NAG)로 표준곡선을 작성하여 정량하였다. 효소 생성 단위인 1 unit (U)은 60분간 1 mmol의 NAG를 생성하는 효소양으로 하였다.

Ⅱ. 실험결과

1. 항진균능을 가진 세균 균주의 분리 및 동정

영월 야산의 토양에서 순수 분리된 세균 균주 AF11은 NA 배지에서 방사형으로 퍼지는 집락의 모양을 지녔다 (도 1 참조).

16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 AF11 균주는 Bacillus subtilis DSM 10 균주와 99% 이상 상동성을 보였다 (하기 표 1 참조). 하기 표 1에 16S rRNA 유전자 서열분석에 의한 분리된 AF11 균주의 확인 사항을 기재하였다.

또한, AF11 균주는 API kit (50CH, 20E)를 이용하여 생리·생화학적인 조사를 수행하였다 (하기 표 2 참조).

Strain	Type strain	Pairwise similarity (%)
AF11	Bacillus subtilis DSM 10	100.0

2. 항진균 활성

1) 아가 스팟 어세이 (Agar spot assay)

독소 생성 Aspergillus flavus (KACC44986)에 대한 선별 균주의 저해환을 120시간 동안 조사한 결과 AF11 균주는 균사 생장과 포자 생성을 억제하였다. AF11 균주는 KACC44986 뿐만 아니라 나머지 2종류의 독소 생성 A. flavus (KACC45068 및 KACC45146)에 대해서도 동일한 결과를 보였다 (도 2 참조). 선행특허 (한국공개특허 제10-2009-0070975호)에서 Bacillus subtilis MJP1 KFCC 11401P 균주가 다른 진균에 대해서는 항진균능을 보였지만, Aspergillus flavus ATCC 22546에 대해서는 항진균능을 나타내지 못하였다. 그에 비해 AF11 균주의 A. flavus에 대한 항진균능은 우수한 결과이다.

2) 진균 생장 및 포자 생성 억제

평판 배지에서 독소 생성 진균에 대한 선별 세균의 효과를 조사한 결과, AF11 균주는 KACC45068에 대해 균사 생장을 대조구에 비해 약 20%만 저해하였지만, 포자 생성을 3종류의 진균에 대해서 모두 84% 이상 억제하였다. 특히 KACC45146에 대한 포자 생성 억제능은 91.6%까지 나타났다 (도 3 및 하기 표 3 참조). 선행 연구에서 독소 생성 진균의 포자 생성이 진균 독소 생성과 관련 있음이 보고된 바 있으며 (Brodhagen M., Keller N. P. 2006. Signalling pathways connecting mycotoxin production and sporulation. Molecular Plant Pathology, 7 (4), 285-301), 이에 AF11 균주는 균사 생장을 크게 억제하지 못했지만 포자 생성을 억제한 것으로 보아 2차 대사산물인 진균 독소 생성을 억제할 수 있을 것으로 기대되었다.

하기 표 3에 아플라톡신 생성 진균의 집락 직경 (colony radius)과 포자 생성 (sporulation)에 대한 바실러스 서틸리스 AF11의 영향을 나타내었다 (25℃, 10일 배양).

3) 포자 발아 억제

진균 포자 발아 저해에 대한 선별 균주의 효과를 조사한 결과, AF11 균주는 대조구에 비해 KACC44986의 포자를 33.3%, KACC45068의 포자를 86.1% 그리고 KACC45146의 포자를 55.1% 저해하였다 (하기 표 4 참조). 포자 발아는 Bacillus sp.의 이투린 A (iturin A), 바실로마이신 (bacillomycin) 및 펜기신 (fengycin) 등의 항진균성 물질에 의한 세포벽과 세포막에서의 세포학적 변화에 의한 것이라고 보고된 바 있다 (Moyne A. L., Shelby R., Cleveland T. E., Tuzun S. 2001. Bacillomycin D: An iturin with antifungal activity against Aspergillus flavus. Journal of Applied Microbiology, 90, 622-629; Romero D., de Vicente A., Rakotoaly R. H., Dufour S. E., Veening J. W., Arrebola E., Cazorla F. M., Kuipers O. P., Paquot M., Perez-Garciia A. 2007b. The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factors in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaera fusca. The American Phytopathological Society, 20 (4), 430-440). Gong 등 (Gong Q., Zhang C., Lu F., Zhao H., Bie X., Lu Z. 2014. Identification of bacillomycin D from Bacillus subtilis fmbJ and its inhibition effects against Aspergillus flavus. Food Control, 36, 8-14)은 B. subtilis에 의해 분비된 이투린 그룹의 리포펩티드 (lipopeptide)인 바실로마이신 D (bacillomycin D)가 균사체의 생장뿐만 아니라 포자 생성 및 발아에 영향을 미친다고 보고하였다.

4) 액체배지에서의 진균 생장 및 독소 농도 변화

독소 생성 진균과 선별 균주 AF11를 45 ml의 15% YES 배지에 동시 접종하였을 때, 120시간 동안 진균의 생장 (균사 건조 중량)이 저해됐고, 처리구의 진균 독소 농도가 대조구에 비해 낮았다. AF11 균주는 3종류의 진균 생장을 많게는 90% 이상 저해하였으며 독소 농도는 대조구보다 최대 99% 낮았다 (하기 표 5 참조). 이는 이전 연구에서 Bacillus subtilis CGMCC1.504가 독소 생성 A. flavus CGMCC3.4408 생장을 87%, AFB₁ 농도를 27% 감소한 것에 비해 높은 수치이다 (Zuo R., Chang J., Yin Q., Wang P., Cheng W., Wang X., Liu J. 2012. Inhibiting Aspergillus flavus growth and degrading aflatoxin B₁ by combined beneficial microbes. African Journal of Biotechnology, 11 (65), 12903-12909).

이후, 다양한 조건에서 동일한 실험을 수행한 결과, AF11 균주는 온도 조건 30℃와 35℃에서 진균 생장 저해 활성이 가장 높고 잔류 독소 농도가 가장 낮게 나타났으며, 두 조건에서의 AFB₁ 농도는 세계적인 규제 농도인 10 μg/L보다 낮은 농도를 나타냈다 (하기 표 6 참조). 진탕 속도 조건에서 AF11 균주는 0 rpm과 200 rpm에서 진균 생장 억제 효과가 가장 좋았으며 0, 100, 150 및 200 rpm에서 모두 독소 농도가 대조구보다 98% 이상 낮았다 (하기 표 7 참조). pH조건에서 AF11 균주는 pH 5.5에서 진균 생장을 가장 많이 저해하였으며 (97.2%), pH 7에서의 독소 농도가 가장 낮았다 (약 100%) (하기 표 8 참조).

3. 항진균 물질 생성능

1) 시데로포어

선별 균주가 생성하는 시데로포어에 대한 정량 실험을 수행한 결과, AF11 균주는 배양 48시간에 가장 많은 122 μM의 시데로포어를 생성하였다(도 4 참조). 이는 12-13 μM 생성한다고 보고된 P. fluorescens PFMDU3, PFMDU8와 PFMDU9 균주 보다 최대 10배 높은 생성량을 나타낸 것이다 (Nagarajkumar M., Bhaskaran R., Velazhahan R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiological Research, 159, 73-81).

2) 키티나제

선별 균주로 키티나제 활성을 측정한 결과, AF11 균주는 72시간에 각각 1.2 U/ml로 가장 많은 양의 키티나제를 생성하였다 (도 5 참조).

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC18658P

20180116

<110> Kangwon national university-industry cooperation foundation <120> Bacillus subtilis AF11 against Aspergillus flavus strain producing aflatoxin <130> P171259 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1727 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus subtilis AF11 <400> 1 gctgtggtct ttatcttttt atcccccctc cctgccggtt gcgggagtaa accctttccc 60 cttccaacat ttgtcattct cctaacggga gggggttttt catatttcgc cggcgtattt 120 tgaataattt tcatctgcca ttgtaattca ttatatgttt taggcttttt tcccgagttc 180 cttttctctt taaccccgcc cccctttata taattttttt tttctctgtc aggacgaacg 240 ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 300 tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 360 gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 420 ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 480 accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 540 cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 600 cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 660 gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 720 aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 780 cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 840 agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 900 cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 960 actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 1020 gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 1080 cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 1140 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 1200 gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1260 gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1320 gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1380 aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1440 acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1500 atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1560 aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1620 caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1680 aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg caaaggggtg tacaaca 1727

Claims

아스퍼질러스 플라버스를 억제하는 바실러스 서틸리스 AF11(Bacillus subtilis AF11, 수탁번호 KCTC18658P) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주가 서열번호 1의 16S rRNA 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주가 아스퍼질러스 플라버스의 생장, 이의 포자 생성 및 포자 발아를 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주가 시데로포어 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주가 키티나제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 바실러스 서틸리스 AF11 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 항진균 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물이 pH 5-8인 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 바실러스 서틸리스 AF11 균주 또는 그 배양 상등액을 포함하는 진균 독소 분해용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 진균 독소가 아플라톡신인 것을 특징으로 하는 진균 독소 분해용 조성물.
제6항의 항진균 조성물을 방제 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는 진균의 방제방법.
제8항의 진균 독소 분해용 조성물을 분해 대상물에 접촉시키는 단계를 포함하는 진균 독소의 분해방법.
제11항에 있어서, 상기 진균 독소가 아플라톡신인 것을 특징으로 하는 분해방법.