KR101717137B1 - 사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스 schb1433 균주 및 이의 용도 - Google Patents

사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스 schb1433 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주, 상기 바실러스 서틸리스 SCHB1433 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 상기 바실러스 서틸리스 SCHB1433 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명을 이용하면 친환경적이면서 화학농약 또는 화학비료의 사용을 대체할 수 있는 미생물 농약 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스 SCHB1433 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SCHB1433 strain having siderophore production activity, enzyme secretion activity and antifungal activity against plant pathogen and uses thereof}
본 발명은 사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스 SCHB1433 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대 농업은 작물을 병으로부터 보호하기 위해 유기합성의 농약 사용에 의존하고 있는데, 이러한 화학농약을 사용하여 이루어진 농업은 환경오염, 맹독성, 약제 저항성을 가진 병원균의 출현, 토양 및 농산물 내 농약 잔류 등 인간 및 환경에 대해 많은 부작용을 유발하고 있다. 이러한 농약 부작용의 우려 속에, 최근 환경보호에 대한 인식 및 안전한 농산물에 대한 인식이 높아지면서 친환경적인 농업재배방식을 선호하는 경향이 더욱 증가하고 있다.
세계적으로 생물농약의 시장은 도입단계를 지나 성장 초기 단계로서 전 세계적으로 친환경 정책 및 안전한 농산물에 대한 관심이 증가함에 따라 폭발적으로 시장이 성장하리라 기대되고 있다. 세계 생물농약은 2001년 농약 시장의 약 2% 였지만, OECD 국가를 중심으로 한 친환경 농업정책으로 인하여 그 시장규모가 2015년에는 세계 농약시장의 약 15%에 달할 것으로 추정되고 있다. 또한, 21세기에 들어오면서 우리나라를 포함한 OECD 국가에서는 환경오염 및 잔류농약 등 부작용 때문에 화학농약과 화학비료 사용을 줄이는 친환경 농업정책을 적극 추진하고 있다. 따라서, 우리나라에서도 생물 농약은 농산물에 대한 잔류독성의 염려가 없고, 농업생태계를 교란하지 않는다는 장점이 알려지면서 미생물 제제를 이용한 생물학적 방제법에 대한 관심이 높아지고 있다. 국내에서 생물농약에 대한 연구는 1980년을 기점으로 1987년 인삼 뿌리썩음병 방제용 바이코나의 개발로 시작되어 현재까지 한국화학연구원과 생명공학연구원, 농업과학기술원 등의 연구소와 전국의 대학교 그리고 기업체에서 새롭고 인간과 환경에 안전한 미생물 농약을 개발하고자 노력하고 있다. 그러나 친환경 농산물 생산을 위해서는 합성 농약을 대신할 수 있는, 효과가 우수한 미생물 농약이 필요하며, 또한 실험실의 제한된 조건에서 선발된 길항 능력이 있는 미생물은 실제 포장에서는 정착하여 생존하지 못하고, 실험실의 제한된 조건에서만 길항 세균을 선발하기 때문에 길항효과를 발휘하지 못하는 경우가 매우 많다. 또한 국내 연구기관들이 선진 외국처럼 세균, 진균 등을 사용하여 식물병 방제를 위한 길항미생물 탐색 및 실용화 연구를 하고 있으나 여전히 기초단계의 연구를 수행하고 있으며, 작물재배에서 길항미생물을 이용한 식물병 방제에 대한 연구는 대학교, 농업관련 국가연구소, 정부출연연구소 등을 중심으로 추진되고 있으나, 아직 국내 연구 인력 및 기술 축적이 외국만큼 충분하지 않고 국내 재배여건에 적용되어 작물생산에 효과 있는 농용 생물농약의 사용 및 실용화는 미미한 실정이다.
현재 친환경 농업생산을 위하여 쌀겨, 음식물, 게껍질 등의 부산물뿐만 아니라 미생물 등을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 작물에서의 병 방제 능력이 뛰어나고 작물생육촉진, 토양개량효과 등에 탁월한 길항미생물을 이용한 농법이 널리 확산되고 있다. 주로 사용되는 토양미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 뿌리혹박테리아 속(Rhizobium sp.) 등이 있다.
한편, 한국등록특허 제1454774호에는 '식물 생장 촉진 또는 식물 병 방제 활성을 갖는 바실러스 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스 SCHB1433 균주 및 이의 용도에 대해 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주는 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 세포외 효소인 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)를 생산하며, 다양한 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 사이드로포어를 생산하고 세포외 효소인 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)를 생산하며, 다양한 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 지닌 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주를 분리하였다. 따라서, 본 발명을 이용하면 친환경적이면서 화학농약 또는 화학비료의 사용을 대체할 수 있는 미생물 농약 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 세포외 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주를 제공한다.
상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주는 토양으로부터 분리하였으며, 사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소를 분비하며, 식물병 원인균에 대해 항진균 활성이 뛰어난 균주로 선발되었다. 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주는 농업생명공학연구원에 2015년 7월 28일자로 기탁하였다(기탁번호: KACC81009BP).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)일 수 있으며, 상기 식물병 원인균은 검은별무늬병 원인균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 잎집무늬병 원인균인 펠리쿨라리아 사사키(Pellicularia sasaki), 사과점무늬낙엽병 원인균인 알터나리아 말리(Alternaria mali), 도열병 원인균인 스클레로티니아 트리폴리움(Sclerotinia trifolium), 잿빛곰팡이병 원인균인 보트리오티니아 퍼켈리아나(Botryotinia fuckeliana), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusariium oxysporum), 고추탄저병 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 및 뿌리썩음병 원인균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다. 상기 식물병 방제용 미생물 제제는 미생물 농약의 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 미생물 제제는 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 미생물 제제는 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 식물병 방제용 미생물 제제는 유효성분으로서 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주를 단독으로, 또는 2종 이상의 다른 항진균, 항균 또는 항바이러스성 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 미생물 제제는 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 식물병을 방제하는 방법으로는 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 및 이의 배양액의 유효량을 이용한 방제용 미생물 제제를 식물이나 토양에 분무 또는 살포하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 식물병을 방제하기 위해 방제용 미생물 제제를 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상 수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상 수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010cfu/㎖으로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물 생육을 촉진시키는 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 토양 시료 수집
본 실시예에 사용된 토양은 전북 순창군 복흥면 일대(위도 35.4672, 경도126.9347)에서 5월에 연작피해가 있는 농가와 없는 농가 총 23곳을 선정하여 토양시료를 수집하였다(표 1). 채취방법은 상토를 걷어내고 15cm 이하의 토양을 채취하며 토양을 각각 다른 지점에서 8점 이상씩 채취하였으며, 시료는 폴리에틸렌 비닐백(polyethylene vinyl bag)에 넣어 4℃에 보관하여 하기 실시예의 시료로 사용하였다.
토양 시료 목록
번호 채취 지역 작목명 연작피해 유무
1 대각리 정명권 오미자 무
2 서마리 김용덕 오미자 무
3 동산리 이봉진 오미자 무
4 서지리 방성구 오미자 무
5 동산리 이봉진 오미자 유
6 서지리 김용덕 오미자 유
7 서지리 방성구 오미자 유
8 대각리 정병권 오미자 무
9 대가리 윤금상 인삼 유
10 동산리 윤금상 인삼 유
11 대가리 윤금상 인삼 유
12 동산리 윤금상 인삼 유
13 동산리 윤금상 인삼 유
14 대가리 윤금상 인삼 무
15 지선리 윤금상 인삼 무
16 농암리 두릅 무
17 농암리 고유순 두릅 유
18 서지 두릅 무
19 서지 방성구 두릅 유
20 농암리 복분자 무
21 농암리 복분자 무
22 칠립 정병곤 오이 무
23 칠립 복분자 유
실시예 2. 유용 미생물 분리
상기 표 1에 기재된 토양 시료로부터 유용미생물을 분리하기 위하여, PDA(Potato Dextrose Agar), CMA(Corn Meal Agar), MEA(Malt Extract Agar), NA(Nutrient Agar), LBA(Luria-Bertani Agar) 등 5종의 배지를 토착 유용미생물의 배양 배지로 사용하였다(표 2). 균주분리를 위하여 토양시료 10g을 생리식염수(NaCl 0.85%) 90㎖에 현탁하고, 십진법 배수로 10-5까지 희석하여 PDA, CMA, MEA, NA 및 LBA 배지에 도말한 후, 해당 온도의 인큐베이터에 콜로니(colony)가 형성될 때까지 배양하였으며, 형성된 콜로니는 모양과 색깔에 따라서 분류하여, 순수분리하였다. 분류된 미생물은 임의대로 균주번호를 부여하였다.
미생물 분리 배지 및 배양 조건
분리배지 Nutrient agar, Luria-Bertani agar,
Potato Dextrose Agar, Corn Meal Agar,
Malt Extract Agar
배양조건 37oC, 1일 배양
보존배지 Nutrient agar
실시예 3. 분리 미생물의 세포외 효소분비능 분석
각각의 분리한 미생물을 LB 액체배지에 접종하고 37℃ 및 200rpm에서 24시간 배양하였다. 배양액을 원심분리(12,000rpm, 4℃ 및 30분)하여 상등액을 취하여 세포외 효소분비능을 측정하였다.
먼저, 프로테아제(protease)를 생성하는 미생물을 분리하기 위해 NB(Nutrient broth), GSS 및 PDB(potato dextrose broth)가 함유된 기초배지에 1.0% 스킴 밀크(skim milk)가 첨가된 평판 배지를 사용하였다. 선택배지에 상기 준비된 균 상등액을 접종하여 37℃에서 3일 배양 후, 클리어존(clear zone)을 형성하는 세균을 선발하였다. 다음으로, 아밀라아제(amylase)를 생산하는 미생물을 분리하기 위해 NB(Nutrient broth), GSS 및 PDB(potato dextrose broth)가 함유된 기초배지에 0.5% 가용성 전분(soluble starch)을 첨가한 평판배지를 사용하였다. 상기의 평판배지에 상기 균 상등액을 접종하여 37℃에서 3일간 배양 후 루골요오드 시약(Lugols iodine solution)으로 20분간 염색하여 클리어존(clear zone) 유무를 확인하였다. 마지막으로, 셀룰라아제(cellulase)를 생산하는 미생물을 분리하기 위해 NB(Nutrient broth), GSS 및 PDB(potato dextrose broth)가 함유된 기초배지에 0.5% CMC(carboxy methyl cellulose)를 첨가한 평판배지를 사용하였다. 셀룰라아제 생산능은 상기의 평판배지에 균 상등액을 접종하여 37℃에서 3일간 배양 후 0.1% 콩고레드 용약(congo red solution)으로 염색한 다음, 1M NaCl로 탈색하여 균체 주위에 노란색 환의 형성 유무를 확인하였다. 그 결과, 표 3에 개시된 바와 같이 세포외 효소분비능이 있는 25종의 균주를 선발하였다.
분리 미생물의 세포외 효소분비능 측정 결과
균주 번호 프로테아제 아밀라아제 셀룰라아제
SCBH1071 2.6 - 1.5
SCBH1090 2.6 - 1.6
SCBH1095 2.5 1.4 1.2
SCBH1118 2.1 2 -
SCBH1120 2 1.2 -
SCBH1241 2 1.2 1.2
SCBH1245 2.5 1.1 1.2
SCBH1250 2 - 1.2
SCBH1251 2 - 1.3
SCBH1290 2.5 1.1 -
SCBH1332 2.5 1.5 -
SCBH1382 3 1.5 1.5
SCBH1386 2.8 - 1.5
SCBH1388 3 1.2 1.6
SCBH1400 - 1.8 1.3
SCBH1409 3.1 1.8 -
SCBH1416 2.7 - 1.6
SCBH1432 2.8 1.5 -
SCHB1433 3 1.2 -
SCBH1434 3.2 1.2 -
SCBH1435 3.3 1.3 -
SCBH1436 3.3 1.6 -
SCBH1433 3.6 2 -
SCBH1438 3.5 1.5 -
SCBH1439 3.6 1.6 -
단위: cm
실시예 4. 선발된 균주들의 식물병 원인균 에 대한 항진균 활성 분석
상기 실시예 3에서 토양으로부터 분리된 미생물의 세포외 효소분비능 측정을 통해 효소생산능이 우수한 25종의 균주를 선발하여, 농촌진흥청 농업유전자정보센터로부터 분양받은 식물병 원인균 15종으로 검은별무늬병 원인균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum KCCM11419), 잎집무늬병 원인균인 펠리쿨라리아 사사키(Pellicularia sasaki 아주대학교에서 분양), 사과점무늬낙엽병 원인균인 알터나리아 말리(Alternaria mali KCCM11382), 도열병 원인균인 스클레로티니아 트리폴리움(Sclerotinia trifolium KCCM60135), 벼키다리병 원인균인 지베렐라 푸지크로이(Gibberella fujikuroi KCCM12329), 잿빛곰팡이병 원인균인 보트리오티니아 퍼켈리아나(Botryotinia fuckeliana KCCM32314), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusariium oxysporum KCCM12326), 포도탄저병 원인균인 콜레토트리쿰 글로에오스포리오데스(Colletotrichum gloeosporiodes KCCM43520), 고추탄저병 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes KACC40009 또는 KACC40010) 또는 콜레토트리쿰 데마티움(Colletotrichum dematium KACC40013), 토마토역병 원인균인 파이토프소라 캡시사이(Phytophthora capsici KACC40177), 고추균핵병 원인균인 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum KACC41065), 뿌리썩음병 원인균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)에 대하여 선발된 25종의 균주들의 항진균 활성을 조사하였다. 식물병 원인균의 배양 배지로는 PDA(Potato Dextrose agar) 배지를 사용하였으며, 배지에 배양된 식물병 원인균의 균체를 PDA배지 중앙에 디스크(disc)를 놓고 접종한 뒤, 25℃의 인큐베이터에서 3일간 배양하였다. 디스크확산법 및 페이퍼디스크법(Disc diffusion method & Paper disc method)을 이용하여 측정하였으며, 선발된 균주들이 억제환(inhibition zone)을 형성하는 것을 확인하였다. 그 결과, 표 4에 개시된 바와 같이 식물병 원인균에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타내는 9종의 분리 미생물을 선발하였으며, 이 중에 SCHB1433, SCBH1435, SCBH1437 및 SCBH1439 균주가 다양한 식물병 원인균에 대해 뛰어난 항진균 활성을 보이는 것을 확인하였다.
선발된 분리 미생물 9종의 식물병 원인균에 대한 항진균 활성 결과
식물병(원인균) 분리 균주 번호
1290 1382 1432 1433 1434 1435 1437 1438 1439
검은별무늬병
(클라도스포리움 쿠쿠메리눔 KCCM11419)		 + - - + - + + - +
잎집무늬병
(펠리쿨라리아 사사키)		 - - - + - + - - -
사과점무늬낙엽병
(알터나리아 말리 KCCM11382)		 + - - + + + + + +
도열병
(스클레로티니아 트리폴리움 KCCM60135)		 - - - + - - + - +
벼키다리병
(지베렐라 푸지크로이 KCCM12329)		 - - - - - - - - +
잿빛곰팡이병
(보트리오티니아 퍼켈리아나 KCCM32314)		 - - + + - + + + +
시들음병
(푸사리움 옥시스포룸 KCCM12326)		 - - - + - - - - +
포도탄저병
(콜레토트리쿰 글로리어스포리오더스 KCCM43520) 		+ + - - - + + + +
고추탄저병
(콜레토트리쿰 코코데스 KACC40009)		 - + - + - + + - -
고추탄저병
(콜레토트리쿰 코코데스 KACC40010)		 - + + + - - + - +
토마토역병
(파이토프소라 캡시사이 KACC40177)		 - - - - - - - - -
고추균핵병
(스클레로티니아 스클레로티오룸 KACC41065)		 - - - - - - - - +
고추탄저병
(콜레토트리쿰 데마티움 KACC40013)		 - - - - - - + - +
뿌리썩음병
(푸사리움 솔라니 KACC40384)		 - - - + - + + - +
뿌리썩음병
(실린드로카폰 데스트럭탄스 KACC41077)		 - - - + + - + + +
+ : 양성 반응
- : 음성 반응
실시예 5. 선발된 균주들의 사이드로포어(siderophore) 생산능 분석
상기 실시예 3에서 선발된 25종의 분리 미생물을 대상으로 사이드로포어(siderophore) 생산능을 확인하였다. 사이드로포어는 식물의 근권에서 철 이온(Fe3+)을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균의 철이온 흡수를 방해함으로써 식물병원성 진균의 생육을 억제시키는 일종의 항생물질로서, 식물병원균을 억제할 뿐만 아니라 식물생장촉진 효과도 있다. 따라서, CAS(chrome azurol S)가 함유된 CAS 블루 아가에 각 균주들을 이쑤시개로 피킹(picking)하여 30℃에서 4일간 배양 후 배지색이 푸른색에서 오렌지색(orange halo zone)으로 변하는 균주를 선별하였다. 그 결과, 하기 표 5에 개시된 바와 같이 선발된 25종의 분리 미생물 중 SCHB1433 균주가 사이드로포어를 생산하는 것을 확인하였다.
선발된 25종의 분리 미생물의 사이드로포어 생산능 측정 결과
균주 번호 사이드로포어 생산능
SCBH1071 -
SCBH1090 -
SCBH1095 -
SCBH1118 -
SCBH1120 -
SCBH1241 -
SCBH1245 -
SCBH1250 -
SCBH1251 -
SCBH1290 -
SCBH1332 -
SCBH1382 -
SCBH1386 -
SCBH1388 -
SCBH1400 -
SCBH1409 -
SCBH1416 -
SCBH1432 -
SCHB1433 +
SCBH1434 -
SCBH1435 -
SCBH1436 -
SCBH1433 -
SCBH1438 -
SCBH1439 -
+ : 양성 반응
- : 음성 반응
실시예 6. 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주의 동정
(1) 16S rDNA 염기서열 분석
상기 실시예 1 내지 5의 결과를 토대로 사이드로포어를 생산하고, 세포외 효소인 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease)를 분비하며, 식물병 원인균에 대해 뛰어난 항진균 활성을 가지는 SCHB1433 균주를 동정하기 위하여, 게놈 DNA purification kit(Promega사, Madison, Wl)를 이용하여 SCHB1433 균주의 DNA를 분리한 후, 하기 표 6에 개시된 유니버설 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel 및 clean-up system(Promega사, Madison, Wl)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물의 염기서열 분석은 솔젠트 및 코스모 진텍에 의뢰하였다. 그 결과, SCHB1433 균주의 16s rDNA 염기서열은 GenBank의 ribosomal DNA sequence Date base를 통하여 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)로 동정되었으며, 상기 균주를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주로 명명하였다.
본 발명에 사용된 프라이머
프라이머 이름 염기서열
정방향(서열번호) 역방향(서열번호)
27F AGAGTTTGATCATGGCTCAG(서열번호 1) -
1492R - GGATACCTTGTTACGACTT(서열번호 2)
농업생명공학연구원 KACC81009BP 20150728
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus subtilis SCHB1433 strain having siderophore production activity, enzyme secretion activity and antifungal activity against plant pathogen and uses thereof <130> PN15218 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggataccttg ttacgactt 19

Claims (4)

  1. 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 세포 외 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease) 분비능이 있으며, 검은별무늬병 원인균인 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum), 잎집무늬병 원인균인 펠리쿨라리아 사사키(Pellicularia sasaki), 사과점무늬낙엽병 원인균인 알터나리아 말리(Alternaria mali), 도열병 원인균인 스클레로티니아 트리폴리움(Sclerotinia trifolium), 잿빛곰팡이병 원인균인 보트리오티니아 퍼켈리아나(Botryotinia fuckeliana), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusariium oxysporum), 고추탄저병 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 및 뿌리썩음병 원인균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주(KACC81009BP).
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)에 의한 검은별무늬병, 펠리쿨라리아 사사키(Pellicularia sasaki)에 의한 잎집무늬병, 알터나리아 말리(Alternaria mali)에 의한 사과점무늬낙엽병, 스클레로티니아 트리폴리움(Sclerotinia trifolium)에 의한 도열병, 보트리오티니아 퍼켈리아나(Botryotinia fuckeliana)에 의한 잿빛곰팡이병, 푸사리움 옥시스포룸(Fusariium oxysporum)에 의한 시들음병, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 의한 고추탄저병 또는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)에 의한 뿌리썩음병 방제용 미생물 제제.
  4. 제1항에 따른 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCHB1433 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 클라도스포리움 쿠쿠메리눔(Cladosporium cucumerinum)에 의한 검은별무늬병, 펠리쿨라리아 사사키(Pellicularia sasaki)에 의한 잎집무늬병, 알터나리아 말리(Alternaria mali)에 의한 사과점무늬낙엽병, 스클레로티니아 트리폴리움(Sclerotinia trifolium)에 의한 도열병, 보트리오티니아 퍼켈리아나(Botryotinia fuckeliana)에 의한 잿빛곰팡이병, 푸사리움 옥시스포룸(Fusariium oxysporum)에 의한 시들음병, 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)에 의한 고추탄저병 또는 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)에 의한 뿌리썩음병을 방제하는 방법.
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