KR102161296B1

KR102161296B1 - 옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스 srcm103571 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102161296B1
Application number: KR1020190080491A
Authority: KR
Inventors: 하광수; 양호연; 허주희; 신수진; 임수아; 정성엽; 정도연
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2020-09-29

Abstract

본 발명은 옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주는 친환경적이면서 화학농약 또는 화학비료의 사용을 대체할 수 있는 새로운 바이오 작물보호제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SRCM103571 strain producing auxin and siderophore and having antifungal activity against plant pathogen, phosphate solublizing ability and nitrogen fixing ability and uses thereof}

본 발명은 옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

현대 농업은 작물을 병으로부터 보호하기 위해 유기합성의 농약 사용에 의존하고 있는데, 이러한 화학농약을 사용하여 이루어진 농업은 환경오염, 맹독성, 약제 저항성을 가진 병원균의 출현, 토양 및 농산물 내 농약 잔류 등 인간 및 환경에 대해 많은 부작용을 유발하고 있다. 이러한 농약 부작용의 우려 속에, 최근 환경보호에 대한 인식 및 안전한 농산물에 대한 인식이 높아지면서 친환경적인 농업재배방식을 선호하는 경향이 더욱 증가하고 있다. 세계적으로 생물농약의 시장은 도입단계를 지나 성장 초기 단계로서 친환경 정책 및 안전한 농산물에 대한 관심이 증가함에 따라 폭발적으로 시장이 성장하리라 기대되고 있다. 또한, 21세기에 들어오면서 우리나라를 포함한 OECD 국가에서는 환경오염 및 잔류농약 등 부작용때문에 화학농약과 화학비료 사용을 줄이는 친환경 농업정책을 적극 추진하고 있다. 따라서, 우리나라에서도 생물농약은 농산물에 대한 잔류독성의 염려가 없고, 농업생태계를 교란하지 않는다는 장점이 알려지면서 미생물 제제를 이용한 생물학적 방제법에 대한 관심이 높아지고 있다. 국내에서 생물농약에 대한 연구는 1980년을 기점으로 1987년 인삼 뿌리썩음병 방제용 바이코나의 개발로 시작되어 현재까지 한국화학연구원, 한국생명공학연구원, 농업과학기술원 등의 연구소와 전국의 대학교 그리고 기업체에서 새롭고 인간과 환경에 안전한 미생물 농약을 개발하고자 노력하고 있다. 그러나 친환경 농산물 생산을 위해서는 합성 농약을 대신할 수 있는, 효과가 우수한 미생물 농약이 필요하며, 또한 실험실의 제한된 조건에서 선발된 길항 능력이 있는 미생물은 실제 포장에서는 정착하여 생존하지 못하고, 실험실의 제한된 조건에서만 길항 세균을 선발하기 때문에 길항효과를 발휘하지 못하는 경우가 매우 많다. 또한 국내 연구기관들이 선진 외국처럼 세균, 진균 등을 사용하여 식물병 방제를 위한 길항미생물 탐색 및 실용화 연구를 하고 있으나 여전히 기초단계의 연구를 수행하고 있으며, 작물재배에서 길항미생물을 이용한 식물병 방제에 대한 연구는 대학교, 농업관련 국가연구소, 정부출연연구소 등을 중심으로 추진되고 있으나, 아직 국내 연구 인력 및 기술 축적이 외국만큼 충분하지 않고 국내 재배여건에 적용되어 작물생산에 효과 있는 농업용 생물농약의 사용 및 실용화는 미미한 실정이다.

현재 친환경 농업생산을 위하여 쌀겨, 음식물, 게껍질 등의 부산물뿐만 아니라 미생물 등을 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 작물에서의 병 방제 능력이 뛰어나고 작물생육촉진, 토양개량효과 등에 탁월한 길항미생물을 이용한 농법이 널리 확산되고 있다. 주로 사용되는 토양미생물은 바실러스 속(Bacillus sp), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp), 뿌리혹박테리아 속(Rhizobium sp) 등이 있다.

한편, 한국등록특허 제1956760호에는 '항균활성, 항산화활성, 세포외 효소 분비능 및 페놀 생성능이 있고, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 서틸리스 SRCM102754 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1475260호에는 '억새의 근권 토양으로부터 분리한 식물 생장을 촉진하는 바실러스 서브틸리스 JS 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 옥신 및 사이드로포어를 생산하고, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 대해 항진균 활성이 있으며, 8종의 효소 분비능, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주(KCCM12544P)를 분리하였다. 본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주는 상기와 같은 특징을 가지므로, 인체에 무해한 미생물 농약 및 미생물 비료로 사용가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 옥신(auxin) 및 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는, 기탁번호가 KCCM12544P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제 또는 식물생장 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물병 방제 또는 식물생장 촉진용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 또는 식물생장 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주는 옥신 및 사이드로포어를 생산하고 다양한 분해효소를 분비할 수 있으며, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 대해 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 인산가용화능 및 질소고정능이 있으므로, 친환경적이면서 화학농약 또는 화학비료의 사용을 대체할 수 있는 새로운 바이오 작물보호제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주의 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 대한 항진균 활성을 나타낸 것이다. 각 플레이트에서 왼쪽 hole은 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주를 접종한 것이고 오른쪽 hole은 상기 푸사리움 옥시스포룸 KCCM11554 및 푸사리움 모니리포르메 KCCM21196을 접종한 것이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주의 옥신 생성능을 나타낸 것이다. SRCM103571는 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주를 의미하고, SRCM103508, SRCM103622, SRCM103629 및 SRCM103637은 각각 바실러스 서틸리스 SRCM103508, SRCM103622, SRCM103629 및 SRCM103637 균주를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 옥신(auxin) 및 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는, 기탁번호가 KCCM12544P인 바실러스 서틸리(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주를 제공한다.

본 발명에서는 전통 장류로부터 바실러스 균주를 분리하였고, 그 중 옥신(auxin) 및 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 분리·동정하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주로 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년 06월 04일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM12544P).

본 발명의 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주에 있어서, 상기 분비 가능한 효소는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 리파아제(lipase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)이다.

또한, 본 발명의 균주가 항진균 활성을 보이는 상기 식물병 원인균은 푸사리움 속(Fusarium sp.) 병원균일 수 있고, 바람직하게는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 식물병 방제용 조성물은 미생물 농약의 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 식물병은 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 의해 발병하는 시들음병 또는 덩굴쪼김병; 또는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 의해 발병하는 이삭썩음병 또는 이삭마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식물생장 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 식물생장 촉진용 조성물은 미생물 비료의 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물생장 촉진용 조성물에서, 식물생장 촉진은 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주의 옥신 생산능, 인산가용화능 또는 질소고정능으로 인한 효과일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물 또는 식물생장 촉진용 조성물은 예를 들어, 직접 분사 가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물 또는 식물생장 촉진용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할수도 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물 또는 식물생장 촉진용 조성물은 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물병 방제 방법에서, 상기 식물병은 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 의해 발병하는 시들음병 또는 덩굴쪼김병; 또는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 의해 발병하는 이삭썩음병 또는 이삭마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 식물생장 촉진용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물생장 촉진 방법을 제공한다.

상기 식물병 방제 방법 또는 식물생장 촉진 방법으로는 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물의 유효량을 이용한 조성물을 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 상기 SRCM103571 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물의 유효량을 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 조성물에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물 또는 식물생장 촉진용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 바실러스 서틸리스 SRCM103571 균주의 배양 방법 및 식물병 방제용 조성물 또는 식물생장 촉진용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

균주 분리 및 배양

바실러스 균주를 분리하기 위해 전통방식으로 제조된 전통 장류 1g을 멸균생리 식염수 9㎖에 잘 혼합하여 각 단계별로 희석한 후, 희석액 100㎕를 LB 아가 배지(Luria-Bertani agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하였으며, 30℃에서 18시간 배양한 후, 형성된 집락의 형태 차이를 이용하여 균주를 1차적으로 선별한 후 다시 순수 배양하여 균주를 분리하였다. 순수 분리한 바실러스 균주는 10% 스킴 밀크(BD Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 현탁하고 -80℃에 보관하여 사용하였다.

세포 외 효소활성 분석

토양에 존재하는 유기물 분해는 미생물에 의해 주도적으로 진행되며, 분해효율은 미생물의 종류에 따라 다르게 나타난다. 따라서 유기물 분해효율, 즉 퇴비화를 촉진시키기 위해서는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase) 등의 효소분비를 하는 미생물을 사용하는 방법이 효과적이므로 선별 균주의 세포 외 효소활성을 분석하였다. 선별 균주의 세포 외 효소 분비능 측정을 위해 각 효소와 특이적으로 반응하는 기질의 성분이 포함된 고체 배지를 이용한 한천 확산법(agar well diffusion method)을 사용하였다. 아밀라아제 활성은 가용성 전분(soluble starch)을 기질로 선택하여 1% 가용성 전분 및 2% 아가를 첨가한 전분 아가 배지를 제조하여 사용하였으며, 프로테아제 활성을 측정하기 위해 스킴 밀크를 기질로 선택하여 2% 스킴 밀크에 1.5% 아가를 첨가하여 스킴 밀크 아가 배지를 제조하여 사용하였다. 셀룰라아제 활성은 CMC(carboxylmethyl cellulose)를 기질로 선택하여 1% CMC에 1.5% 아가를 첨가하여 CMC 아가 배지를 제조하여 사용하였으며, 아밀라아제 활성 측정을 위해 루골 시약(Lugol solution)을 사용한 염색법을, 셀룰라아제 활성 측정을 위해서는 0.1% 콩고 레드 시약(Congo red solution)을 사용한 염색법을 사용하였다.

선별 균주의 동정 및 계통수 작성

선별 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 서열 증폭을 위해 유니버설 프라이머인 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3', 서열번호 1)와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3', 서열번호 2)을 사용하였으며, NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 서열의 일치도가 높은 표준균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻었다. 서열간의 상호 비교를 위해 Clustal W 2.0 progam을 사용하였으며, Mega 7.0.26 program을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석에는 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 1,000회 반복을 통해 bootstrapping하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.

API ZYM 키트를 이용한 선별 균주의 효소활성 분석

선별 균주의 효소 생성 여부를 조사하기 위해 총 19종의 각종 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM 키트(BioMeriux Co., France)를 사용하였다. 선별 균주를 LB 고체 배지에서 배양한 후 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁해 Macfarland로 탁도 5~6으로 조정하였다. API ZYM 키트의 각 튜브에 현탁액을 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후 ZYM-A 및 ZYM-B 시약을 각 튜브에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하였다. 색의 변화 정도에 따라 0~5까지 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5 nanomoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.

API 50 CH 키트를 이용한 선별 균주의 당 이용성 분석

선별 균주의 당 이용성을 확인하기 위하여 총 48종의 탄수화물 이용성을 기초로 제작된 API 50 CH 키트(BioMerieux, France)를 사용하였다. 선별 균주를 5㎖의 LB 액체 배지에 계대배양하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양액 1㎖을 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포 펠렛만 회수하여 PBS(phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척한 뒤 실험에 사용하였다. McFarland(BioMerieux)로 탁도 2로 조정하여 현탁액을 제조하였고, API 50 CHB/E 배지에 현탁한 균주 배양액 1㎖을 첨가 후 혼합하여 API 50 CH 스트립에 120㎕씩 분주하고 37℃ 배양기에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 각각의 당 발효패턴을 비교하였다. 당 발효 패턴은 튜브의 색 변화를 확인하여 양성 및 음성으로 판독하였다.

선별 균주의 식물병원성 진균에 대한 항진균 활성 측정

선별 균주의 항진균 활성 측정에 사용된 지시균주는 시들음병 및 덩굴쪼김병의 원인균으로 알려져 있는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)과 이삭썩음병 및 이삭마름병을 일으키는 것으로 알려져 있는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)를 한국미생물종균협회(KCCM, Korean culture center of microorganisms)에서 분양 받아 사용하였다. 선별 균주의 항진균 활성은 균주의 배양상등액을 상기 식물병원성 진균에 대치하여 저해 정도를 측정하였다. PDA 배지 플레이트에 각 지시균을 치상한 후 5cm 떨어진 지점에 8mm hole을 제작하여 LB 액체배지에서 24시간 동안 배양한 각 선별 균주의 배양 상등액 100㎕을 접종하였다. 30℃에서 24-96시간 배양 후 형성된 억제환의 직경을 측정하여 항진균 활성을 평가하였다.

식물생장 촉진인자 옥신 생성능 측정

선별 균주를 대상으로 식물생장호르몬인 옥신(auxin) 계열 중 대표적인 IAA(indole-3-acetic acid) 생성능을 측정하기 위한 방법으로 살코프스키 테스트(Salkowski test)를 이용하였다. IAA의 전구물질인 0.1% L-트립토판(L-tryptophan)을 첨가한 R2A(Reasoner's 2A) 액체배지에 분리 균주를 접종하여 37℃, 150 rpm에서 24시간 동안 진탕배양한 후 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 100㎕의 선별 균주의 배양 상등액과 200㎕의 살코프스키 시약(5% perchloric acid 100㎖ 및 0.05M ferric chloride 2㎖)을 96 웰 플레이트상에서 혼합하여 상온에서 18시간 동안 암반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 535nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시험구의 흡광도 값을 IAA 표준곡선에 대입하여 옥신 생성능을 측정하였다.

선별 균주의 인산가용화 측정

식물이 쉽게 이용할 수 있는 형태의 무기질 인산비료를 토양에 사용하지만 인산이 토양에 잘 고정되는 특성으로 인하여 작물을 재배할 때마다 인산질비료를 계속 시용하게 된다. 인산질비료는 다른 비료에 비하여 고가에 생산, 판매되고 있는 실정을 감안하면 농경지에 다량축적된 난용성 인산염을 효율적으로 이용하는 방법이 절실히 요구되고 있다. 이를 위하여 토양에 고정된 난용성 인산염을 우수한 효율로 가용화할 수 있는 균주의 선발이 요구되고 있다. 따라서 선별 균주의 인산가용화능을 측정하기 위해 몰리브덴산 암모늄(ammonium molybdate)을 이용한 인산염 분석(phosphate assay)을 실시하였다. 선별 균주를 난용성 인산으로 인산칼슘(calcium phosphate)이 포함된 PVK(Pikovskaya's) 액체배지 5㎖에 접종하여 150 rpm, 37℃에서 24시간 배양한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 1.2N HCl 용액 100㎖에 몰리브덴산 암모늄 0.5g과 아스코르브산(ascorbic acid) 2g을 각각 첨가하여 시약 C를 제조한 후, 150㎕의 시약 C와 150㎕의 균주 배양 상등액을 96 웰 플레이트에 혼합하고 37℃에서 90분간 반응 후 820nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시험구의 흡광도 값을 K₂HPO₄ 표준곡선에 대입하여 인산가용능을 측정하였다.

선별 균주의 질소고정능 측정

생물학적 질소 고정(Biological Nitrogen Fixation, BNF)은 양분공급, 특히 질소의 공급으로 수확량이 최적으로 유지되는 것을 도울 수 있다. 질소고정능이 있는 세균은 식물이 이용할 수 있는 암모니아로 대기 중의 N₂를 전환하는 능력이 있어 C는 충분하지만 N이 부족한 환경에서 식물 생장을 촉진시키는 능력이 있다. 따라서 선별 균주의 질소고정능을 분석하기 위해 Nfb 한천 배지(nitrogen free semi-solid media)를 제조하였으며, 배양한 균주를 배지 안쪽에 접종하여 산소를 차단한 상태로 14일간 배양하면서 변색여부를 관찰하였다. 배지의 색깔이 파란색으로 변할 경우 양성으로 판단하며, 변색 정도에 따라 -(색변화 없음), +(연한 파란색), ++(파란색) 및 +++(진한 파란색)로 구분하였으며 Nfb 배지의 성분은 하기 표 1에 개시한 바와 같다.

Nfb 배지 성분

성분	함량(g/L)
Malic acid	5
K₂HPO₄	0.6
KH₂PO₄	0.4
MnSO₄	0.01
MgSO₄	0.05
NaCl	0.02
Na₂MoO₄	0.4
Bromothymol blue(0.5% in EtOH)	2㎖
Agar	1.75

사이드로포어 생성능 분석

사이드로포어(Siderophore)는 식물의 근권에서 철 이온(Fe³⁺)을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균의 철이온 흡수를 방해함으로써 식물병원성 진균의 생육을 억제시키는 일종의 항생물질로서, 식물병원균을 억제할 뿐만 아니라 식물생장촉진 효과도 있다. 따라서 선별 균주의 사이드로포어 생성능을 분석하기 위해 블루 아가(blue agar)를 이용한 CAS 분석법으로 확인하였다. Brian C Louden 등의 방법(Brian C Louden et al., 2011, JOURNAL OF MICROBIOLOGY & BIOLOGY EDUCATION, Vol.12, No.1, 51-53)에 따라 블루 아가 배지를 제작하였으며, 블루 아가에 8mm의 hole을 형성한 후 선별 균주의 배양 상등액을 접종하여 37℃의 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 배양 후 hole 주변에 형성된 오렌지색의 halo zone 직경을 측정하여 사이드로포어 생성능을 확인하였다.

실시예 1. 생물학적 방제제로서의 활성이 우수한 균주 선발

전통 장류로부터 총 30종의 바실러스 속 균주를 분리하였으며, 이 중 효소분비활성, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 옥신생성능, 인산가용화능, 질소고정능 및 사이드로포어 생성능이 우수한 SRCM103571 균주를 선별하였으며, 선별된 SRCM103571 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 3, 도 1)을 분석하였으며, 결과를 바탕으로 NCBI BLAST 검색 결과, SRCM103571 균주는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)와 99%의 상동성을 나타내었으며, 표준 균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 바실러스 서틸리스 JCM, NBRC13719 및 DSM10과 가장 가까운 근연관계로 확인되었다(도 2). 최종적으로, 선별된 균주를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571로 명명하였고, 2019년 06월 04일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12544P를 부여받았다.

실시예 2. SRCM103571 균주의 특성 분석

최종 선별한 SRCM103571 균주의 세포 외 효소활성을 확인하였다. 그 결과, 아밀라아제, 프로테아제 및 셀룰라아제 활성이 모두 우수하였으며(표 2), API ZYM 키트를 이용하여 다양한 세포 외 효소활성을 확인하였을 때, 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 리파아제(lipase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase) 활성이 있음을 확인하였다(표 3).

최종 선별한 SRCM103571 균주가 시들음병 및 덩굴쪼김병의 원인균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) KCCM11554와 이삭썩음병 및 이삭마름병의 원인균인 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme) KCCM21196에 대해 우수한 항진균 활성을 나타내었으며(표 4 및 도 3), 인산가용화능 및 질소고정능이 있으며(표 5 및 표 6), 옥신 및 사이드로포어를 생산하는 것을 확인하였다(도 4 및 표 7).

또한, API 50 CH 키트를 사용하여 SRCM103571 균주의 당 이용성을 확인한 결과, 에리스리톨(Erythritol, ERY), L-아라비노오스(L-Arabinose, LARA), 리보오스(Ribose, RIB), 글루코오스(Glucose, GLU), D-만노오스(D-mannose, MNE), 이노시톨(Inositol, INO), 만니톨(Mannitol, MAN), 솔비톨(Sorbitol, SOR), 메틸-D-글루코오스(Methyl-D-glucose, MDG), 에스쿨린(Esculine, ESC), 셀룰비오스(Cellobiose, CEL), 말토오스(Malotose, MAL), 락토오스(Lactose, LAC), 트레할로오스(Trehalose, TRE) 및 D-라피노오스(D-raffinose, RAF)를 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다(표 8).

바실러스 균주의 세포 외 효소활성 확인

바실러스 균주명	세포 외 효소활성(mm)
바실러스 균주명	amylase	protease	cellulase
*Bacillus subtilis* SRCM103571	20	21	24
Bacillus subtilis SRCM103508	20	18	17
Bacillus subtilis SRCM103622	16	20	22
Bacillus subtilis SRCM103629	18	21	14
Bacillus subtilis SRCM103637	17	21	21

SRCM103571 균주의 API ZYM 키트를 이용한 효소활성 확인

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
-	-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	+	+	-	-	-

1: alkaline phosphatase, 2: esterase(C4), 3: esterase lipase(C8), 4: lipase(C14), 5: leucine arylamidase, 6: valine arylamidase, 7: cystine arylamidase, 8: trypsin, 9: α-chymotrypsin, 10: acid phosphatase, 11: naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, 12: α-galactosidase, 13: β-galactosidase, 14: β-glucuronidase, 15: α-glucosidase, 16: β-glucosidase, 17: N-acetyl-β-glucosaminidase, 18: α-nabbisudase, 19: α-fucosidase, 20: control, -: 음성 반응, +: 양성 반응.

SRCM103571 균주의 식물병 원인균에 대한 항진균 활성 확인

바실러스 균주명	항진균 활성(mm)
바실러스 균주명	F. oxysporum KCCM11554	F. moniliforme KCCM21196
*Bacillus subtilis* SRCM103571	8	12
Bacillus subtilis SRCM103508	ND	ND
Bacillus subtilis SRCM103622	ND	ND
Bacillus subtilis SRCM103629	ND	ND
Bacillus subtilis SRCM103637	ND	ND

ND: 미검출.

SRCM103571 균주의 인산가용화능 확인

바실러스 균주명	인산가용화능(mg/L)
*Bacillus subtilis* SRCM103571	143.40±11.35
Bacillus subtilis SRCM103508	104.49±25.46
Bacillus subtilis SRCM103622	131.14±4.76
Bacillus subtilis SRCM103629	123.93±24.20
Bacillus subtilis SRCM103637	65.92±3.58

SRCM103571 균주의 질소고정능 확인

바실러스 균주명	질소고정능
*Bacillus subtilis* SRCM103571	++
Bacillus subtilis SRCM103508	++
Bacillus subtilis SRCM103622	++
Bacillus subtilis SRCM103629	++
Bacillus subtilis SRCM103637	++

SRCM103571 균주의 사이드로포어 생성능 확인

바실러스 균주명	사이드로포어 생성능(halo zone, mm)
*Bacillus velezensis* SRCM103702	12
Bacillus subtilis SRCM103508	11
Bacillus subtilis SRCM103622	12
Bacillus subtilis SRCM103629	12
Bacillus subtilis SRCM103637	ND

SRCM103571 균주의 API 50 CH 키트를 이용한 당 이용성 확인

No.	당	반응	No.	당	반응
0	control	-	25	ESC	+
1	GLY	-	26	SAL	-
2	ERY	+	27	CEL	+
3	DARA	-	28	MAL	+
4	LARA	+	29	LAC	+
5	RIB	+	30	MEL	-
6	DXYL	-	31	SAC	-
7	LXYL	-	32	TRE	+
8	ADO	-	33	INU	-
9	MDX	-	34	MLZ	-
10	GAL	-	35	RAF	+
11	GLU	+	36	AMD	-
12	FRU	-	37	GLYG	-
13	MNE	+	38	XLT	-
14	SBE	-	39	GEN	-
15	RHA	-	40	TUR	-
16	DUL	-	41	LYX	-
17	INO	+	42	TAG	-
18	MAN	+	43	DFUC	-
19	SOR	+	44	LFUC	-
20	MDM	-	45	DARL	-
21	MDG	+	46	LARL	-
22	NAG	-	47	GNT	-
23	AMY	-	48	2KG	-
24	ARB	-	49	5KG	-

GLY: Glycerol; Ery: Erythritol; DARA: D-Arabinose; LARA: L-Arabinose; RIB: Ribose; DXYL: D-Xylose; LXYL: L-Xylose; ADO: Adonithol; MDX: Methyl xyloside; GAL: Galactose; GLU: Glucose; FRU: D-Fructose; MNE: D-Mannose; SBE: Sorbose; RHA: Rhamnose; DUL: Dulcitol; INO: Inositol; MAN: Mannitol; SOR: Sorbitol; MDM: Methyl-D-mannoside; MDG: Methyl-D-glucose; NAG: N-acetyl-glucosamine; AMY: Amygdalin; ARB: Arbutin; ESC: Esculine; SAL: Salicin; CEL: Cellobiose; MAL: Malotose; LAC: Lactose; MEL: Melibiose; SAC: Sucrose; TRE: Trehalose; INU: Inulin; MLZ: Melizitose; RAF: D-raffinose; AMD: Starch; GLYG: Glycogen,; XLT: Xylitol; GEN: Gentibiose; TUR: Turanose; LYX: Lyxose; TAG: Tagatose; DFUC: D-Fucose; LFUC: L-Fucose; DARL: D-Arabitol; LARAL: L-arabitol; GNT: Gluconate; 2KG: 2, Keto-gluconate; 5KG: 5, Keto-gluconate, -: 음성 반응, +: 양성 반응.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12544P

20190604

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Bacillus subtilis SRCM103571 strain producing auxin and siderophore and having antifungal activity against plant pathogen, phosphate solublizing ability and nitrogen fixing ability and uses thereof <130> PN19210 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1437 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 ctagagaacg cggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct 60 ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga 120 taactccggg aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata 180 aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg 240 taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg 300 actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 360 aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt 420 gttagggaag aacaagtacc gttcaaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa 480 gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga 540 attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaggtc tgatgtgaaa gcccccggct 600 caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaggaggaa agtggaattc 660 cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc 720 tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg 780 gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg 840 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca 1020 gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080 gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact 1140 gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca 1260 atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtggaatac gtttcccggg gccttgtaca 1380 caccgcccgg tcacaccacg aagagtttgt aacaccccaa agtcggtgaa ggtaacc 1437 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

옥신(auxin) 및 사이드로포어(siderophore)를 생산하고, 효소 분비능이 있으며, 식물병 원인균에 대한 항진균 활성, 인산가용화능 및 질소고정능을 가지는, 기탁번호가 KCCM12544P인 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM103571 균주로서,
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase), 에스터라아제 리파아제(esterase lipase), 리파아제(lipase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-글루코시다아제(β-glucosidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-acetyl-β-glucosaminidase)이며, 상기 식물병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)인 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 의해 발병하는 시들음병 또는 덩굴쪼김병; 또는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 의해 발병하는 이삭썩음병 또는 이삭마름병 방제용 조성물.
삭제
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식물생장 촉진용 조성물.
제3항의 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 의해 발병하는 시들음병 또는 덩굴쪼김병; 또는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme)에 의해 발병하는 이삭썩음병 또는 이삭마름병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 푸사리움 옥시스포룸에 의해 발병하는 시들음병 또는 덩굴쪼김병; 또는 푸사리움 모니리포르메에 의해 발병하는 이삭썩음병 또는 이삭마름병 방제 방법.
제5항의 식물생장 촉진용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물생장 촉진 방법.