CN112048457B - 一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用 - Google Patents

一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309及其在防治油菜菌核病中的应用，所述菌株已于2020年07月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020334。本发明所述菌株的发酵上清液的制备工艺简单，抑真菌谱广，生防效果好。在油菜菌核病（核盘菌）的田间防治试验中显示出较好地生物防治效果，防效可以达到58%以上。

Description

一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309及其在制备防治油菜菌核病发酵上清液中的应用。
背景技术
农业生产是人类赖以生存的基础，而全世界每年农林业因病虫草危害造成的损失占总产值的37%，每年的经济损失高达1260亿美元。虽然化学农药在防治农作物病害方面起到了一定的作用，但其也带来了许多严重危害，如引起抗药性，污染自然环境，以及增加了农副产品中农药残留，直接危害了人类的健康和生态环境等。因此，开发对人类和环境友好、防治效果优良的植物病害防治新策略尤为重要。生物防治是利用微生物或其活性产物来防治农作物病虫害，具有安全高和防治效果好的优点，已经成为当前控制农作物病虫害的重要途径，其中活性微生物筛选是不可或缺的关键环节。
海洋蕴藏着地球上80%以上的生物资源，这些生物生存在低温、高压、高盐以及局部无光照的生命极限环境中。如此的极端环境使得海洋生物在繁殖、发育、生长及代谢等方面都具有不同于陆地生物的显著特征，其代谢产物与陆地生物的代谢产物相比，在组成、结构及生物学活性等方面可能表现出不同的特性。因此，海洋生物已经成为当前研制开发安全、高效新型生物农药的重要来源。
芽孢杆菌（Bacillus sp.）是一群产芽孢的革兰氏阳性杆菌的总称，其种类繁多，在自然界中广泛存在。由于芽孢杆菌具有抗逆性强、繁殖速度快、营养要求简单等特点，使其在植物病害生物防治中被广泛的研究和利用。目前已报道的生防芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌（B. subtils）、多粘芽孢杆菌（B. polymyxa）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、短小芽孢杆菌（B. pumilis）、凝结芽孢杆菌（B. coagulans）、淀粉芽孢杆菌（B. amyloquefaciens）、环状芽孢杆菌（B. circulans）和地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309。
本发明的目的之二在于提供一种芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309在制备防治油菜菌核病发酵上清液中的应用。
所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309分离自中国第31次大洋科学考察所采集的深海沉积物样品（119º28′E，22º11′N）；该菌已于2020年07月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2020334。
所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）具有100%的序列相似性。
所述防治油菜菌核病发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309在含有5mL LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500mLLB培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后离心除去菌体，得到防治油菜菌核病发酵上清液。
所述LB培养基的组成为：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，121℃高灭压菌20 min。
所述离心除去菌体是在10,000 r/min 下离心15- 20min。
所述活化培养的时间为12-24h。
所述发酵培养的温度为28-30℃，发酵培养的时间为48-60h，发酵培养的摇床转速为180-220 r/min。
所述油菜菌核病致病真菌为核盘菌。
所述防治油菜菌核病发酵上清液的使用方法如下：将防治油菜菌核病发酵上清液直接或稀释后喷洒在植物上。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
发酵上清液的制备工艺简单，抑制真菌谱广，生防效果好。在油菜菌核病（核盘菌）的田间防治试验中显示出较好地生物防治效果，防效可达58%以上。
附图说明
图1为芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309的菌落形态。
图2为芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。其中：A：立枯丝核菌；B：镰刀菌；C：宛氏拟青霉；D：核盘菌；E：胶孢炭疽菌；F：绿色木霉；G：葡萄座腔；H：梨炭疽；I：桃拟茎点；J：梨黑斑。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309的分离筛选
本发明涉及芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309分离自中国第31次大洋科学考察所采集的深海沉积物样品。先将沉积物样品用无菌海水梯度稀释至10-10，分别取100μL的10-1-10-10的稀释液均匀涂布在LB平板上，每个梯度做三个平行重复，并放置在28℃培养箱中培养48h。根据菌落的形态、颜色等特征，挑取单菌落划线于LB培养板，经过3轮重复划线，直至每株得到纯培养，即完成菌株的分离纯化。
获得菌株在LB培养基上生长，28℃培养24 h后，菌体不透明呈白色，边缘光滑（图1）。
实施例2：芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309的菌种鉴定
利用16S rDNA通用引物27F和1492R（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAT；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）对深海沉积物来源菌株31309 16S rDNA序列进行扩增。以31309菌株基因组DNA为PCR扩增模板，在PCR 扩增仪上进行PCR反应。反应条件为：94 ℃ 变性1min；55℃退火1 min；72℃延伸1.5 min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌株16S rDNA 序列。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心GenBank中核酸数据进行比对分析（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）。结果显示，31390菌株的16S rDNA 序列与Bacillus siamensis（MN865945.1）、Bacillus velezensis（MK310268.1）及Bacillus sp.（MK880428.1）等菌株的序列相似性为99％，即芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309与芽孢杆菌同源，因此，将其命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309。
所述芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309的16S rDNA部分序列如下：
1 TCGGCGGCTG GCTCCTAAAG GTTACCTCAC CGACTTCGGG TGTTACAAAC
51 TCTCGTGGTG TGACGGGCGG TGTGTACAAG GCCCGGGAAC GTATTCACCG
101 CGGCATGCTG ATCCGCGATT ACTAGCGATT CCAGCTTCAC GCAGTCGAGT
151 TGCAGACTGC GATCCGAACT GAGAACAGAT TTGTGGGATT GGCTTAACCT
201 CGCGGTTTCG CTGCCCTTTG TTCTGTCCAT TGTAGCACGT GTGTAGCCCA
251 GGTCATAAGG GGCATGATGA TTTGACGTCA TCCCCACCTT CCTCCGGTTT
301 GTCACCGGCA GTCACCTTAG AGTGCCCAAC TGAATGCTGG CAACTAAGAT
351 CAAGGGTTGC GCTCGTTGCG GGACTTAACC CAACATCTCA CGACACGAGC
401 TGACGACAAC CATGCACCAC CTGTCACTCT GCCCCCGAAG GGGACGTCCT
451 ATCTCTAGGA TTGTCAGAGG ATGTCAAGAC CTGGTAAGGT TCTTCGCGTT
501 GCTTCGAATT AAACCACATG CTCCACCGCT TGTGCGGGCC CCCGTCAATT
551 CCTTTGAGTT TCAGTCTTGC GACCGTACTC CCCAGGCGGA GTGCTTAATG
601 CGTTAGCTGC AGCACTAAGG GGCGGAAACC CCCTAACACT TAGCACTCAT
651 CGTTTACGGC GTGGACTACC AGGGTATCTA ATCCTGTTCG CTCCCCACGC
701 TTTCGCTCCT CAGCGTCAGT TACAGACCAG AGAGTCGCCT TCGCCACTGG
751 TGTTCCTCCA CATCTCTACG CATTTCACCG CTACACGTGG AATTCCACTC
801 TCCTCTTCTG CACTCAAGTT CCCCAGTTTC CAATGACCCT CCCCGGTTGA
851 GCCGGGGGCT TTCACATCAG ACTTAAGAAA CCGCCTGCGA GCCCTTTACG
901 CCCAATAATT CCGGACAACG CTTGCCACCT ACGTATTACC GCGGCTGCTG
951 GCACGTAGTT AGCCGTGGCT TTCTGGTTAG GTACCGTCAA GGTGCCGCCC
1001 TATTTGAACG GCACTTGTTC TTCCCTAACA ACAGAGCTTT ACGATCCGAA
1051 AACCTTCATC ACTCACGCGG CGTTGCTCCG TCAGACTTTC GTCCATTGCG
1101 GAAGATTCCC TACTGCTGCC TCCCGTAGGA GTCTGGGCCG TGTCTCAGTC
1151 CCAGTGTGGC CGATCACCCT CTCAGGTCGG CTACGCATCG TCGCCTTGGT
1201 GAGCCGTTAC CTCACCAACT AGCTAATGCG CCGCGGGTCC ATCTGTAAGT
1251 GGTAGCCGAA GCCACCTTTT ATGTCTGAAC CATGCGGTTC AGACAACCAT
1301 CCGGTATTAG CCCCGGTTTC CCGGAGTTAT CCCAGTCTTA CAGGCAGGTT
1351 ACCCACGTGT TACTCACCCG TCCGCCGCTA ACATCAGGGA GCAAGCTCCC
1401 ATCTGTCCGC TCGACTTGC。
实施例3：植物致病真菌抗菌谱的测定
所述防治油菜菌核病发酵上清液的制备方法如下：首先将芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309在含有5mL LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500mLLB培养基中进行发酵培养，发酵培养结束后离心除去菌体，得到防治油菜菌核病发酵上清液。
所述LB培养基的组成为：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，121℃高灭压菌20 min。
所述离心除去菌体是在10,000 r/min 下离心20min。
所述活化培养的时间为12h。
所述发酵培养的温度为30℃，发酵培养的时间为48h，发酵培养的摇床转速为220r/min。
采用纸片法测定芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309对10种植物致病真菌的抑制活性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌块，用牙签挑取一菌块接种于马铃薯固体培养基平板中央，28℃的条件下培养。待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片（直径6 mm）放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约1 cm。在每个滤纸片上加60 μL 的无菌发酵上清液，继续培养24 h，通过与对照组比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，若受试致病真菌的菌丝体受到抑制，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如图2所示，芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309发酵上清液对10种受试植物致病真菌具有抑制活性，分别为：立枯丝核菌、镰刀菌、宛氏拟青霉、核盘菌、胶孢炭疽菌、绿色木霉、葡萄座腔、梨炭疽、桃拟茎点和梨黑斑。
表1. 31309抑制相关致病真菌的抑菌直径表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（注：抑菌圈直径<10mm为有抑菌作用，10-14mm为中强抑菌，15-20mm为高强抑菌，20mm以上为极强抑菌作用）
实施例4：油菜菌核病（核盘菌）的生物防治田间试验
油菜菌核病菌在马铃薯蔗糖培养基上培养3天后制成直径5 mm的菌碟，留待备用。供试油菜品种为皖油29号。叶片接种试验和茎秆接种试验每小区都为5株油菜，每单株计算防效，其中4株施加芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309株发酵上清液，1株不施药作为对照CK。
于油菜主茎开花期，将芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309发酵上清液稀释10倍，用小型喷雾器（500 mL）对每株油菜进行均匀喷雾，施药量为20 mL稀释液。施药后第二天于叶片中央接种1个菌碟，菌碟上覆盖4层卫生纸，再在卫生纸上加1 mL清水保湿，以利发病，每处理接种30张叶片。茎秆接种在茎秆基部接种一个菌碟，然后用胶带包裹接种体并绕茎一圈，保湿并防止接种体脱落，每处理接种30个茎秆。
叶片接种试验交叉量取病斑直径，计算平均值，以平均直径计算病斑面积，每株测量5个病斑，共测量20个病斑的直径。茎秆接种试验每株测量5个病斑的长度，共测量20个病斑的长度。
叶片接种试验防效按下式计算：
Figure 336773DEST_PATH_IMAGE002
结果进行反正弦平方根转换，用邓肯氏法进行统计分析。
计算结果表明，芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309对油菜菌核病叶片防效达到66.57%，茎秆防效可达58.67%。
表1 芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309防治油菜菌核病试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcggcggctg gctcctaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg 60
tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt 120
actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat 180
ttgtgggatt ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt 240
gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt 300
gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac 420
ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg atgtcaagac 480
ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540
cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga gtgcttaatg 600
cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat cgtttacggc 660
gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt 720
tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg 780
ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct 840
ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg 900
cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt 960
agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtgccgccc tatttgaacg gcacttgttc 1020
ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg 1080
tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg 1140
tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt 1200
gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa 1260
gccacctttt atgtctgaac catgcggttc agacaaccat ccggtattag ccccggtttc 1320
ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta 1380
acatcaggga gcaagctccc atctgtccgc tcgacttgc 1419
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcat 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acggctacct tgttacgact t 21

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1.一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309，已于2020年07月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020334。
2.权利要求1所述的一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309在制备防治油菜菌核病发酵上清液中的应用。
3.权利要求1所述的一株芽孢杆菌（Bacillus sp.）31309在防治油菜菌核病中的应用。
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