CN113122479B - 一株生防芽孢杆菌的新用途 - Google Patents

一株生防芽孢杆菌的新用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113122479B
CN113122479B CN202110469724.0A CN202110469724A CN113122479B CN 113122479 B CN113122479 B CN 113122479B CN 202110469724 A CN202110469724 A CN 202110469724A CN 113122479 B CN113122479 B CN 113122479B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus
biocontrol
biocontrol bacillus
soybean
sclerotinia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110469724.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113122479A (zh
Inventor
高小宁
吴自林
刘睿
齐永文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy Of Sciences
Institute of Biological and Medical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Original Assignee
Institute of Bioengineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Bioengineering of Guangdong Academy of Sciences filed Critical Institute of Bioengineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority to CN202110469724.0A priority Critical patent/CN113122479B/zh
Publication of CN113122479A publication Critical patent/CN113122479A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113122479B publication Critical patent/CN113122479B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Abstract

本发明公开了一株生防芽孢杆菌的新用途。该生防芽孢杆菌的保藏号为GDMCC No：60662。本发明经试验验证，上述生防芽孢杆菌对油菜菌核病的防治效果为92.6％，对大豆菌核病的防治效果为98.4％，能够有效地防治油菜菌核病和大豆菌核病。上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌能够防治油菜菌核病、大豆菌核病，且安全性较高。

Description

一株生防芽孢杆菌的新用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌的新用途。
背景技术
油菜菌核病是油菜生产中面临的重要茎秆病害之一，发生普遍且危害严重，不仅导致减产10％-70％，而且致使病株种子含油量锐减，严重影响油菜的产量和品质。大豆菌核病是一种毁灭性茎部病害，严重制约大豆的安全生产。种植抗病或耐病品种以及化学防治是油菜菌核病和大豆菌核病的主要防治措施。然而，由于高度抗病品种的缺乏以及大量使用化学药剂，导致防治效果低，安全性较差。
发明内容：
基于此，有必要提供一种安全性较高且能够有效防治油菜菌核病和大豆菌核病的生防芽孢杆菌。
本发明提供的技术方案如下：
一株分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌的制备方法，包括如下步骤：
向甘蔗根加入无菌水粉碎，得到待接种物；
将所述待接种物接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落；
对每个所述单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌的单菌落，得到生防芽孢杆菌。该生防芽孢杆菌的保藏号为GDMCC No：60662，能够有效地防治油菜菌核病和大豆菌核病，无农药残留的问题，安全性较高。经试验验证，上述生防芽孢杆菌对油菜菌核病的防治效果为92.6％，对大豆菌核病的防治效果为98.4％，能够有效地防治油菜菌核病和大豆菌核病。
上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌或者上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌在防治油菜菌核病、大豆菌核病中的应用。
上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌或者上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌在制备防治油菜菌核病、大豆菌核病的药物中的应用。
其中一个实施例中，所述防治油菜菌核病和大豆菌核病为拮抗油菜菌核病的病原菌、大豆菌核病的病原菌。
上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌或者上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌在制备拮抗油菜菌核病的病原菌和/或大豆菌核病的病原菌的药物中的应用。
一种药物制剂，包括分离自甘蔗根部的上述生防芽孢杆菌或者上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌。
其中一个实施例中，所述药物制剂为所述生防芽孢杆菌的发酵液。
其中一个实施例中，所述药物制剂在使用时，所述生防芽孢杆菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
一种药物制剂的制备方法，包括如下步骤：培养上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌或者上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌，收集培养液，得到药物制剂。
上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌、上述生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌、上述药物制剂或者上述药物制剂的制备方法制备得到的药物制剂在防治油菜菌核病、大豆菌核病中的应用。
其中一个实施例中，所述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌的使用方法为：将所述生防芽孢杆菌配制成菌悬液后喷洒至植物上；
或者，所述药物制剂的使用方法为：将所述药物制剂(即生防芽孢杆菌的发酵液)喷洒至植物上。
本发明的生防芽孢杆菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No：60662。本发明的分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌能够防治油菜菌核病和大豆菌核病，且安全性较高。
附图说明
图1为实施例3中药物制剂对油菜菌核病菌的抑菌效果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCCNo：60662，分类命名：Bacillus sp.。经菌种鉴定，该生防菌是一种芽孢杆菌。
植物内生细菌是指能够在健康植物组织内并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物，其能够定殖在植物细胞间隙或细胞内并不会对植物造成危害。植物内生细菌分布广，种类多，具有丰富的生物多样性。植物内生细菌作为植物微生态系统中的重要组成成分，长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物为内生细菌提供光合产物和矿物质，为内生细菌提供生长必需的能量和营养；另一方面内生细菌的代谢物能刺激宿主植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。芽孢杆菌具有抗逆性强，繁殖速度快，对营养要求简单，易于在植物根围及体内定殖，对人畜无毒无害，不污染环境，是理想的生防菌筛选对象。
上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌为甘蔗根中的内生细菌，能够有效地防治油菜菌核病和大豆菌核病，且无农药残留的问题。经试验验证，上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌对油菜菌核病的防治效果为92.6％，对大豆菌核病的防治效果为98.4％，能够有效地防治油菜菌核病和大豆菌核病。上述生防芽孢杆菌能够用于制备防治油菜菌核病和大豆菌核病的药物。
微生物属于仅用结构和/或组成特征不能清楚表征的产品，并且用制备方法之外的其他特征不能充分表征。根据审查指南第二部分第十章第4.3节的规定，该类产品的权利要求，允许采用制备方法来表征。
一实施方式的分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌的制备方法，能够分离得到能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌的生防芽孢杆菌。该制备方法包括如下步骤S110～S130：
S110、向甘蔗根加入无菌水粉碎，得到待接种物。
在其中一个实施例中，向甘蔗根加入无菌水粉碎的步骤包括：向甘蔗根加入无菌水研磨至糊状。进一步地，甘蔗根与无菌水的质量比为1:8～1:10。更进一步地，甘蔗根与无菌水的质量比为1:9。
在其中一个实施例中，向甘蔗根加入无菌水粉碎的步骤之前，还包括如下步骤：对甘蔗根进行消毒处理。进一步地，对甘蔗根进行消毒处理的步骤包括：采用体积百分含量为70％的乙醇的水溶液对甘蔗根消毒30s～60s；接着，采用质量百分含量为3.125％的NaClO的水溶液对甘蔗根消毒5min～6min；再采用体积百分含量为70％的乙醇水溶液对甘蔗根消毒30s。其中，消毒的方式为浸泡。更进一步地，消毒结束后，还包括清洗消毒后的甘蔗根的步骤。具体地，采用无菌水清洗消毒后的甘蔗根。
S120、将待接种物接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落。
在其中一个实施例中，将待接种物接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落的步骤包括：将待接种物稀释102倍～103倍后涂布至牛肉膏蛋白胨琼脂培养平板上28℃培养2天～3天，获得多个单菌落。需要说明的是，接种的方式不限于涂布，也可以为其他接种方式，例如平板划线。
S130、对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌的单菌落，得到分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌。
在其中一个实施例中，对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌的单菌落的方式为平板对峙培养法。
在其中一个实施例中，对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌的单菌落，得到生防芽孢杆菌的步骤包括：对每个单菌落进行筛选，获得对梢腐病的病原菌或者小斑病菌拮抗作用均较强的单菌落，再经平板划线纯化，得到生防芽孢杆菌。进一步地，对每个单菌落进行筛选，获得对梢腐病的病原菌或者小斑病菌拮抗作用均最强的单菌落，再经平板划线纯化，得到生防芽孢杆菌。
在其中一个实施例中，得到生防芽孢杆菌的步骤之后还包括对生防芽孢杆菌进行菌种鉴定的步骤。其中，菌种鉴定的方式包括16S rDNA鉴定。具体地，经16S rDNA鉴定，生防芽孢杆菌为芽孢杆菌。需要说明的是，菌种鉴定的方式不限于包括16S rDNA鉴定，还包括生理生化特性鉴定或者形态学鉴定。
在一个具体示例中，选取多个单菌落中玉米小斑病菌的抑菌带的宽度为1.5cm且甘蔗梢腐病的病原菌的抑菌带的宽度为1.0cm的单菌落进行平板划线纯化，得到生防芽孢杆菌。经鉴定，该生防芽孢杆菌为Bacillus sp.，即为芽孢杆菌属。将生防芽孢杆菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No：60662，分类命名：Bacillus sp.。经试验验证，上述生防芽孢杆菌能够拮抗油菜菌核病的病原菌和大豆菌核病的病原菌，以能够用于防治油菜菌核病和大豆菌核病。
一实施方式的药物制剂包括上述实施方式的生防芽孢杆菌或者上述实施方式的生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌。该药物制剂能够拮抗油菜菌核病的病原菌和大豆菌核病的病原菌，能够用于防治油菜菌核病和大豆菌核病。
在其中一个实施例中，药物制剂为液体。需要说明的是，药物制剂不限于为液体，也可以为冻干粉。
在其中一个实施例中，药物制剂在使用时，生防芽孢杆菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
在其中一个实施例中，药物制剂为生防芽孢杆菌的发酵液。药物制剂为生防芽孢杆菌在细菌发酵培养基中发酵得到的发酵液。其中，细菌发酵培养基为酵母粉蛋白胨培养基(即LB培养基)。具体地，发酵条件为：26℃～28℃、150rpm～180rpm振荡培养48h～72h。需要说明的是，细菌发酵培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述生防芽孢杆菌增殖并保持细胞活性即可。
在其中一个实施例中，药物制剂为含有生防芽孢杆菌的细胞悬浮液。具体地，药物制剂还包括生理盐水。需要说明的是，药物制剂不限于包括生理盐水，还可以包括其他能够使上述生防芽孢杆菌保持细胞活性的组分。
需要说明的是，上述药物制剂不限于包括上述指出的组分，还可以仅包括上述实施方式的生防芽孢杆菌。当药物制剂仅包括上述生防芽孢杆菌时，药物制剂可以为冻干粉。此时，需要使用药物制剂时，将生防芽孢杆菌活化即可。
经验证，上述药物制剂能够拮抗油菜菌核病的病原菌和大豆菌核病的病原菌，且能够用于防治油菜菌核病和大豆菌核病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的药物制剂包括上述实施方式的生防芽孢杆菌的培养上清液。
在其中一个实施例中，生防芽孢杆菌的培养上清液为生防芽孢杆菌在细菌培养基中培养并固液分离得到的培养上清液。其中，细菌培养基为酵母粉蛋白胨培养基(即LB培养基)。具体地，培养条件为：28℃、150rpm振荡培养48h。需要说明的是，细菌培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述生防芽孢杆菌增殖并保持细胞活性即可。
上述药物制剂能够拮抗油菜菌核病的病原菌和大豆菌核病的病原菌，且能够用于防治油菜菌核病和大豆菌核病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的药物制剂的制备方法包括如下步骤：培养上述实施方式的生防芽孢杆菌，收集培养液，得到药物制剂。
在其中一个实施例中，培养生防芽孢杆菌的培养基为LB培养基。需要说明的是，培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述生防芽孢杆菌增殖并保持细胞活性即可。
在其中一个实施例中，培养条件为26℃～28℃、150rpm～180rpm振荡培养。进一步地，培养时间为48h～72h。
在其中一个实施例中，培养上述实施方式的生防芽孢杆菌，收集培养液，得到药物制剂的步骤包括：培养生防芽孢杆菌至活菌浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL，收集培养液，得到药物制剂。
在其中一个实施例中，收集培养液的步骤之后，还包括如下步骤：对培养液进行固液分离，收集培养上清液，得到药物制剂。进一步地，固液分离的方式为离心。更进一步地，固液分离的条件为5000rpm～6000rpm离心15min～20min。需要说明的是，固液分离的方式不限于为离心，也可以为其他分离方式，例如可以为过滤。
上述药物制剂能够拮抗油菜菌核病的病原菌和大豆菌核病的病原菌，且能够用于防治油菜菌核病和大豆菌核病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的上述实施方式的生防芽孢杆菌、上述实施方式的生防芽孢杆菌的制备方法制备得到的生防芽孢杆菌、上述实施方式的药物制剂或者上述实施方式的药物制剂的制备方法制备得到的药物制剂在防治油菜菌核病和大豆菌核病中的应用。
在其中一个实施例中，生防芽孢杆菌的使用方法为：将生防芽孢杆菌配制成菌悬液后喷洒至植物的叶片上。进一步地，按照上述药物制剂的制备方法将生防芽孢杆菌制备成药物制剂后喷洒至植物的叶片上。更进一步地，生防芽孢杆菌在使用时，生防芽孢杆菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
在其中一个实施例中，药物制剂的使用方法为：将药物制剂喷洒至植物的叶片上。进一步地，药物制剂在使用时，生防芽孢杆菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
生防芽孢杆菌的分离和鉴定
1、生防芽孢杆菌的分离：
(1)取广东翁源县自然生长的蔗田的甘蔗的根系，用自来水冲洗甘蔗根系后展开晾干，取每株根系的1/4剪碎至长度为1cm～2cm。再取1g剪碎后的根系置于体积百分含量为70％的乙醇的水溶液中消毒60s，接着置于质量百分含量为3.125％的NaClO的水溶液中消毒6min，再置于体积百分含量为70％的乙醇水溶液中消毒30s，得到消毒后的根系。并且，采用无菌水冲洗消毒后的根系，并取200μL冲洗后的废液涂在LBA平板(即酵母粉蛋白胨琼脂培养板)上培养，以检测根系的表面是否彻底消毒。需要说明的是，每株植株的根系剪碎后均取1g进行上述的消毒操作。
(2)将消毒后的根系置于消毒研钵中，加入9mL的无菌水研磨至糊状，得到待接种物。采用无菌水将待接种物稀释至100倍和1000倍，得到稀释100倍的待接种物和1000倍的待接种物。从待接种物、稀释100倍的待接种物和1000倍的待接种物中各取200μL涂布在LBA平板上，每个处理重复3皿，在28℃下培养2天后，获得多个单菌落。
(3)挑取单菌落置于生理盐水中混合，得到菌悬液，菌悬液中的菌浓度为1×1010CFU/mL。取0.1mL的菌悬液接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的边缘，用打孔器在玉米小斑病菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于接有菌悬液的PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。同时，取0.1mL的菌悬液接种于PDA平板的边缘，用打孔器在甘蔗梢腐病的病原菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。每个单菌落均配制得到相应的菌悬液，且均进行上述两种病原菌的抑制试验。选取多个单菌落中玉米小斑病菌的抑菌带的宽度为1.5cm且甘蔗梢腐病的病原菌的抑菌带的宽度为1.0cm的单菌落进行平板划线纯化，得到生防芽孢杆菌。
2、生防芽孢杆菌的鉴定：
(1)形态鉴定：
将步骤1得到的生防芽孢杆菌划线接种到LBA平板在28℃培养2天，观察菌落的形态，并挑取菌落至显微镜下进行观察。
经观察后，生防芽孢杆菌的菌落为圆形，不光滑，表面有皱褶，菌落边缘成不规则扩展，的菌体杆状，周生鞭毛。
(2)生理生化特征鉴定：
具体地，对步骤1得到的生防芽孢杆菌进行革兰氏染色、耐盐性试验(质量百分含量为10％的NaCl的水溶液)、甲基红试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、接触酶试验、纤维素分解试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验和碳源利用实验(其中，碳源为木糖、麦芽糖、甘油或者甘露醇)。
对生防芽孢杆菌进行革兰氏染色、耐盐性试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验和碳源利用实验的结果均为阳性。对生防芽孢杆菌进行甲基红试验、纤维素分解试验和硫化氢试验的结果均为阴性。
(3)16S rRNA鉴定：
将步骤1得到的生防芽孢杆菌置于LB液体培养基中28℃、150rpm培养至对数期(即OD600为0.8)，以12000rpm离心5min，收集菌体。采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取菌体的基因组DNA。以提取的DNA产物为模板，用序列如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.2所示的细菌16S rDNA扩增通用引物对从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。扩增出16S rDNA基因片段送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定的16S rRNA基因序列进行同源性比较。其中，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，其中，简并碱基M表示A碱基或者C碱基；如SEQ ID No.2所示的序列为：5’-CTACGGRTACCTTGTTACGAC-3’，其中，简并碱基R表示A碱基或者G碱基。
经比对，生防芽孢杆菌为Bacillus sp.，即为芽孢杆菌属，命名为生防芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZG479。将生防芽孢杆菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No：60662，分类命名：Bacillus sp.。
实施例2
药物制剂的制备
将生防芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZG479(即实施例1的生防芽孢杆菌，保藏号为GDMCC No：60662)接种到LB液体培养基中28℃、150rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的OD(optical density，光密度)值。当OD值为0.8时结束培养，获得种子菌液。将种子菌液接种至LB液体培养液中28℃、150rpm发酵培养48h，收集发酵液，得到药物制剂。其中，种子菌液和LB液体培养液的体积比为1:500。药物制剂中活菌浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
实施例3
药物制剂的抑菌活性实验(平板对峙培养法)
药物制剂对油菜菌核病菌和大豆菌核病菌生长的影响
取0.1mL的实施例2的药物制剂(活菌总浓度为1×1010CFU/mL)接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的相对称的边缘。用打孔器在油菜菌核病菌或大豆菌核病菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板的中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。上述过程重复三皿，并计算抑菌带的宽度的平均值。同时，以仅接种油菜菌核病菌或大豆菌核病菌至PDA平板中进行培养作为对照。其中，接种药物制剂及油菜菌核病菌的培养皿培养结束后的图片如图1所示。图1中D即为抑菌带的宽度。
从图1可以看出，接种药物制剂及油菜菌核病菌的培养皿出现明显的抑菌带，油菜菌核病菌的菌丝出现畸形。得到药物制剂对油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的抑菌带的宽度分别为2.5cm，油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的菌丝出现畸形，说明药物制剂能够明显抑制油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的生长。
实施例4
药物制剂对油菜菌核病菌和大豆菌核病菌菌核萌发的影响
选择大小基本一致的PDA平板上(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)新培养的油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的菌核。将菌核在实施例2的药物制剂(活菌总浓度为1×1010CFU/mL)中浸泡5min，将浸泡后的菌核置于水琼脂培养基(WA)平板上，每个培养皿放置5个菌核，每处理重复3个培养皿。25℃静置培养48小时后在光学显微镜下观察菌核萌发情况，并按照公式1和公式2计算菌核萌发率和抑制效果。同时，以将菌核浸泡在无菌水中作为对照。
公式1为：菌核萌发率(％)＝萌发的菌核数量/菌核总数量×100％
公式2为：抑制效果(％)＝(对照组的菌核萌发率-实验组的菌核萌发率)/对照组的菌核萌发率×100％
药物制剂对油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的菌核萌发的抑制率为100％，说明药物制剂可以完全抑制油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的菌核萌发，具有极强的抑制效果。
实施例5
药物制剂对油菜菌核病的防治效果
1、实验分为两组，分别为实验组和对照组，每组15株油菜。
2、实验过程：
(1)实验组：
将油菜在温室(温度为20～25℃)中播种，按照正常培养。待油菜长至花期时，将实施例2得到的药物制剂采用叶面喷雾方法喷施于整株油菜。药物制剂中活菌总浓度为1×109CFU/mL。喷雾标准是整株上有雾状液滴分布，以不掉下为准。药物制剂喷施结束后，将油菜菌核病菌菌饼接种于事先用牙签刺伤的油菜茎秆上。油菜菌核病菌的菌饼接种后，在25℃下保湿培养10天。
(b)对照组：对照组的操作过程与实验组的大致相同，不同之处在于，采用无菌水替代药物制剂；且油菜菌核病菌的菌饼接种后，在25℃下保湿培养10天。
(3)检测：
每组培养结束后，观察油菜植株的病害的发生情况，记录茎秆发病率和严重度，并按照如下公式3和公式4计算病情指数和防治效果，并计算各组相关参数的平均值。
其中，油菜菌核病的严重度分级标准详见表1；
公式3为：病情指数＝∑(发病茎秆数×病级数)/(总茎秆数×最高病级数)×100；
公式4为：防治效果(％)＝(对照组的病情指数-实验组的病情指数)/对照组的病情指数×100％；
测定结果详见表2。
表1油菜菌核病的严重度分级标准
级别 症状
0级 无病
1级 轻微发病，发病面积占主茎表面积的5％以下
3级 轻度发病，发病面积占主茎表面积的6～15％
5级 中等发病，发病面积占主茎表面积的16～30％
7级 高度发病，发病面积占主茎表面积的31～50％
9级 严重发病，发病面积占主茎表面积的50％以上
表2药物制剂对油菜菌核病的防治效果
Figure BDA0003044893890000141
Figure BDA0003044893890000151
从表2可以看出，药物制剂对油菜菌核病的防治效果为92.6％，说明药物制剂对油菜菌核病具有较好的防治作用。
实施例6
药物制剂对大豆菌核病的防治效果
1、实验分为两组，分别为实验组和对照组，每组10株大豆。
2、实验过程：
(1)实验组：
将大豆在温室(温度为20～25℃)中播种，按照正常培养。待大豆长至四片复叶时，将实施例2得到的药物制剂采用叶面喷雾方法喷施于整株大豆。药物制剂中活菌总浓度为1×109CFU/mL。喷雾标准是叶片有雾状液滴分布，以不掉下为准。药物制剂喷施结束后，将大豆菌核病菌菌饼接种于大豆叶片上。大豆菌核病菌的菌饼接种后，在25℃下保湿培养3天。
(b)对照组：对照组的操作过程与实验组的大致相同，不同之处在于，采用无菌水替代药物制剂；且大豆菌核病菌的菌饼接种后，在25℃下保湿培养3天。
(3)检测：
每组培养结束后，观察大豆叶片的病害的发生情况，记录叶片发病率，并测量病斑大小，按照公式5计算防治效果。同时，计算各组相关参数的平均值。
公式5为：防治效果(％)＝(对照组的病斑大小-实验组的病斑大小)/对照组的病斑大小×100％
表3药物制剂对大豆菌核病的防治效果
病斑大小(mm) 防治效果(％)
实验组 0.4 98.4
对照组 25.2 -
从表3可以看出，药物制剂对大豆菌核病的防治效果为98.4％，说明药物制剂对大豆菌核病具有良好的防治效果。
综上所述，上述分离自甘蔗根部的生防芽孢杆菌及其发酵液能够拮抗油菜菌核病菌和大豆菌核病菌，且能够防治油菜菌核病和大豆菌核病菌，能够用于制备拮抗油菜菌核病菌和大豆菌核病菌的药物及防治油菜菌核病和大豆菌核病的药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省科学院生物工程研究所
<120> 一株生防芽孢杆菌的新用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacggrtac cttgttacga c 21

Claims (1)

1.生防芽孢杆菌在防治大豆菌核病中的应用，所述生防芽孢杆菌的保藏号为GDMCCNo：60662，于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；所述生防芽孢杆菌的使用浓度为1×109CFU/mL~1×1010CFU/mL；所述生防芽孢杆菌的使用方法为：将包含有所述生防芽孢杆菌的发酵液喷洒至大豆上；或者将所述生防芽孢杆菌配制成菌悬液后喷洒至大豆上。
CN202110469724.0A 2021-04-28 2021-04-28 一株生防芽孢杆菌的新用途 Active CN113122479B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110469724.0A CN113122479B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一株生防芽孢杆菌的新用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110469724.0A CN113122479B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一株生防芽孢杆菌的新用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113122479A CN113122479A (zh) 2021-07-16
CN113122479B true CN113122479B (zh) 2023-02-14

Family

ID=76780926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110469724.0A Active CN113122479B (zh) 2021-04-28 2021-04-28 一株生防芽孢杆菌的新用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113122479B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113746A1 (en) * 2004-05-18 2005-12-01 Council Of Scientific And Industrial Research Novel strain of bacillus as a bioinoculant
KR20080095652A (ko) * 2007-04-25 2008-10-29 동아대학교 산학협력단 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제
CN105018386A (zh) * 2015-07-31 2015-11-04 长江大学 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN110241058A (zh) * 2019-07-30 2019-09-17 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用
CN110272854A (zh) * 2019-07-29 2019-09-24 北京林业大学 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN110951648A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 东北农业大学 一种防治大豆菌核病的生防细菌ba20及其应用
CN112048457A (zh) * 2020-10-12 2020-12-08 福建农林大学 一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296040B (zh) * 2011-08-26 2013-07-31 哈尔滨君龙实业有限公司 一株源于大豆根际能够拮抗病原真菌的芽孢杆菌及其用途
CN109022315B (zh) * 2018-08-13 2021-10-22 东北农业大学 一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005113746A1 (en) * 2004-05-18 2005-12-01 Council Of Scientific And Industrial Research Novel strain of bacillus as a bioinoculant
KR20080095652A (ko) * 2007-04-25 2008-10-29 동아대학교 산학협력단 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제
CN105018386A (zh) * 2015-07-31 2015-11-04 长江大学 一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN110272854A (zh) * 2019-07-29 2019-09-24 北京林业大学 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
CN110241058A (zh) * 2019-07-30 2019-09-17 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用
CN110951648A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 东北农业大学 一种防治大豆菌核病的生防细菌ba20及其应用
CN112048457A (zh) * 2020-10-12 2020-12-08 福建农林大学 一株芽孢杆菌31309及其在防治油菜菌核病中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease;Alvarez F 等;《Journal of Applied Microbiology》;20111122;第112卷(第1期);摘要 *
油菜根圈枯草芽孢杆菌Tu-100抗真菌范围和防治作用;江木兰 等;《中国油料作物学报》;20090915;第31卷(第3期);摘要 *
油菜菌核病内生拮抗细菌的筛选及防病作用研究;高小宁 等;《农药学学报》;20100615;第12卷(第2期);摘要、第165页第1栏第3段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113122479A (zh) 2021-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107779420B (zh) 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用
CN112175888B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用
CN109456921B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌、应用及微生物菌剂、粉剂和颗粒剂
CN110468057B (zh) 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用
CN106929447B (zh) 地衣芽孢杆菌bl06及其应用
CN109112069B (zh) 一种生防内生真菌及其应用
CN113980871B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌菌株ht-9及其应用
CN109294961B (zh) 一株防治荔枝霜疫病的生防菌株pnc25及其应用
CN110317747A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌jt68及其在防治茶炭疽病的应用
CN109735457B (zh) 一株诱变尖角突脐孢菌及其在防治稗草中的应用
CN107345215A (zh) 一株多粘类芽孢杆菌及其在黄瓜白粉病和霜霉病防治中的应用
CN110241058B (zh) 甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用
CN113122479B (zh) 一株生防芽孢杆菌的新用途
CN116240126A (zh) 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌sb10及其应用
CN115960723A (zh) 一种烟管菌及其应用
CN111548951B (zh) 枯草芽孢杆菌Pro6A5、其菌剂和制备方法及在甜瓜栽培中的应用
CN113416679A (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌、包括甲基营养型芽孢杆菌的菌剂及其应用
CN114774279A (zh) 一株枯草芽胞杆yx72及其在防治烟草镰刀菌根腐病和促生长中的应用
CN109234206B (zh) 一株防治水稻苗期立枯病的解鸟氨酸拉乌尔菌ha011及其应用
CN116286536B (zh) 一种芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌yz-228及其应用
CN113789287B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌w33及其微生物育苗基质与应用
CN116218742B (zh) 一株拮抗掘氏疫霉菌的地衣芽孢杆菌及其应用
CN113881590B (zh) 一种核桃叶片内生生防细菌及其制备方法和应用
CN112226387B (zh) 一株白色杆菌及其在防治玉米茎基腐病中的应用
CN116987648B (zh) 一株短小芽孢杆菌及其在猕猴桃溃疡病防治中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: No.10, shiliugang Road, Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province 510000

Patentee after: Institute of biological and medical engineering, Guangdong Academy of Sciences

Address before: No.10, shiliugang Road, Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province 510000

Patentee before: Institute of bioengineering, Guangdong Academy of Sciences

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231211

Address after: No. 10, shiliugang Road, Guangzhou, Guangdong 510000

Patentee after: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy of Sciences

Address before: No.10, shiliugang Road, Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province 510000

Patentee before: Institute of biological and medical engineering, Guangdong Academy of Sciences