CN110241058B - 甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用 - Google Patents

甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用。该甘蔗内生生防细菌的保藏号为GDMCC No：60662。上述甘蔗内生生防细菌能够防治小斑病，且安全性较高。

Description

甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用。
背景技术
玉米小斑病又称玉米斑点病，是一种真菌病害。玉米小斑病是玉米生产中面临的重要叶部病害之一，严重制约着玉米产业的健康发展。化学防治是治理玉米小斑病的主要防治措施，尤其在发病初期。然而，化学防治存在农药残留的问题，安全性较差。
发明内容
基于此，有必提供一种安全性较高且能够防治小斑病的甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用。
本发明提供的技术方案如下：
一种甘蔗内生生防细菌，该甘蔗内生生防细菌的保藏号为GDMCC No：60662。
上述甘蔗内生生防细菌作为一种微生物，能够有效地防治小斑病，无农药残留的问题，安全性较高。经试验验证，上述甘蔗内生生防细菌对玉米小斑病的防治效果为64.4％～83.9％，能够有效地防治小斑病。
一种甘蔗内生生防细菌的制备方法，包括如下步骤：
向甘蔗根加入无菌水粉碎，得到待接种物；
将所述待接种物接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落；
对每个所述单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌的单菌落，得到甘蔗内生生防细菌。
上述甘蔗内生生防细菌或者上述甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌在制备防治小斑病、灰霉病或者梢腐病的药物中的应用。
其中一个实施例中，所述防治小斑病或者梢腐病为拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌或者小斑病菌；
及/或，所述小斑病为玉米小斑病，所述梢腐病为甘蔗梢腐病，所述灰霉病为葡萄灰霉病。
一种药物制剂，包括上述甘蔗内生生防细菌或者上述甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌。
其中一个实施例中，所述药物制剂为所述甘蔗内生生防细菌的发酵液。
其中一个实施例中，所述药物制剂在使用时，所述甘蔗内生生防细菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
一种药物制剂的制备方法，包括如下步骤：培养上述甘蔗内生生防细菌或者上述甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌，收集培养液，得到药物制剂。
上述甘蔗内生生防细菌、上述甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌、上述药物制剂或者上述药物制剂的制备方法制备得到的药物制剂在防治小斑病、灰霉病或者梢腐病中的应用。
其中一个实施例中，所述甘蔗内生生防细菌的使用方法为：将所述甘蔗内生生防细菌配制成菌悬液后喷洒至植物的叶片上；
或者，所述药物制剂的使用方法为：将所述药物制剂喷洒至植物的叶片上。
附图说明
图1为实施例3中药物制剂对玉米小斑病菌的抑菌效果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的甘蔗内生生防细菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No:60662，分类命名：Bacillus sp.。经菌种鉴定，该甘蔗内生生防细菌是一种芽孢杆菌。
甘蔗是一种重要的糖料作物，在保障食糖安全、满足人们生活需求方面具有重要的地位；同时，蔗糖产业已成为蔗区农民脱贫致富、地方财政收入的主要途径。植物内生微生物是指生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内部，在与寄主植物的长期协同进化过程中形成互惠共存、相互制约的和谐关系。植物内生微生物对植物的有益作用可以分为三种：通过共生作用提高植物的环境适应性；对植物的促生长作用；提高宿主植物的抗生物和非生物胁迫作用。由于内生菌在植物体内有稳定的生存空间，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。
上述甘蔗内生生防细菌为甘蔗根中的内生菌，能够有效地防治小斑病，且无农药残留的问题。经试验验证，上述甘蔗内生生防细菌对玉米小斑病的防治效果为64.4％～83.9％，能够有效地防治小斑病。上述甘蔗内生生防细菌能够用于制备防治小斑病的药物。进一步地，小斑病为玉米小斑病。
进一步地，由于化学防治所用的化学农药污染环境，且存在农药残留的问题，安全性较差。而生物防治作为一种既经济又环保的病害防治方法，具有的安全、绿色、高效等特点，能够满足国家、社会对农业可持续发展的需求。上述甘蔗内生生防细菌能够拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌或者小斑病菌，能够用于制备拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病或者小斑病菌的药物，以用于小斑病和梢腐病的生物防治。进一步地，梢腐病为甘蔗梢腐病。灰霉病为葡萄灰霉病。需要说明的是，灰霉病不限于为葡萄灰霉病，也可以为其他灰霉病，例如可以为番茄灰霉病。
微生物属于仅用结构和/或组成特征不能清楚表征的产品，并且用制备方法之外的其他特征不能充分表征。根据审查指南第二部分第十章第4.3节的规定，该类产品的权利要求，允许采用制备方法来表征。
一实施方式的甘蔗内生生防细菌的制备方法，能够分离得到能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌的甘蔗内生生防细菌。该制备方法包括如下步骤S110～S130：
S110、向甘蔗根加入无菌水粉碎，得到待接种物。
在其中一个实施例中，向甘蔗根加入无菌水粉碎的步骤包括：向甘蔗根加入无菌水研磨至糊状。进一步地，甘蔗根与无菌水的质量比为1:8～1:10。更进一步地，甘蔗根与无菌水的质量比为1:9。
在其中一个实施例中，向甘蔗根加入无菌水粉碎的步骤之前，还包括如下步骤：对甘蔗根进行消毒处理。进一步地，对甘蔗根进行消毒处理进行消毒处理的步骤包括：采用体积百分含量为70％的乙醇的水溶液对甘蔗根消毒30s～60s；接着，采用质量百分含量为3.125％的NaClO的水溶液对甘蔗根消毒5min～6min；再采用体积百分含量为70％的乙醇水溶液对甘蔗根30s。其中，消毒的方式为浸泡。更进一步地，消毒结束后，还包括清洗消毒后的甘蔗根的步骤。具体地，采用无菌水清洗消毒后的甘蔗根。
S120、将待接种物接种到肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落。
在其中一个实施例中，将待接种物接种到肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，获得多个单菌落的步骤包括：将待接种物稀释102倍～103倍后涂布至肉膏蛋白胨琼脂培养平板上28℃培养2天～3天，获得多个单菌落。需要说明的是，接种的方式不限于涂布，也可以为其他接种方式，例如平板划线。
S130、对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌的单菌落，得到甘蔗内生生防细菌。
在其中一个实施例中，对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌的单菌落的方式为平板对峙培养法。
在其中一个实施例中，对每个单菌落进行筛选，获得能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌的单菌落，得到甘蔗内生生防细菌的步骤包括：对每个单菌落进行筛选，获得对梢腐病的病原菌和小斑病菌拮抗作用均较强的单菌落，再经平板划线纯化，得到甘蔗内生生防细菌。进一步地，对每个单菌落进行筛选，获得对梢腐病的病原菌和小斑病菌拮抗作用均最强的单菌落，再经平板划线纯化，得到甘蔗内生生防细菌。
在一个具体示例中，小斑病菌为玉米小斑病菌。梢腐病的病原菌为甘蔗梢腐病的病原菌。
在其中一个实施例中，得到甘蔗内生生防细菌的步骤之后还包括对甘蔗内生生防细菌进行菌种鉴定的步骤。其中，菌种鉴定的方式包括16S rDNA鉴定。具体地，经16S rDNA鉴定，甘蔗内生生防细菌为芽孢杆菌。需要说明的是，菌种鉴定的方式不限于包括16S rDNA鉴定，还包括生理生化特性鉴定或者形态学鉴定。
在一个具体示例中，选取多个单菌落中玉米小斑病菌的抑菌带的宽度为1.5cm且甘蔗梢腐病的病原菌的抑菌带的宽度为1.0cm的单菌落进行平板划线纯化，得到甘蔗内生生防细菌。经鉴定，该甘蔗内生生防细菌为Bacillus sp.，即为芽孢杆菌属。将甘蔗内生生菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No:60662，分类命名：Bacillus sp.。经试验验证，上述甘蔗内生生防细菌能够拮抗梢腐病的病原菌、灰霉素的病原菌或者小斑病菌，以能够用于防治梢腐病、灰霉病或者小斑病菌。
一实施方式的药物制剂包括上述实施方式的甘蔗内生生防细菌或者上述实施方式的甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌。该药物制剂能够拮抗梢腐病的病原菌或者小斑病菌，能够用于防治小斑病或者梢腐病。进一步地，小斑病为玉米小斑病。梢腐病为甘蔗梢腐病。
在其中一个实施例中，药物制剂为液体。需要说明的是，药物制剂不限于为液体，也可以为冻干粉。
在其中一个实施例中，药物制剂在使用时，甘蔗内生生防细菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
在其中一个实施例中，药物制剂为甘蔗内生生防细菌的发酵液。药物制剂为甘蔗内生生防细菌在细菌发酵培养基中发酵得到的发酵液。其中，细菌发酵培养基为肉膏蛋白胨培养基(即LB培养基)。具体地，发酵条件为：26℃～28℃、150rpm～180rpm振荡培养48h～72h。需要说明的是，细菌发酵培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述甘蔗内生生防细菌增殖并保持细胞活性即可。
在其中一个实施例中，药物制剂为含有甘蔗内生生防细菌的细胞悬浮液。具体地，药物制剂还包括生理盐水。需要说明的是，药物制剂不限于包括生理盐水，还可以包括其他能够使上述甘蔗内生生防细菌保持细胞活性的组分。
需要说明的是，上述药物制剂不限于包括上述指出的组分，还可以仅包括上述实施方式的甘蔗内生生防细菌。当药物制剂仅包括上述甘蔗内生生防细菌时，药物制剂可以为冻干粉。此时，需要使用药物制剂时，将甘蔗内生生防细菌活化即可。
经验证，上述药物制剂不仅能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌，还能够拮抗灰霉素的病原菌，且能够用于防治小斑病、灰霉病和梢腐病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的药物制剂包括上述实施方式的甘蔗内生生防细菌的培养上清液。
在其中一个实施例中，甘蔗内生生防细菌的培养上清液为甘蔗内生生防细菌在细菌培养基中培养并固液分离得到的培养上清液。其中，细菌培养基为肉膏蛋白胨培养基(即LB培养基)。具体地，培养条件为：28℃、150rpm振荡培养48h。需要说明的是，细菌培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述甘蔗内生生防细菌增殖并保持细胞活性即可。
上述药物制剂能够拮抗梢腐病的病原菌和小斑病菌，且能够用于防治小斑病和梢腐病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的药物制剂的制备方法包括如下步骤：培养上述实施方式的甘蔗内生生防细菌，收集培养液，得到药物制剂。
在其中一个实施例中，培养甘蔗内生生防细菌的培养基为LB培养基。需要说明的是，培养基不限于上述指出的LB培养基，也可以为其他培养基，只要能够使上述甘蔗内生生防细菌增殖并保持细胞活性即可。
在其中一个实施例中，培养条件为26℃～28℃、150rpm～180rpm振荡培养。进一步地，培养时间为48h～72h。
在其中一个实施例中，培养上述实施方式的甘蔗内生生防细菌，收集培养液，得到药物制剂的步骤包括：培养甘蔗内生生防细菌至活菌浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL，收集培养液，得到药物制剂。
在其中一个实施例中，收集培养液的步骤之后，还包括如下步骤：对培养液进行固液分离，收集培养上清液，得到药物制剂。进一步地，固液分离的方式为离心。更进一步地，固液分离的条件为5000rpm～6000rpm离心15min～20min。需要说明的是，固液分离的方式不限于为离心，也可以为其他分离方式，例如可以为过滤。
上述药物制剂能够拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌和小斑病菌，且能够用于防治小斑病、灰霉病和梢腐病，以用于植物病害的生物防治。
一实施方式的上述实施方式的甘蔗内生生防细菌、上述实施方式的甘蔗内生生防细菌的制备方法制备得到的甘蔗内生生防细菌、上述实施方式的药物制剂或者上述实施方式的药物制剂的制备方法制备得到的药物制剂在防治小斑病、灰霉病或者梢腐病中的应用。
在其中一个实施例中，防治小斑病、灰霉病或者梢腐病为拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌或者小斑病菌。进一步地，小斑病为玉米小斑病。梢腐病为甘蔗梢腐病。灰霉病为葡萄灰霉病。需要说明的是，灰霉病不限于为葡萄灰霉病，也可以为其他灰霉病，例如可以为番茄灰霉病。
在其中一个实施例中，甘蔗内生生防细菌的使用方法为：将甘蔗内生生防细菌配制成菌悬液后喷洒至植物的叶片上。进一步地，按照上述药物制剂的制备方法将甘蔗内生生防细菌制备成药物制剂后喷洒至植物的叶片上。更进一步地，甘蔗内生生防细菌在使用时，甘蔗内生生防细菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
在其中一个实施例中，药物制剂的使用方法为：将药物制剂喷洒至植物的叶片上。进一步地，药物制剂在使用时，甘蔗内生生防细菌的使用浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
如无特别说明，以下实施例中，玉米小斑病菌为市售玉米小斑病菌，且其保藏号为CGMCC 3.13727。甘蔗梢腐病的病原菌为市售的甘蔗梢腐病的病原菌，且其保藏号为CGMCC3.1933。葡萄灰霉病的病原菌为市售葡萄灰霉病的病原菌，且其保藏号为CGMCC 3.4584。
实施例1
甘蔗内生生防细菌的分离和鉴定
1、甘蔗内生生防细菌的分离：
(1)取广东翁源县自然生长的蔗田的甘蔗的根系，用自来水冲洗甘蔗根系后展开晾干，取每株根系的1/4剪碎至长度为1cm～2cm。再取1g剪碎后的根系置于体积百分含量为70％的乙醇的水溶液中消毒60s，接着置于质量百分含量为3.125％的NaClO的水溶液中消毒6min，再置于体积百分含量为70％的乙醇水溶液中消毒30s，得到消毒后的根系。并且，采用无菌水冲洗消毒后的根系，并取200μL冲洗后的废液涂在LBA平板(即肉膏蛋白胨琼脂培养板)上培养，以检测根系的表面是否彻底消毒。需要说明的是，每株植株的根系剪碎后均取1g进行上述的消毒操作。
(2)将消毒后的根系置于消毒研钵中，加入9mL的无菌水研磨至糊状，得到待接种物。采用无菌水将待接种物稀释至100倍和1000倍，得到稀释100倍的待接种物和1000倍的待接种物。从待接种物、稀释100倍的待接种物和1000倍的待接种物中各取200μL涂布在LBA平板上，每个处理重复3皿，在28℃下培养2天后，获得多个单菌落。
(3)挑取单菌落置于生理盐水中混合，得到菌悬液，菌悬液中的菌浓度为1×1010CFU/mL。取0.1mL的菌悬液接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的边缘，用打孔器在玉米小斑病菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于接有菌悬液的PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。同时，取0.1mL的菌悬液接种于PDA平板的边缘，用打孔器在甘蔗梢腐病的病原菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。每个单菌落均配制得到相应的菌悬液，且均进行上述两种病原菌的抑制试验。选取多个单菌落中玉米小斑病菌的抑菌带的宽度为1.5cm且甘蔗梢腐病的病原菌的抑菌带的宽度为1.0cm的单菌落进行平板划线纯化，得到甘蔗内生生防细菌。
2、甘蔗内生生防细菌的鉴定：
(1)形态鉴定：
将甘蔗内生生防细菌划线接种到LBA平板在28℃培养2天，观察菌落的形态，并挑取菌落至显微镜下进行观察。
经观察后，甘蔗内生生防细菌的菌落为圆形，不光滑，表面有皱褶，菌落边缘成不规则扩展，的菌体杆状，周生鞭毛。
(2)生理生化特征鉴定：
具体地，对甘蔗内生生防细菌进行革兰氏染色、耐盐性试验(质量百分含量为10％的NaCl的水溶液)、甲基红试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、接触酶试验、纤维素分解试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验和碳源利用实验(其中，碳源为木糖、麦芽糖、甘油或者甘露醇)，测定结果详见表1。表1中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表1 甘蔗内生生防细菌的生理生化特征
Figure BDA0002149263850000111
从表1可以看出，对甘蔗内生生防细菌进行革兰氏染色、耐盐性试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验和碳源利用实验的结果均为阳性。对甘蔗内生生防细菌进行甲基红试验、纤维素分解试验和硫化氢试验的结果均为阴性。
(3)16S rRNA鉴定：
将甘蔗内生生防细菌置于LB液体培养基中28℃、150rpm培养至对数期(即OD600为0.8)，以12000rpm离心5min，收集菌体。采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取菌体的基因组DNA。以提取的DNA产物为模板，用序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示的细菌16S rDNA扩增通用引物对从基因组DNA中扩增出16S rDNA基因片段。扩增出16S rDNA基因片段送上海生工生物工程有限公司进行测序。通过BLAST软件对测定的16S rRNA基因序列进行同源性比较。其中，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，其中，兼并碱基M表示A碱基或者C碱基；如SEQ ID No.2所示的序列为：5’-CTACGGRTACCTTGTTACGAC-3’，其中，兼并碱基R表示A碱基或者G碱基。
经比对，甘蔗内生生防细菌为Bacillus sp.，即为芽孢杆菌属。将甘蔗内生生菌于2019年5月9日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No:60662，分类命名：Bacillus sp.。
实施例2
药物制剂的制备
将芽孢杆菌GZG79(即甘蔗内生生防细菌，保藏号为GDMCC No：60662)接种到LB液体培养基中28℃、150rpm振荡培养16h后，每隔2h在超净工作台中取样测其在600nm处的OD(optical density，光密度)值。当OD值为0.8时结束培养，获得种子菌液。将种子菌液接种至LB液体培养液中28℃、150rpm发酵培养48h，收集发酵液，得到药物制剂。其中，种子菌液和LB发酵培养液的体积比为1:500。药物制剂中活菌浓度为1×109CFU/mL～1×1010CFU/mL。
实施例3
药物制剂的抑菌活性实验(平板对崎培养法)
1、药物制剂对玉米小斑病菌生长的影响
取0.1mL的实施例2的药物制剂(活菌总浓度为1×1010CFU/mL)接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的边缘。用打孔器在玉米小斑病菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。上述过程重复三皿，并计算抑菌带的宽度的平均值。同时，以仅接种玉米小斑病菌至PDA平板中进行培养作为对照。其中，接种药物制剂及玉米小斑病菌的培养皿培养结束后的图片如图1所示。图1中D1即为抑菌带的宽度。
从图1可以看出，接种药物制剂及玉米小斑病菌的培养皿出现明显的抑菌带，玉米小斑病菌的菌丝出现畸形，得到药物制剂对玉米小斑病菌的抑菌带的宽度为24.5mm，说明药物制剂能够明显抑制玉米小斑病菌的生长。
2、药物制剂对甘蔗梢腐病的病原菌的生长的影响
取0.1mL的实施例2的药物制剂(活菌总浓度为1×1010CFU/mL)接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的边缘。用打孔器在甘蔗梢腐病的病原菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。上述过程重复三皿，并计算抑菌带的宽度的平均值。同时，以仅接种甘蔗梢腐病的病原菌至PDA平板中进行培养作为对照。
经测定，药物制剂对甘蔗梢腐病的病原菌的抑菌带的宽度为15.5mm，甘蔗梢腐病的病原菌的菌丝出现畸形，说明药物制剂能够抑制甘蔗梢腐病的病原菌的生长。
3、药物制剂对葡萄灰霉病的病原菌的生长的影响
取0.1mL的实施例2的药物制剂(活菌总浓度为1×1010CFU/mL)接种于PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板)的边缘。用打孔器在葡萄灰霉病的病原菌的菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，将菌饼接种于PDA平板中央，25℃静置培养5天后测量抑菌带的宽度。上述过程重复三皿，并计算抑菌带的宽度的平均值。同时，以仅接种葡萄灰霉病的病原菌至PDA平板中进行培养作为对照。
经测定，药物制剂对葡萄灰霉病的病原菌的抑菌带的宽度为20.1mm，葡萄灰霉病的病原菌的菌丝出现畸形，说明药物制剂能够抑制葡萄灰霉病的病原菌的生长。
实施例4
药物制剂对玉米小斑病的防治效果
1、药物制剂对玉米的保护作用
(1)实验分为两组，分别为实验组和对照组，每组15株玉米。
(2)实验过程：
(a)实验组：
将玉米在温室(温度为20～25℃)中播种，按照正常培养，玉米的品种为甜玉米“奥兰多”。待玉米生长至三叶期时，将实施例2得到的药物制剂采用叶面喷雾方法喷施于玉米叶片表面。药物制剂中活菌总浓度为1×1010CFU/mL。喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准。药物制剂喷施结束后，在25℃下培养24h后采用叶片喷雾法将玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液喷施于玉米叶片表面。玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液含有1×105个分生孢子/mL。喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准。玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液喷施结束后，在25℃下保湿培养7天。
(b)对照组：对照组的操作过程与实验组的大致相同，不同之处在于，采用无菌水替代药物制剂；且玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液喷施结束后，在25℃下保湿培养7天。
(3)检测：
每组培养结束后，观察其玉米的病害的发生情况，记录叶片发病率和严重度，并按照如下公式1和公式2计算病情指数和防治效果，并计算各组相关参数的平均值。
其中，玉米小斑病的病情分级标准详见表2；
公式1为：病情指数＝∑(发病叶片数×病级数)/(总叶片数×最高病级数)×100；
公式2为：防治效果(％)＝(对照组的病情指数-实验组的病情指数)/对照组的病情指数×100％；
测定结果详见表3。
表2 玉米小斑病的病情分级标准
级别 症状
0级 叶片无病斑
3级 叶片上少量病斑，病斑面积占叶面积的6％～10％
5级 叶片上病斑较多，病斑面积占叶面积的11％～30％
7级 叶片上大量病斑，病斑面积占叶面积的31％～70％
9级 叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死
表3 药物制剂对玉米小斑病的保护作用
Figure BDA0002149263850000151
Figure BDA0002149263850000161
从表3可以看出，药物制剂对玉米小斑病的防治效果为83.9％，说明药物制剂对玉米小斑病具有较好的保护作用。
2、药物制剂对玉米的治疗作用
(1)实验分为两组，分别为实验组和对照组，每组15株玉米。
(2)实验过程：
(a)实验组：
将玉米在温室(25℃)中播种，按照正常培养，玉米的品种为甜玉米“奥兰多”。待玉米生长至三叶期时，采用叶片喷雾法将玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液喷施于玉米叶片表面。玉米小斑病菌的分生孢子悬浮液含有1×105个分生孢子/mL。喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准。分生孢子悬浮液喷施结束后，在25℃下培养24h后，将实施例2得到的药物制剂采用叶面喷雾方法喷施于玉米叶片表面。药物制剂中活菌总浓度为1×1010CFU/mL。喷雾标准是每片叶子上有雾状液滴分布，以不掉下为准。药物制剂喷施结束后，在25℃下保湿培养7天。
(b)对照组：对照组的操作过程与实验组的大致相同，不同之处在于，采用无菌水替代药物制剂；且无菌水喷施结束后，在25℃下保湿培养7天。
(3)检测：
每组培养结束后，观察其玉米的病害的发生情况，记录叶片发病率和严重度，并按照上文的公式1和公式2计算病情指数和防治效果，并计算各组相关参数的平均值。其中，玉米小斑病的病情分级标准详见表2；测定结果详见表4。
表4 药物制剂对玉米小斑病的治疗作用
Figure BDA0002149263850000162
Figure BDA0002149263850000171
从表4可以看出，药物制剂对玉米小斑病的防治效果为64.4％，说明药物制剂对玉米小斑病具有较好的治疗作用。
综上所述，上述甘蔗内生生防细菌及其发酵液能够拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌和小斑病菌，且能够防治小斑病、灰霉病和梢腐病，能够用于制备拮抗小斑病菌、灰霉病和梢腐病的药物及防治小斑病、灰霉病和梢腐病的药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）
<120> 甘蔗内生生防细菌及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacggrtac cttgttacga c 21

Claims (10)

1.一种甘蔗内生生防细菌，其特征在于，所述甘蔗内生生防细菌属于芽孢杆菌属，所述甘蔗内生生防细菌的保藏号为GDMCC No：60662。
2.权利要求1所述的甘蔗内生生防细菌在制备防治小斑病、灰霉病或者梢腐病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述防治小斑病、灰霉病或者梢腐病为拮抗梢腐病的病原菌、灰霉病的病原菌或者小斑病菌；
所述小斑病为玉米小斑病，所述梢腐病为甘蔗梢腐病，所述灰霉病为葡萄灰霉病。
4.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的甘蔗内生生防细菌。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为所述甘蔗内生生防细菌的发酵液。
6.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂在使用时，所述甘蔗内生生防细菌的使用浓度为1×109CFU/mL~1×1010CFU/mL。
7.一种药物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求1所述的甘蔗内生生防细菌，收集培养液，得到药物制剂。
8.权利要求1所述的甘蔗内生生防细菌、权利要求4~6任一项所述的药物制剂或者权利要求7所述的药物制剂的制备方法制备得到的药物制剂在防治小斑病、灰霉病或者甘蔗梢腐病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘蔗内生生防细菌的使用方法为：将所述甘蔗内生生防细菌配制成菌悬液后喷洒至植物的叶片上。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的使用方法为：将所述药物制剂喷洒至植物的叶片上。
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