KR20080095652A - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제 - Google Patents

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 속 (Bacillus spp .) 균주를 포함하는 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물병원성 세균 및 진균에 대하여 길항능력을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2) 균주, 이의 대량 배양 기술 및 이를 포함하는 식물의 진균 방제용 조성물 및 이의 제형화 기술에 관한 것이다.
결구상추 균핵병, 생물농약, 바실러스

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 및 이를 함유하는 제제{NOVEL STRAIN OF Bacillus amyloliquefaciens AND FORMULATION CONTAINING THE SAME}
도 1은 경상남도 의령군 소재의 결구상추 이병 조직으로부터 분리된 균핵병원균(Sclerotinia spp.)을 보여주는 것이다 (E: Sclerotinia sclerotiorum, F: Sclerotinia minor, G: Sclerotinia rolfsii).
도 2는 균핵병원균(Sclerotinia sp. YR-1)의 형태학적 특성을 보여주는 것으로, A는 PDA배지에서의 균핵병원균의 균핵과 균총, B는 균핵으로부터 생성된 자낭반(Apothecia), C는 자낭(Asci), D는 자낭포자(Ascospores)의 모습이다.
도 3은 결구상추에서의 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum YR-1)의 접종원 처리량에 따른 병원성 검정 결과를 보여주는 것이다 [A: 80 ml; B: 60 ml; C: 40 ml; D: 20 ml; E: 대조구(무처리구)].
도 4는 결구상추에서의 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1) 접종원의 농도에 따른 병원성 검정 결과를 보여주는 것이다 [A, A550=0.2; B, A550=0.4; C, A550=0.6; D, A550=0.8].
도 5는 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 다양한 길항균의 균사 생육 억제 효과를 보여주는 것이다 [A: A-2; B: A-7; C: RH-1; D: RH-2; E: RH-3; F: RH-4; G: S-8; H: R-13; I: R-26; J: R-39].
도 6은 결구상추 균핵병(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 다양한 길항균의 생육실내 방제 효과를 보여주는 것이다 [A, A-2; B, A-7; C, R-13; D, R-26; E, R-39; F, RH-1; G, RH-2; H, RH-3; I, RH-4; J, BW13; K, CAA2; L, S-8; M, 병원균 단독처리구; N, 무처리구].
도 7은 결구상추 균핵병(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 다양한 길항균의 생육실내 방제 효과를 보여주는 것이다 [A, BJ 2-2; B, BJ-4; C, Pro-EB-15; D, Pro-EB-17; E, Pro-EC-3; F, Pro-EC 8; G, Pro-EC 10; H, 병원균 단독처리구; I, 무처리구].
도 8은 최종 선발 길항균에 의한 결구상추 균핵병(S. sclerotiorum YR-1)의 생육실내 방제 효과를 보여주는 것이다 [A, A-2; B, A-7; C, RH-4; D, Pro-EC 3; E, Pro-EB-15; F, Pro-EB-17; G, 병원균 단독 처리; H, 무처리구].
도 9는 길항균(A-2, A-7,RH-4)의 단독 또는 혼합처리에 의한 결구상추 균핵병원균의 생육실내 방제 효과를 보여주는 것이다 [A, A-2; B, A-7; C, RH-4; D, A-2+A-7; E,A-7+RH-4; F, A-2+RH-4; G, A-2+A-7+RH-4; H, 병원균 단독 처리; I, 무처리구].
도 10은 길항균 A-7 균주의 전자현미경(TEM, Transmission electron micrograph) 사진이다(A, 125,000 배율; B, 40,000 배율).
도 11은 16S rDNA 서열을 통한 계통분석(PAUP program) 결과를 보여주는 것이다.
도 12는 gyrA 서열을 통한 계통분석 결과를 보여주는 것이다.
도 13은 B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생장 곡선을 보여주는 것이다 (NB 배지, 30℃, 48시간).
도 14는 B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생장에 미치는 온도의 영향을 보여주는 것이다 (NB 배지, 24 시간).
도 15는 B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생장에 미치는 pH의 영향을 보여주는 것이다 (NB 배지, 24 시간).
도 16은 B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 9종 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정 결과를 보여주는 것이다 [A, A7-6 제제; B, A7-7 제제; C, A7-8 제제; D, A7V 제제; E, 화학농약(chemical fungicide, Benomyl); F, 병원균 단독(Pathogen); G, A7-1 제제; H, A7-2 제제; I, A7-3 제제; J, A7-4 제제; K, A7-5 제제].
도 17은 B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 5종의 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 생육실내 폿트상에서의 방제효과 재검정 결과를 보여주는 것이다 [A, A7V 제제; B, 화학농약 베노밀(Benomyl); C, 병원균 단독(Pathogen); D, 무처리구; E, A7-2 제제; F, A7-4 제제; G, A7-6 제제; H, A7-7 제제].
도 18은 BW13-A 제제와 A7-2 제제의 단독 및 혼합처리에 의한 균핵병과 밑둥썩음병의 생육실내 폿트에서의 동시방제효과 검정 결과를 보여주는 것이다 [A, 무처리구; B, 균핵병원균 단독접종(SS); C, 밑둥썩음병원균 단독접종(RS); D, 균핵병원균과 밑둥썩음병의 동시접종(SS+RS); E, 화학농약(Benomyl)+균핵병원균 접 종(SS); F, 화학농약(Pencycuron) + 밑둥썩음병원균(RS); G, A7-2 제제+균핵병원균과 밑둥썩음병의 동시접종(SS+RS); H, BW13-A 제제 + 균핵병원균과 밑둥썩음병의 동시접종(SS+RS); J, (A7-2 제제+BW13-A 제제)+(균핵병원균과 밑둥썩음병의 동시접종(SS+RS)].
도 19는 경상남도 의령군 균핵병 자연병발생지역의 플라스틱 하우스에서의 2종 수화제형 제제에 의한 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정 결과를 보여주는 것이다(2005).
도 20은 저장기간 및 희석배수별 농도에 따른 A7-2제제의 결구상추 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum YR-1)에 대한 균사생육억제 효과를 보여주는 것이다 (도20A, 3월/8월 ; 도20B, 100배/500배/1,000배 희석배수별 농도).
[발명이 속하는 기술 분야]
본 발명은 진균에 대해 길항능력을 갖는 바실러스 속 (Bacillus spp.) 균주를 포함하는 미생물 제제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물병원성 세균 및 진균에 대하여 길항능력을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2) 균주, 이의 대량 배양 기술 및 이를 포함하는 식물의 진균 방제용 조성물 및 이의 제형화 기술에 관한 것이다.
[종래 기술]
결구상추는 국내에서 가장 많이 재배되고 있는 양채류 중의 하나로 가장 많은 재배면적과 생산량을 차지하며, 94 내지 95%의 수분과 탄수화물·조단백질·조섬유· 비타민C 등을 다량 함유하여, 노약자 및 어린이에게 좋은 것으로 보고 되어 있다(유태웅, 1997). 우리나라에서는 주로 쌈과 샐러드로 소비되고 있는데 다른 일반 채소류에 비하여 수분이 많은 편이며 칼슘과 무기염류가 다량 함유되어 있고 비타민 함량도 상당히 높은 편이다. 또한, 상추에는 독특한 쓴맛이 있는데, 그 주성분이 lactucerin, lactucin, lactucic acid 등인데, 이것은 일종의 알칼로이드 류로서 아편과 유사한 성질이 있어 최면·진통제로 사용되기도 하며, 상추쌈을 먹으면 수면 유도 효과가 있어서 숙면을 취할 수 있는데 이는 이 성분들의 작용 때문이다. 또한, 최근 햄버거 및 육류 등의 가공식품의 소비가 증가하면서 매년 생산량과 소비량이 증가하고 있는데, 생산된 결구상추의 주 소비처는 최근 식생활 변화 추세에 따라 대중화되면서 일반가정 소비가 약 35%, 관광호텔 및 고급 음식점이 약 35%, 그리고 군납이 약 30% 정도로 추정되고 있다.
결구상추는 고냉지권(해발 600m이상)에서는 1∼2기작 재배를 하고 있으며, 2기작 재배를 위해서 보통 5월 초순에 재식하여 6월 중하순에 수확하고, 두 번째 재식은 6월 하순이나 7월 초순에 재식하여 8월 중하순에 수확하는 작형을 주로 하고 있다. 여름철 결구상추의 수확기에 따라 가격의 진폭이 큰 편으로, 수확기의 가격조사 및 생산 동행을 면밀히 파악할 필요가 있다. 또한, 안정적 생산 할 수 있는 품종 선택이 중요하다. 기존의 보급된 품종들은 100% 외국에서 수입되고 있는 형편이며, 원래 육성지가 서늘하고 건조한 기후조건에서 육성된 특성을 갖고 있는 관계로, 우리나라처럼 여름철 장마기인 고온 다습한 환경에 적합한 품종의 선택이 좁은 것이 사실이다. 현재 도입 재배되고 품종들이 일본 및 미국에서 도입된 품종들인 유레이크, 텍사스그린, 사크라멘트, 시스코 등이 대부분 차지하고 있다. 사크라멘트와 시스코는 여름철 보다는 겨울철 재배에 적합한 것으로 알려져 있다. 따라서 여름철 재배에 적합한 품종을 선택하는 것이 무엇보다도 중요하며 여름철 재배시 가장 유념할 것은 고온기 재배로 인한 추대와 다습으로 인한 무름병 및 균핵병 방제에 주의를 기울여야한다.
최근 결구상추는 시설 재배를 통하여 연중 재배되고 연작과 하우스내의 다습 조건 때문에 균핵병이 대량 발생으로 결구상추의 수량과 품질이 저하되어 방제 대책이 시급한 실정에 있다. 경상남도의 결구상추 재배지인 하동과 의령군의 시설재배지에서는 재배기간인 9월 중순부터 익년 5월 초까지 처음에는 그루 땅가 부위에 수침상, 담갈색, 부정형의 병반이 생기고 차츰 잎 위쪽과 안쪽으로 진전되면서 물렁하게 썩고 결국 그루 전체가 썩어 말라 죽으며, 병반에는 처음에 흰 솜 모양의 균사가 자라고 후에 부정형의 검은 균핵이 형성되는 전형적인 균핵병의 증상이 발생되었다. 동일 국화과인 상추(잎상추) 균핵병에 관해서는 이미 보고되어 있으나, 결구상추 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum)은 국내 미기록 병해이며 국내외적으로 연구가 매우 미흡하다.
균핵병(Sclerotinia rot)은 S. sclerotiorum에 의해 발생하는 다범성 병해로 많은 채소류와 화훼 류 그리고 일부 관목에도 심각한 피해를 준다. 균핵병은 전세계적으로 분포하며 유묘기와 성숙기 등의 모든 생장단계에 걸쳐 발생되며 수확 후 운송과 저장 중에서도 발생한다. 고랭지 채소재배지, 십자화과 채종지, 유채재배지, 시설원예재배지에서 많이 발생하는데, 특히 시설재배 엽채류에 발생하여 많은 피해를 초래하고 있으며, 방제에 어려움을 격고 있다. 이 병의 가장 뚜렷하고 전형적인 표징은 균핵으로 발달할 하얀 솜털 같은 균사체가 감염된 식물체상에 형성하는 것이다. 상추와 셀러리, 무와 같은 식물들의 잎과 엽병은 균핵 병원균이 줄기와 하위엽들을 감염시킴에 따라 갑작스레 붕괴되고 죽게 되며 또한 줄기를 통해 급속히 침해하고 전반되어 식물체가 고사한다. 균총과 균핵은 보통 바깥쪽 잎의 표면에 나타나지만 습한 조건에서는 식물체를 침해하여 썩히고 전 식물체 상에 하얀 솜털 같은 균사체가 생장한다. 균핵병원균은 감염된 조직에서 균핵으로 월동하거나 지면위에 떨어진 균핵으로 월동한다. 균핵은 발아하여 컵모양의 자낭반이 형성되고 자낭반에 자낭과 자낭포자를 형성한다. 자낭반으로부터 수많은 자낭포자들이 대기 중으로 방출되어 감염을 일으키는데, 시설재배 등에서는 균핵의 발아로 균사에 의한 감염이 주로 이루어진다.
그러나, 지금까지 결구상추 균핵병 방제를 위한 화학약제는 알려진 바가 없으며, 농가에서는 주로 프로파, 베노밀 등의 약제를 이용하여 살포하고 있으나 그 효과가 매우 미미한 상태이다.
식물의 병해충 방제에는 친환경적인 기술이 보급되도록 추진되고 있는데, 생물농약은 그 동안 경제성과 제제의 제조방법 및 사용 방법상의 문제 등으로 인해 대규모로 생산되지는 못하였다. 최근 식물병의 생물학적 방제 연구가 활기를 띠어 미생물 제제의 실용화 가능성으로 외국에서는 길항 진균과 세균을 이용한 미생물 농약에 대하여 많은 개발이 이루어지고 있다(Cook and Baker, 1983; Kim 등, 1990; Dandurand 등, 2000; Jack and Robert, 1998; Jack and Robert, 2001). 균핵병의 생물학적 방제 인자로서 Coniothyrium minitans (Whipps and Gerlagh, 1992), Serratia plymuthica (Merav 등, 2003), Ulocladium atrum(Li 등, 2003), Pseudomonas fluorescens(Pedras 등, 2003), Bacillus megaterium N4 (이재필 등, 2002), Nostoc strain ATCC 53789(Biondi 등, 2004) 등이 보고된 바 있다.
현재 전세계 생물농약시장은 7000억원 정도로 소규모이지만 매년 12%정도의 고속성장을 지속하고 있으며, 특히 미생물농약 분야는 년간 15 내지 20%의 고속성장을 지속할 것이라고 예측하고 있다(농경과원예사, 2001; Steve, L, 1999; Knight 등, 1997).
따라서, 본 발명에서는 결구상추 균핵병을 포함한 엽채류의 균핵병에 대한 뚜렷한 방제 약제가 현재까지 알려진 바가 없으므로, 균핵병 방제용 미생물 농약을 개발하여 국내의 결구상추 생산 효율을 증대시켜 농가 소득 향상은 물론 전반적인 농업경쟁력 재고에 기여하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물병원균, 바람직하게는 결구상추 균핵병원균 및/또는 밑둥썩음병원균에 대하여 방제효과를 갖는 신규 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주 및 이의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물 및 이를 이용한 균 또는 진균의 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물 및 이를 이용한 균 또는 진균의 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주, 이의 배양 및 생산 방법, 이를 이용한 식물병 방제용 조성물 그리고 이의 제형화 방법 및 방제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2) 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물 그리고 이의 제형화 방법 및 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (B. amyloliquefaciens A-7) 균주 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (B. amyloliquefaciens A-2) 균주는 특히 결구상추 균핵병 및/또는 밑둥썩음병에 대하여 탁월한 방제효과를 가지고 있 어, 결구상추 균핵병 및/또는 밑둥썩음병 등의 식물병을 예방하는 생물농약으로 유용하다.
본 발명자들은 결구상추 균핵병원균(Sclerotinia spp.) 및/또는 밑둥썩음병원균 (Rhizoctonia solani)에 대한 길항균으로 선별된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (B. amyloliquefaciens A-7) 균주 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (B. amyloliquefaciens A-2) 균주가 결구상추의 균핵병 및/또는 밑둥썩음병의 방제에 우수한 효과가 있음을 밝혀서 본 발명을 완성하였다.
우선, 본 발명은 식물병원성 세균 및/또는 진균에 대하여 우수한 방제 효과를 갖는 신규한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (B. amyloliquefaciens A-7) 균주를 제공한다. 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (B. amyloliquefaciens A-7) 균주는 특히 균핵병 및/또는 밑둥썩음병에 우수한 방제효과를 보이는 것으로 분리 및 동정된 신규한 균주로서, KACC 91272P의 수탁번호를 부여받았다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 배양 방법에서 사용된 배지는 일반적으로 사용되는 바실러스균 배양 배지에 글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분, 셀로바이오스 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원 및 제빵개량제, 쌀전분, 미강, 현미유 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원이 0.5 내지 10%(w/v), 보다 바람직하게는 1 내지 5 %(w/v)의 양으로 추가로 첨가된 것일 수 있다. 배지내 탄소원의 함량이 상기 범위보다 많으면 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적으면 탄소원의 별도 공급으로 인한 상승효과가 미미하게 된다.
또한 상기 배지는 적절한 질소원을 추가로 함유할 수 있으며, 상기 질소원으로 사용가능한 물질은 배양균에 질소를 공급할 수 있는 모든 물질이 가능하며, 예컨대, 효모 추출액 및 질산암모늄으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 배지 내 질소원의 함량은 0.05 내지 1.0% (w/v)일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5%(w/v)인 것이 좋다. 배지내 질소원의 함량이 상기 범위보다 많으면 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적으면 질소원의 별도 공급으로 인한 상승효과가 미미하게 된다. 또한, 상기 배지는 상기 탄소원 및 질소원을 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 있어서, 배양 온도는 20 내지 35℃인 것이 좋고, 배양 pH는 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7인 것이 좋으며, 배양 시간은 24시간 이내로 하는 것이 좋으며, 보다 바람직하게는 10 시간 내지 24시간인 것이 좋다. 상기 온도, pH 및 시간의 범위는 실험상 최적 조건으로 얻어진 수치이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 또는 이의 배양물을 포함하는 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물을 제공한다.
상기 식물병원성 세균은 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani) 뿐 아니라, 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으 로부터 선택된 한 가지 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용 가능한 식물은 상기한 세균, 특히, 균핵병 및/또는 밑둥썩음병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 토마토, 딸기, 결구상추 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 미생물 조성물은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주 자체를 포함하는 것일 수 있고, 이를 특정의 배지에서 특정 조건하에서 배양하여 얻어진 배양물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 배양물은 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주를, 글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분, 셀로바이오스 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원 및 제빵개량제, 쌀전분, 미강, 현미유 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 탄소원 중에서도 현미유가 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주의 생장 촉진 및 식물 병원균 증식 억제에 효과적인 것으로 나타났다. 본 발명에 있어서 배지에 첨가되는 탄소원의 함량은 0.5 내지 10 % (w/v)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 내지 5 %(w/v)일 수 있다. 배지내 탄소원의 함량이 상기 범위보다 많으면 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적으면 탄소원의 별도 공급으로 인한 상승효과가 미미하게 된다.
또한, 상기 배지는, 탄소원 이외에도, 적절한 질소원을 추가로 함유할 수 있으며, 상기 질소원으로 사용가능한 물질은 배양균에 질소를 공급할 수 있는 모든 물질이 가능하며, 예컨대, 효모 추출액 및 질산암모늄으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 배지 내 질소원의 함량은 0.05 내지 1%(w/v)일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 %(w/v)인 것이 좋다. 배지내 질소원의 함량이 상기 범위보다 많으면 타 영양물질의 결핍이 생길 수 있으며, 상기 범위보다 적으면 질소원의 별도 공급으로 인한 상승효과가 미미하게 된다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식물병원성 세균 및/또는 진균의 방제용 조성물은 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하여 제형화된 것일 수 있다. 상기 제형화된 조성물은 분무 등의 손쉬운 방법으로 식물체에 용이하게 적용될 수 있는 수화제형 또는 액상 수화제형인 것이 바람직하다.
상기 생체 고분자 물질은 미생물 조성물의 액상 수화제형 제조시 제형화를 위한 전달매체로 사용되며, 투명하면서도 약흔을 남지기 않고 적절한 점성을 유지할 수 있도록 하는 것으로, 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 제오실 등으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 본 발명의 조성물 내 생체 고분자 물질의 함량은, 제형화된 조성물이 투명하면서도 약흔을 남지기 않고 적절한 점성을 유지할 수 있도록, 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 30 내지 50 중량부인 것이 좋다.
상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 함량은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 2 내지 10 중량부, 바람직하게는 3 내지 7 중량부인 것이 좋다. 또한 상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 함량은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주 또는 이의 배양물 100 중량부에 대하여 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 1.5 내지 3.5 중량%인 것이 좋다. 이때, 수크로오스는 길항세균의 영양원이 되며, 현미유 및 올리브유는 세균을 피막화시켜 자외선으로부터 세균을 보호하고 제제 성분들이 잘 섞이게 하는 유화제로서의 역할을 하는 것으로 사료된다.
본 발명의 제형화된 조성물은 식물병원성 세균 및 진균에 대한 우수한 방제 효과를 가질뿐만 아니라, 생체에 유해한 화학물질을 포함하지 아니하여 매우 안전하며, 실온에서 3개월 이상 장기간 보관하여도 미생물 개체수가 안정적으로 유지될 수 있어서 보관 안정성도 우수하다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 식물병원성 세균 및/또는 진균을 방제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방제 방법에 있어서, 상기 조성물의 적용 농도는 적용 대상 작물, 해충 분포 정도 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있으며, 일반적으로 10배 내지 1000배, 바람직하게는 100배 내지 500배로 희석되어 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법이 적용 가능한 식물병원성 세균은 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani) 뿐 아니라, 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 탄저병(Collectrichum fragariae), 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 한 가지 이상일 수 있다. 상기 방제 방법이 가능한 식물은 상기한 세균, 특히, 균핵병 및/또는 밑둥썩음병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 토마토, 딸기, 결구상추 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 식물병원균에 대하여 방제 효과가 있는 것으로 선별된 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 세균 및 진균 방제용 조성물을 제공한다. 상기 식물 병원성 세균 및 진균은 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 배양물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주를 글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분 및 셀로바이오스로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원; 및 제빵 개량제, 쌀전분, 미강 및 현미유로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하 여 얻어진 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 효모추출액 및 질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 질소원을 추가로 함유하는 것일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 배지는 현미유, 현미유+효모추출액 및 현미유+질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 배지에 첨가되는 탄소원 및 질소원의 함량은 상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P)에서 설명한 바와 같다.
상기 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 조성물은 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 생체 고분자 물질은 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 및 제오실로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이고, 상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이며, 상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (KACC 91262P) 균주의 배양물, 및 상기 배양물 100 중량부에 대하여 타피오카전분 30 내지 50 중량부, 올리브오일 2 내지 10 중량부 및 수쿠로오스 1 내지 5 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 탄저병원균(Collectrichum fragariae) 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물병원성 세균 또는 진균의 방제 방법을 제공한다. 상기 방제 방법이 가능한 식물은 상기한 세균, 특히, 균핵병 및/또는 밑둥썩음병이 발생하는 모든 식물체일 수 있으며, 예컨대, 토마토, 딸기, 결구상추 및 배추 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 균핵병 병원균 분리 및 동정
균핵병이 발생한 경상남도 의령군 부림면 신반리와 경상남도 하동군의 결구상추 재배 플라스틱 하우스에서 균핵병이 걸린 결구상추를 채집하여 잎, 줄기, 뿌리의 각 부위의 면적을 1cm2가 되도록 잘라 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, Difco, USA)와 스트렙토마이신(Streptomycin)이 50 ㎍/㎖ 첨가된 물한천배지(Water Agar)에 올려 25℃항온기에 배양하여 분리하였다. 상기 분리된 균핵병원균의 동정 을 위하여, 균핵 크기, 균핵 수 그리고 균핵의 분포에 따라서 동정하였고, 정확한 분류를 위하여 자낭반 크기, 자낭반 모양, 자낭반 수, 자낭포자 크기, 자낭포자 수, 자낭포자내의 핵 수도 조사하였다.
자낭반 형성을 위해 먼저 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, USA) 배지에 생성된 균핵을 암조건의 0℃에서 한 달간 방치한 후 500 ml의 삼각 플라스크에 공극이 있는 모래를 넣고 충분히 수분을 가하여 2 일간 살균한 다음, 여기에 균핵을 5개 내지 7개 정도 0.5㎝ 깊이로 모래속에 심고 면솜으로 막은 뒤, 15℃에서 광/암(12시간/12시간)상에서 1 내지 2개월 동안 교호 배양하였다. 1개월 뒤 생성된 자낭반을 현미경하에서 관찰하였는데, 140여 분리균 중 약 80여 균주가 S. sclerotiorum로 동정되었으며 전형적인 S. sclerotiorum의 균핵이 관찰되었다(도 1, 도 2의 A).
이들 중 공시 병원균인 YR-1 균주의 배양적 특성은 균총 색깔이 무색에서 흰색으로 변하였으며, 불규칙한 검은색의 균핵이 petridish 당 14∼23개 정도 형성되었다. 균핵의 크기는 2.1 내지 5.5 x 2.0 내지 4.4 mm으로 크고 굵었으며, 균핵의 분포는 균총의 가장자리에 주로 형성되었는데 형태는 구형 또는 납작한 타원형이거나 부정형이였다(도 2의 A).
좀 더 정확한 동정을 위해, 균핵을 습한 모래 속에 넣고 15℃ 항온기에서 1달간 배양하여 자낭반 형성 및 자낭포자를 관찰하였다. 그 결과, 균핵으로부터 1 내지 2개씩의 자낭반이 형성되기 시작하여 40일 후에는 균핵 한 개당 1 내지 5 여개의 자낭반을 관찰할 수가 있었다. 자낭반은 컵모양으로 크기는 1.5 내지 3.9 mm 이었고, 자루는 가늘고 원통형이며 크기는 7.9 내지 18.2 mm이었으며, 두부는 원반모양으로 황갈색이고, 크기는 0.7 내지 2.1 mm이었다. 얻어진 자낭반에 대한 데이터를 하기의 표 1에 나타내고, 그 모양을 도 2의 B에 나타내었다.
자낭반에는 무수히 많은 자낭이 존재하였으며, 자낭의 크기는 100.0 내지 165.0 x 7.5 내지 12.5 ㎛이고 원통형으로 자낭안에 자낭포자가 8개 들어있으며, 측사는 실 모양이었다. 얻어진 자낭에 대한 데이터를 하기의 표 1에 나타내고, 그 모양을 도 2의 C에 나타내었다.
자낭포자는 난형 또는 타원형으로 단세포이며, 무색이고 크기는 11.5∼23.0 ㅧ 5.0∼10.0 μm이었으며 자낭안의 핵수는 2개이었다. 얻어진 자낭포자에 대한 데이터를 하기의 표 1에 나타내고, 그 모양을 도 2의 D에 나타내었다.
또한, 삼각플라스크 안에서 형성된 성숙한 자낭반을 건드리면 자낭포자가 연기처럼 수많이 비산되는 것을 관찰할 수가 있었다. 이상과 같이 병징과 병원균의 균학적 특징으로 분류, 동정한 결과 Mordue(1972)에 의해 보고된 Sclerotinia sclerotiorum의 특징과 일치하였고, 따라서, 상기에서 얻어진 균주는 Sclerotinia sclerotiorum로 동정되었으며, S. sclerotiorum YR-1로 명명하였다 (표 1).
[표 1] 결구상추로부터 분리된 균핵병원균(Sclerotinia sp. YR-1)의 형태적 및 배양적 특성
YR-1 S. sclerotiorum a
구분 특성 비교
균핵(Sclerotium) 양상 14∼23/페트리디쉬
색깔 검정 검정
형태 둥근형, 불규칙형a 둥근형, 불규칙형
크기 2.1∼5.5×2.0∼4.4 mm
자낭반(Apothecium) 양상 1∼5/균핵
형태 컵 모양 컵 모양
직경 1.5∼3.9 mm
길이 7.9∼18.2 mm 0.5∼2cm
폭 0.7∼2.1 mm
자낭(Ascus) 형태 원통형 원통형
크기 100.0∼165.0×7.5∼12.5 ㎛ 80∼250×4.5∼22.5 ㎛
자낭포자(Ascospore) 형태 타원형, 둥근형 타원형, 둥근형
크기 11.5∼23.0×5.0∼10.0 ㎛ 9∼13×4∼6.5 ㎛
핵수 1∼2
색깔 무색 무색
a Described by Udagawa et al., (1980)
추가로 공시 병원균 S. sclerotiorum YR-1의 배양적 특성을 확인하기 위하여 증식온도를 조사하였는데, 20℃ 내지 25℃에서 균핵 형성이 가장 빨랐으며 균핵 크기도 가장 크고 갯수도 많았다. 반대로, 10℃와 15℃에서는 균사 증식이 거의 일어나지 않았고, 30℃에서는 증식이 다소 늦는 경향이었다. 이때, 균핵의 크기와 수는 매우 작았고 나타나는 시기도 매우 늦었다. 35℃에서도 역시 증식이 매우 늦고 저조하였으며 균핵 형성이 관찰되지 않았다. 상기의 결과를 하기의 표 2에 정리하였다. 결과적으로 YR-1균주의 최적 증식온도는 20℃∼25℃로 확인되었다.
[표 2] 온도에 의한 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)의 균사 생장 및 균핵 형성에 미치는 영향
온 도 (℃)
10℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃
균사생육 - - +++ +++ ++ +
균핵 크기 (mm) - - 4.2×3.6 4.8×3.8 2.3×2.5 -
균핵 수 - - 19 18 10 -
균핵형성 기간 (일) - - 10 10 15 -
<실시예 2> 균핵병원균의 병원성 검정
상기 분리 균주 중 예비실험에서 병원성이 강한 것으로 확인된 S. sclerotiorum YR-1 균주의 균사조각부유액을 농도별로 접종하여 최적처리량과 처리농도을 선발하고 병원성 검정을 수행하였다. 이때, 균사조각부유액은 PDA 배지에 이식한 YR-1 균주를 항온기에 4 내지 5일간 배양(암, 25℃)하고 절취한 균사절편(직경 1 cm)을 PDB 배지 (Potato Dextrose Broth, Difco, USA)에 100 ㎖ 당 5개씩 넣고 3 내지 4일간 진탕배양(25℃, 150 rpm)하였다.
배양된 균사를 걸러내어 탈이온수로 5회 정도 세척한 후, 블랜더(Warning, USA)로 15초간 균사를 절단하여 포트당 농도가 각각 A550=0.4, 0.6, 0.8 및 1.0이 되도록 3차 살균수로 조정하여 결구상추에 처리하였다. 또한, 상기 배양 균사(A550 =0.8)의 처리량을 한 포트 당 20, 40, 60, 및 80 ml로 하여 포트에 재식한 4주(파종 후 8주)된 결구상추 잎에 골고루 분무 살포 접종하였다. 접종 후 25℃, 상대습도 90% 이상의 생육실에서 7일간 배양하면서 매일 발병도(%)를 조사하여 최적 농도 및 처리량을 결정하였다. 각 처리구는 5포트씩 3반복으로 3회 조사되었으며 이를 평균하여 주당 발병도(%)로 표시하였다. 발병도(%)는 농약등록시험 기준과 방법에 따라 병반면적율을 조사하여 다음의 [식 1]에 따라서 발병도로 환산하였다(한국농약공업협회, 2001).
[식 1]
발병도(%) = (발병수 x 계수) x 100
4 x 엽수
상기 식 중, 계수는 하기의 기준에 따라서 결정하였다:
0- 발병무,
1- 병반면적율 1∼5%,
2- 병반면적율 5.1∼20%,
3- 병반면적율 20.1∼40%
4- 병반면적율 40% 이상.
(2-1) 접종원의 최적 처리량 선발
상기의 YR-1 균주의 균사조각부유액(A550 =0.8)을 처리량 별로 병원성 검정 후 최적처리량을 선발하였다. 무처리구를 대조구로 하였다. 이와 같이 얻어진 결과를 하기의 표 3 및 도 3에 나타내었다. 표 3 및 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 80 ml와 60 ml의 처리량에서는 2일째 이후부터 병이 발생하기 시작하여 5일째에 100%의 발병도를 나타내었으며, 40 ml처리에서는 3일째에 40% 발병도를 보이기 시작하여 7일째에 90%로 서서히 병이 진전되었다. 한편, 20 ml 이하의 처리량은 7 일째까지도 70%의 낮은 발병도를 나타내었다. 길항균의 방제효과 검정에서는 병원균의 접종량이 많을 때는 효과적인 검정이 어렵기 때문에 4 내지 5일째까지 60%의 발병도를 보인 40 ml을 접종원 최적 처리량으로 선발하였다.
[표 3] 병원성 검정을 위한 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)의 접종원 최적 처리량 선발 (폿트 검정)
ml/폿트 발병도 (%)a
1 일 2 일 3 일 4 일 5 일 6 일 7 일
80 0 30 70 90 100 100 100
60 0 20 60 80 100 100 100
40 0 0 40 60 60 80 90
20 0 0 30 40 40 60 70
Control 0 0 0 0 0 0 0
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
(2-2) 접종원의 최적처리 농도 선발
상기 YR-1 균주의 균사조각부유액을 농도별(A550=0.2, 0.4, 0.6, 0.8)로 접종하여 최적농도를 선발하였으며, 그 결과를 하기의 표 4 및 도 4에 나타내었다. 표 4 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, A550=0.2의 농도에서는 4일째부터 병이 발생하기 시작하여 11일째까지의 발병도가 46%였으며, A550=0.4와 0.6의 농도에서는 3일 째부터 병이 발생하기 시작하였지만, 11일째는 55%정도로 조금 낮게 나타났다. 한편 A550 =0.8의 농도에서는 3일째부터 병이 발생하기 시작하였으며 11일째의 발병도도 94%의 높은 발병도를 보였다. 따라서, 앞서의 접종된 최적 처리량과 농도 선발 결과와 함께 접종 농도 A550=0.4 또는 0.6의 농도에서 40 ㎖ 처리시 50%의 발병을 나타내는 ED50값에 가까워 이를 최적 접종농도 및 처리량으로 선발하였다.
[표 4] 병원성 검정을 위한 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1) 접종원의 적정 농도 선발 (폿트 검정)
처리농도 (A550) 발병도 (%)a
1일 2일 3일 4일 5일 7일 9일 11일
0.2 0.0 0.0 0.0 4.6 18.7 27.5 37.8 46.2
0.4 0.0 0.0 2.8 10.2 29.3 40.9 52.8 53.4
0.6 0.0 0.0 5.3 13.9 30.8 44.3 55.1 56.3
0.8 0.0 0.0 13.4 30.7 60.8 87.2 90.0 94.4
Control 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
<실시예 3> 길항 미생물의 분리
경상남도 의령군 부림면 신반리 결구상추 재배 포장에서 건전 결구상추를 채집하여 밑둥부위, 뿌리 및 근권토양 10 g을 살균수 50 ml와 각각 혼합한 후, 분쇄 기(Warning, USA)에서 10 내지 30초간 마쇄한 다음, Nutrient agar (NA) 배지 (Difco, USA)에 평판희석법으로 배양하였다. 각 시료는 30℃에서 48시간 배양한 후 세균 균총을 분리하여 순수배양하고 각 균주별로 균핵병원균에 대한 길항능을 조사하였다.
이때 1차 분리균 600 균주와 2차 분리균 102개 균주 등 모두 702 균주를 각각 PDA 배지에서 병원균 S. sclerotiorum YR-1 균주와 25℃에서 5 내지 7일간 대치배양하여 균사생장저지대(Inhibition zone)를 조사하여 저지대가 큰 세균을 길항균으로 1차 선발하였다. 1차 선발된 균핵병원균에 대한 길항균 10 균주를 각각 생육실 포트검정을 실시하여 균핵병 억제에 우수한 길항균를 2차 선발하였다.
2차 선발된 길항균의 균핵병에 대한 방제효과 검정은 NB 배지에 24시간 진탕배양한 각 길항균의 부유액(1x106 cfu/ml)을 1 포트당 100 ml씩 포트에 재식한지 4주(파종 8주)된 결구상추 잎에 골고루 분무살포한 다음 25℃의 생육실에 24시간 보관하고 여기에 PDB 배지에 진탕배양한 S. sclerotinia YR-1 균주의 균사조각부유액을 1 포트당 적정농도인 40 ml (A550=0.6)을 처리하여 생육실(25℃, 상대습도 90%)에 보관한 후, 6일째에 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였다.
상기 2차 선발 길항균 외에도 2차년도에 분리된 7 균주의 방제효과를 위와 동일하게 포트검정하여 방제가가 높은 균주를 우수길항균으로 3차 선발하였다.
그 결과, 건전 결구상추의 밑둥부위, 뿌리 및 근권 토양으로부터 총 702 균주를 분리하였으며 이들의 결구상추 균핵병원균 S. sclerotiorum YR-1에 대한 균사 생육저지효과를 조사한 결과, 최종적으로 10 균주가 높은 저지대를 보여 1차 길항균으로 선발되었다. 이와 같이 선발된 길항균과 이로부터 얻어진 균사생육저지대 측정 결과를 하기의 표 5 및 도 5에 나타내었다.
[표 5] 결구상추 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 길항균의 생육 억제 효과
길항균 균사생육저지대 (mm)a
A-2 9.6
A-7 9.8
RH-1 7.1
RH-2 7.2
RH-3 7.4
RH-4 9.6
R-13 7.2
R-26 8.5
R-39 8.2
S-8 7.2
a 7일간 대치배양(25℃) 후에 균사생육 억제정도를 측정하였음.
일차 선발 길항균 10 균주를 파종한지 4주된 결구상추에 처리하여 균핵병원균에 대한 방제효과를 생육실 포트 검정하였다. 그 결과, 상기 10 균주 중, A-2, A-7, RH-4 균주의 방제가가 각각 80%, 85%, 80%로 가장 높았으며 서로 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 따라서, 균핵병에 대한 우수 길항균으로 A-2, A-7, RH-4 3 균주를 생육실 포트 검정을 통해 2차 선발하였다. 상기 결과를 하기의 표 6 및 도 6에 나타내었다.
[표 6] 결구상추 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 1차 분리 길항균의 방제효과 검정
길항균 a 6 일 후
발병도 (%) 방제가 (%)
A-2 + Pa 20.0 80.0 ab b
A-7 + Pa 15.0 85.0 ab
RH-1 + Pa 50.0 50.0 de
RH-2 + Pa 40.0 60.0 cde
RH-3 + Pa 30.0 70.0 bc
RH-4 + Pa 20.0 80.0 ab
R-13 + Pa 55.0 45.0 e
R-26 + Pa 30.0 70.0 bc
R-39 + Pa 40.0 60.0 cde
S-8 + Pa 30.0 70.0 bcd
Pa alone 100.0 0.0 f
a Pa, 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)
b 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
지속적인 균주의 분리로 1차 분리된 총 702개 균주 외에 2차로 추가된 균주의 방제효과를 조사하였는데, 그 결과, Pro-EB-15 균주는 89.2%의 방제가로 앞서 1차 선발된 균주들보다 방제가가 높았으며, 다음으로는 Pro-EB-17 균주가 83.5%로 높았다. 그 다음으로는 Pro-EC-3 균주가 72.4%의 방제가를 보여 결국 Pro-EB-15균주, Pro-EB-17 균주 및 Pro-EC-3 균주를 우수 길항균으로 3차 선발하였다. 상기 선발된 길항균과 이들로부터 얻어진 방제가 결과를 하기의 하기의 표 7 및 도 7에 나타내었다.
[표 7] 결구상추 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 2차 분리 길항균의 방제효과 검정
길항균 방제가 (%)a
9 일 후
BJ 2-2 + Pac 59.4d
BJ-4 + Pa 55.1deb
Pro-EC-3 + Pa 72.4c
Pro-EC-8 + Pa 49.4de
Pro-EC-10 + Pa 46.1e
Pro-EB-15 + Pa 89.2ab
Pro-EB-17 + Pa 83.5b
Pathogen (Pa) only 0.0f
Control 100.0a
a 방제가 (%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
b 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05)
c Pa, 결구상추 균핵병원균 S. sclerotiorum YR-1
최종적으로, 상기 2차 선발된 3 균주(A-2, A-7, RH-4)와 3차 선발된 3 균주(Pro-EC-3, Prp-EB-15, Pro-EB-17)를 최종적으로 생육실에서 방제효과를 비교 검정한 결과, A-7 균주가 방제가 91.0%로 가장 높았으며, Pro-EB-15 균주가 90.1%로 다음으로 높았다. 그러나, A-7과 Pro-EB-15 균주의 방제가에는 서로 유의적인 차이가 없어서, 방제가가 다소 높은 A-7 균주를 균핵병 방제용 우수 길항균으로 최종 선발하였다. 상기 결과를 하기의 표 8 및 도 8에 나타내었다.
[표 8] 결구상추 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)에 대한 최종 길항균의 방제효과 검정
길항균 접종 후 7일째
발병도 (%)a 방제가 (%)b
A-2 + Pad 11.2 88.4 bc
A-7 + Pa 8.7 91.0 ab
RH-4 + Pa 12.3 87.2 b
Pro-EC-3 + Pa 17.4 81.9 b
Pro-EB-15 + Pa 9.6 90.1 ab
Pro-EB-17 + Pa 11.9 88.1 b
Pathogen (Pa) only 95.9 0.0 c
Control 0.0 100.0 a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가 (%) = (무처리구의 발병도-처리구의 발병도)/(무처리구의 발병도) x 100
c 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
d Pa, 결구상추 균핵병원균 S. sclerotiorum YR-1
<실시예 4> 길항균 혼합처리에 의한 방제효과 증진 검정
상기의 생육실 포트재배 검정에서 방제효과가 우수하여 2차로 선발된 길항균 A-2, A-7, RH-4 균주를 단독 또는 혼합 처리하여 방제 효과를 비교하였다.
상기 검정 실험은 실시예 3의 생육실 포트재배에서의 방제 효과 검정 방법과 동일한 방법으로 수행하였으며, 처리구로는 단독 처리구(A2, A7, RH4) 및 혼합 처리구(A2+A7, A7+RH4, A2+RH4, A2+A7+RH4)로 나누어 분무 살포하였으며, 24시간 후 병원균 YR-1 균주의 균사부유액을 처리하여 방제가를 조사하였다. 상기 혼합처리구는 총 처리량이 100 ml이 되도록 1:1 또는 1:1:1 로 동일하게 혼합하여 사용하였다. 이 중, A-2 균주를 2006년 7월 18일자로 대한민국 경기도 수원시 권선구 서둔동 225번지 소재하는 한국농업미생물자원센터에 기탁하였으며, KACC 91262P의 기탁번호를 부여받았다.
상기 실시예 3의 생육실 포트재배에서의 방제효과 검정과 동일하게 수행되었다. 그 결과, 혼합 처리구인 A-7+RH-4가 90%의 방제가로 방제 효과가 가장 우수하였으며, 다음으로는 단독처리구인 A-7와 RH-4, 및 혼합 처리구인 A-2+A-7의 방제가가 80%로 높았다. 그러나 이들간의 유의적인 차이는 없었다. 한편, 3개의 균주를 모두 혼합한 처리구인 A-2+A-7+RH-4는 방제가가 60%로 가장 낮은 것으로 나타났다. 상기 결과를 하기의 표 9 및 도 9에 나타내었다.
[표 9] 길항균의 단독 혹은 혼합처리에 의한 결구상추 균핵병의 생육실내 방 제효과 검정
길항균 방제가 (%)a
A-2 + Pac 75.0 abb
A-7 + Pa 80.0 ab
RH-4 + Pa 80.0 ab
(A-2+A-7) + Pa 80.0 ab
(A-7+RH-4) + Pa 90.0 a
(A-2+RH-4) + Pa 75.0 ab
(A-2+A-7+RH-4) + Pa 60.0 b
Pathogen (Pa) only 0.0 c
Control 100.0 a
a 방제가 (%) = (무처리구의 발병도 - 처리구의 발병도)/(무처리구의 발병도 ) x 100
b 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
c Pa, 결구상추 균핵병원균 S. sclerotiorum YR-1
<실시예 5> 길항균의 동정
상기 실시예 3 및 4에서 균핵병 방제용으로 최종 선발된 우수 길항균 A-7 균주를 API test, TEM을 이용한 형태 관찰, 생리·생화학적 특성 및 16S rDNA gene sequence analysis 또는 gyrA sequence analysis를 이용하여 동정을 실시하였다.
(5-1) 배양, 생리 및 화학적 특성
상기 A-7 균주를 1일간 NA 배지에서 배양한 후, 세균현탁액을 3차 증류수에 1/2, 1/4, 1/16, 1/32의 순으로 희석하고, grid를 각각의 현탁액에 뭍힌 후, 1% aqueous uranyl acetate를 떨어뜨려 1-2분 방치한 후에 세균의 형태와 편모를 관찰하였다. 이때. negative staining으로 grid 위에 1% aqueous uranyl acetate를 처리한 것을 사용하였다. 또한, 생리·생화학적 특성 및 API test 검정을 위하여 Bergey's manual을 기초로 하여 그람염색, 혐기생장, 온도 조사, catalase, protease, 전분의 가수분해 등을 조사하였다. Gram staining 및 생리·화학적 특성을 조사하여 동정하고 또한, API system(API kit 20E, 50CHB, bioMerieux, France)을 이용하여 동정하였다.
균핵병 방제를 위해 최종 선발된 길항균 A-7 균주의 동정을 위하여 생리학적, 생화학적 특성 및 투사형 전자현미경을 이용한 형태학적 특성을 조사하였다. 그 결과, A-7 균주는 주모성 편모를 가지는 간상형 형태를 지녔으며(도 10), API kit (50 CHB/B Medium, bioMerieux Inc., France)를 이용한 생화학적 특성분석 결과, Bacillus subtilis와 73.2%의 유사도를 나타내었다. 그러나 생리학적 특성에서는 10% NaCl농도에서 생육이 가능하였고 D-glucose와 L-arabinose는 탄소원으로 잘 이용하였으나 D-xylose와 D-mannitol에서는 유기산을 생성하지 못했다. 이러한 특성들을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology의 Bacillus 동정기준에 의해 동정된 결과 Bacillus. subtilis 보다는 B. amyloliquefaciens와 높은 유사도를 보였다. 상기 결과를 하기의 표 10에 나타내었다.
[표 10] A-7 균주의 동정을 위한 배양적 및 생화학적 특성 조사
특 성 B. subtilis B. amyloliquefaciens A-7
그람 염색 +a + +
내생포자(Endospore) + + +
세포직경(Cell diameter>1.0 μm ― + +
운동성(Motility) + + +
Voges-Proskauer test + + +
카탈라아제테스트(Catalase test) + + +
산성 생성유무 D-glucose + + +
L-Arabinose + + +
D-Xylose + ― ―
D-Mannitol + d ―
가스 생성(glucose) + ― ―
가스분해 - 카제인(Casein) + + +
젤라틴(Gelatin) + + +
녹말(Starch) + + +
시트레이트 이용(citrate) + + +
질소환원 여부 + + +
생장 pH 6.8 NB + + +
pH 5.7 + + +
생장 NaCl 2% + + +
5% + + +
7% + + +
10% ND + +
생장 5℃ ― ― ―
10℃ d + +
30℃ + + +
40℃ + + +
50℃ d ― ―
a +, 90% 또는 그 이상 결과 일치;
―, 10% 또는 그 이하의 결과 일치;
d, 11-89% 의 결과 일치로 부정확함;
ND, 결과가 전혀 없음
(5-2) 16S rDNA 유전자 서열 분석
A-7 균주의 정확한 동정을 위하여, LB배지에서 1일간 배양한 각 세균의 chromosomal DNA를 promega genomic DNA purification kit (Promega., U.S.A.)를 사용하여 게놈 DNA를 준비하고, 이를 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 16S rDNA를 PCR 증폭하였다 (27mF: AGAGTTTGATCM, 1492mR: GGYTACCTTGTTACGACTT). 이와 같이 얻어진 PCR 산물을 QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN Inc., Germany)를 사용하여 정제한 후, pGem-T 벡터 (Promega, U.S.A.)에 클로닝하여, ABI 100 automated DNA sequencer(Takara Korea, Korea)로 분석하고, 이 염기서열을 기초로 NCBI 에 blast 하여 동정하였다.
A-7 균주의 16s rDNA PCR 증폭에 의해 약 1.5 kb의 유전자를 확보하였으며, 이 PCR fragment의 염기서열을 분석하여 GeneBank의 database에서 검색한 결과 Bacillus amyloliquefaciens와 99.7%, B. amyloliquefaciens와는 99.4%의 유사성을 보였다. 상기에서 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다.
(5-3) gyr A 서열 분석
Bacillus 종의 경우 종래의 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열 분석만으로 확실한 동정이 어려워 Bacillus 속 균에 포함하는 A-7 균주의 정확한 속 동정을 위해 gyrase subunit A 서열 분석을 실시하였다. 이때, Wizard genomic DNA　extraction kit(Promega Inc, USA)를 이용하여 각 균주들의 게놈 DNA를 Universal primer(p-gyrA-F: 5'CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT3', p-gyrA-r: 5'CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT3')로 PCR 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 Qia Quick spin column (Qiagen Inc, Germany)을 이용하여 다시 정제한 후 pGem-T 벡터 (Promega Inc, USA)에 연결시켜 E.coli로 증폭하였다. plasmid extraction kit(Atman bio, korea)를 통해 추출한 gyrA 유전자의 서열을 NCBI의 blast program을 통해 동정하였다.
A-7 균주의 gyrase A 유전자를 PCR 증폭한 후 PCR 단편을 partial sequence한 결과를 GeneBank에서 BLAST를 이용하여 검색한 결과, B. amyloliquefaciens와 96%의 유사도를 보였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다.
따라서, 최종적으로 A-7 균주를 B. amyloliquefaciens A-7 균주로 동정 및 명명하였다. 상기 B. amyloliquefaciens A-7 균주를 2006년 9월 5일자로 경기도 용인 소재의 한국농용미생물보존센터에 기탁하여, 기탁번호 KACC 91272P를 부여받았다.
<실시예 6> 삼각플라스크배양의 최적 배양조건 확립
(6-1) 배양시간
상기 실시예 5에서 균핵병 방제용 우수 길항균으로 최종 선발된 B. amyloliquefaciens A-7 균주의 최적 배양 시간을 조사하였다.
NB 배지(Nutrient broth, Difco, USA)에서 24시간 종균 배양한 A-7 균주의 세균 부유액 50 ml을 1,000 ml용 삼각플라스크의 500 ml NB 배지에 접종하고 30℃에서 150 rpm으로 48시간 진탕배양하면서 2시간 간격으로 생육정도를 조사하였다. 각 시료를 살균수로 10배 희석하여 분광광도계(spectrophotometer, Pharmacia, Biotech, UK)에서 각 처리구 당 5반복으로 3회 실시하여 OD값을 측정하였다. 그 결과, A-7 균주는 배양 14 시간째에 최대값인 A550=1.0 에 도달하였으며, 14 시간 이후에는 점차 감소하며 24시간 이후에 급격히 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 13에 나타내었다.
(6-2) 온도 및 pH
A-7 균주의 최적 증식 온도 및 pH 조사를 위해 앞서의 생육조사에서와 동일한 방법으로 수행하였으며, 온도 범위는 5℃ 간격으로 20 내지 50℃사이에서 조사하고, pH는 pH 4 내지 8사이에서 pH 1 간격으로 조사하였다. 24시간 배양된 시료는 10배 희석하여 분광광도계(spectrophotometer)에서 각 처리구 당 5반복, 3회 실시하여 OD값을 측정하였다.
상기 A-7균주의 온도에 따른 생육정도를 조사한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 25℃에서 A550=1.0으로 가장 높았고, 다음으로 30℃, 35℃, 20℃ 이었으며, 40℃이상의 고온에서는 증식이 매우 저조하였다). 따라서 최적증식 온도는 25℃로 확인되었다.
또한, A-7균주의 pH에 따른 생육정도를 조사한 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, pH 6과 7에서 증식이 가장 높았으며, 다음은 pH 5와 8 이었다. 따라서 생육 최적 pH는 6과 7이었다.
(6-3) 탄소원
질소원인 효모 추출물 (Yeast extract, Difco, USA) 0.5%가 포함된 Bacillus 배양용 기초배지(K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.05%, MnCl2·4H2O, 0.0005%, CaCl2·2H2O 0.0005%, FeSO4 0.0025%) 100 ml을 300 ml용 삼각플라스크에 넣고 저분자 탄소원(표 11 참조, 표 11에 기재된 탄소원 중 저분자 탄소원은 모두 Junsei (Japan)에서 구입하였고, 이 중 수용성 전분은 (주)삼양제넥스로부터 구입하여 사용하였다. 한편, 고분자 탄소원(표 12 참조)는 제빵개량제 S-500 (유니온상사, 벨기에), 검은설탕 및 노란설탕(제일제당, 한국), 미강(농협, 한국), 쌀전분과 고구마(재래시장) 등은 구입처가 다르며, 종류별로 3.0% 첨가한 뒤 A-7 균주를 접종하고 3일간 진탕배양(30℃, 150 rpm)하면서 24시간마다 균주의 증식조사를 OD 값을 측정하였다. 추가로, 현미유(세림현미, 한국)와 당밀(한국바이오케미칼, 한국)에서의 A-7 균주의 OD 값도 조사하였다.
저분자 탄소원을 사용하여 얻어진 결과를 하기의 표 11에 나타내었으며, 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 탄소원은 프룩토오스 및 글루코오스에서 각각 1.93, 1.91로 가장 높았다.
[표 11] B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생육을 위한 저분자 탄소원의 영향 (30℃, 160 rpm)
저분자 탄소원 세균밀도 (at 550 nm)
24 h 48 h 72 h
글루코오즈(Glucose) 0.38 0.69 1.91 ba
슈크로오즈(Sucrose) 0.30 0.31 0.32 k
락토오즈(Lactose) 0.25 0.28 0.25 L
만니톨(Mannitol) 1.02 0.85 1.18 f
자일로오즈(Xylose) 0.15 0.45 0.69 i
글리세롤(Glycerol) 0.56 0.47 0.58 j
프룩토오즈(Fructose) 1.57 1.14 1.93 a
덱스트린(Dextin) 0.77 1.41 1.27 e
아라비노오즈(Arabinose) 0.38 0.56 0.83 h
수용성전분(Souble starch) 0.36 0.90 1.45 c
이노시톨(Inositol) 0.44 2.71 0.85 g
셀로바이오스(Cellobiose) 1.62 1.23 1.31 d
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
질소원 효모 추출물(yeast extract) 0.5%가 포함된 기초배지에 고분자 탄소원 3.0%를 종류별(표 12 참조)로 첨가하여 A-7 균주를 접종하고 진탕 배양하여 균주의 증식을 조사한 결과를 하기의 표 12에 나타내었다. 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, OD값은 고분자 탄소원이 저분자 탄소원보다 현저히 높았으며, 그 중에서도 제빵개량제 72시간 배양에서 A550=2.89로 가장 높고, 미강, 옥수수 순으로 각각 A550=2.65, A550=2.34 이었다.
[표 12] B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생육을 위한 고분자 탄소원의 영향 (30℃, 160 rpm)
고분자 탄소원 세균밀도 (at 550 nm)
24시간째 48시간째 72시간째
제빵개량제(Dough conditioner) 1.85 2.43 2.89 aa
쌀전분(Rice starch) 0.89 1.94 2.34 c
고구마(Sweet potato starch) 1.18 1.33 1.69 e
검은 설탕(Black sugar) 1.48 1.39 1.75 d
노란설탕(Yellow sugar) 1.64 1.6 1.40 f
미강(Rice bran) 1.76 2.13 2.65 b
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
상기 결과에서, OD 값이 높았던 고분자 탄소원 제빵개량제, 미강 이외에 고분자 탄소원인 현미유(Rice oil)와 당밀을 추가로 선발하여 A-7 균주의 증식을 조사한 결과, 현미유가 A550=2.89로서 가장 높았으며 다음은 제빵개량제가 A550=2.53이었다(표 13). 결과적으로 추가 선발한 현미유에서의 생육정도가 제빵개량제보다 높아 최종적으로 효과적인 탄소원으로 현미유를 선발하였다.
[표 13] B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생육에 고분자 탄소원이 미치는 영향 (30℃, 160 rpm)
고분자탄소원 세균밀도 (at 550 nm)
0시간째 24시간째 48시간째 72시간째
제빵개량제(Dough conditioner) 0.69 1.72 2.66 2.53 ba
당밀(Rice bran) 0.36 0.89 0.95 1.18 c
현미유(Rice oil) 0.06 2.03 2.82 2.89 a
몰라쎄(Molasses) 0.13 0.51 0.68 0.85 d
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
또한, 상기 실시예 5에서 동정된 길항균 A-7을 단독 또는 혼합 탄소원(3.0%)을 질소원(0.5%)이 첨가된 기초배지(K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.05%, MnCl2·4H2O, 0.0005%, CaCl2·2H2O 0.0005%, FeSO4 0.0025%)에서 72시간 배양한 배양액의 상층액을 농축하여 살균수로 100배 희석하고 균핵병원균 YR-1균주와 대치배양하여 항생물질에 의한 YR-1 균주의 생육저해효과를 조사하여 적정 탄소원을 선발하였다.
탄소원 3.0%와 질소원(효모 추출물) 0.5%를 넣은 기초배지에 길항균 A-7 균주 (A550=1.0, 1x107 cfu/ml)를 접종한 후 5일간 진탕배양하고 배양액의 상등액을 PDA배지 상에서 병원균 YR-1 균주와 대치배양하여 병원균의 균사생육 저해효과를 조사하여, 그 결과를 하기의 표 14에 나타내었다. 표 14에 나타난 결과에 따르면, 프룩토오스, 만니톨, 이노시톨, 글리세롤에서 저지대가 각각 12.0 mm, 12.5 mm, 11.8 mm, 11.5 mm로 나타나 높은 길항력을 보이는 것으로 나타났으나, 고분자 탄소원에서는 균사생육저해 효과가 다소 낮았다.
[표 14] 저분자 및 고분자 탄소원에 의한 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1) 균사생육 억제효과
탄소원 생육저지대(mm) 탄소원 생육저지대(mm)
글루코오즈(Glucose) 7.3 d 수용성전분(Souble starch) 7.0 da
이노시톨(Inositol) 11.8 ab 제빵개량제(Dough conditioner) 7.0 d
락토오즈(Lactose) 8.0 cd 고구마전분(Sweet potato) 7.0 d
만니톨(Mannitol) 12.5 a 검은설탕(Black sugar) 9.8 bc
자일로오즈(Xylose) 7.3 d 슈크로오즈(Sucrose) 0.0f
글리세롤(Glycerol) 11.5 ab 셀로바이오즈(Cellobiose) 0.0f
푸룩토오즈(Fructose) 12.5 a 미강(Rice bran) 0.0f
덱스트린(Dextin) 4.3 e 쌀가루(Rice powder) 0.0f
아라비노오즈(Arabinose) 2.8 e 노란설탕(Yellow sugar) 0.0f
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
다음으로, 선발 탄소원인 현미유 외에 프룩토오스, 제빵개량제를 각각 단독 (3.0%) 또는 혼합 처리한 것(1.5%)을 질소원 0.5%가 첨가된 기초배지에 넣고 여기에 A-7 균주을 접종(A550=1.0, 1x107 cfu/ml) 한 후 72시간 진탕 배양하여 24시간마다 OD 값을 측정하여 탄소원 혼합처리에 의한 생육 억제 효과를 조사하여 그 결과를 표 15에 나타내었다. 표 15에서 알 수 있는 바와 같이, 저해 효과가 높았던 프룩토오스 외 제빵개량제와 현미유를 추가 공시하여 단독 및 혼합에 의한 병원균의 균사생육저해 효과를 조사한 결과, 탄소원 혼합효과는 나타나지 않았으며, 현미유의 저지대는 9 mm로서 프룩토오스 10 mm, 제빵개량제 7 mm와 유사하였다.
[표 15] 고분자 탄소원의 단독 및 혼합 배양에 의한 균핵병원균(S. sclerotiorum YR-1)의 균사생육 억제 효과
고분자 탄소원 생육저지대 (mm)
프룩토오즈(Fructose) 10 aa
제빵개량제(Dough conditioner) 7 ab
현미유(Rice oil) 9 a
프룩토오즈(Fructose)+제빵개량제(Dough conditioner) 8 a
프룩토오즈(Fructose)+현미유(Rice oil) 8 a
제빵개량제(Dough conditioner)+현미유(Rice oil) 4 b
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
선발 탄소원인 현미유 외에 프룩토오스,제빵개량제를 각각 단독 (3.0%) 또는 혼합 처리한 것(1.5%)을 질소원 0.5%가 첨가된 기초배지에 넣고 여기에 A-7 균주을 접종(A550=1.0, 1x107 cfu/ml) 한 후 진탕 배양하여 균주의 세균 밀도를 측정한 결과, 기초배지에 현미유나 제빵개량제에 단독으로 첨가하는 것이 Fructose와 혼합처리하는 것보다 OD가 현저히 높았는데, 현미유 단독 첨가한 72시간 배양한 것이 A550=3.37로서 가장 높았으며, 다음은 제빵개량제 단독 첨가가 A550=2.76이었다(표 16). 따라서, 탄소원의 혼합처리에 생육 억제 효과의 증진효과가 나타나지 않았다.
[표 16] B. amyloliquefaciens A-7 균주의 생육에 저분자 및 고분자 탄소원이 미치는 영향 (30℃, 160 rpm)
탄소원 세균밀도 (550 nm)
0시간째 24시간째 48시간째 72시간째
프룩토오즈 0.03 0.57 0.57 0.62 fa
제빵개량제 0.69 2.02 2.84 2.76 b
현미유 0.06 2.81 3.25 3.37 a
프룩토오즈+제빵개량제 0.53 0.94 1.02 1.54 e
프룩토오즈+현미유 0.01 0.64 1.07 1.75 d
제빵개량제+현미유 0.60 0.97 2.01 2.1 8c
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
< 실시예 7> 발효기에서의 대량배양조건 확립
(7-1) 현미유배지를 이용한 발효
상기 실시예 6의 플라스크 배양에서 선발된 대량 배양용 배지인 현미유 배지 4 L를 7 L용 발효기에 넣고, 종균 배양한 A-7 균주 400 ml를 접종하여 발효기 배양(30℃, 350 rpm, 1.5 기압, pH 7)하였다. 이때, 질소원으로 효모 추출물 또는 NH4NO3를 첨가하고 24시간별로 배양액의 세균농도(OD) 값을 측정하여 그 결과를 하기의 표 17에 나타내었다. 표 17에서 알 수 잇는 바와 같이, 질소원을 0.5% 첨가한 경우가 질소원 무처리구에 비하여 OD 값이 높았으며, 질소원으로써 효모추출물을 첨가시 OD 3.35로 가장 높았다(표 17). 따라서, 기초배지(K2HPO4 0.05%, MgSO4·7H2O 0.05%, MnCl2·4H2O, 0.0005%, CaCl2·2H2O 0.0005%, FeSO4 0.0025%)에 현미유 3.0%, 효모 추출물 0.5%를 첨가한 현미유 배지를 B. amyloliquefaciens A-7 균주의 플라스크배양에서 대량배양용 배지로 최종 선발하였다.
[표 17] 균핵병원균의 균사생육에 미치는 질소원의 영향 (30℃, 160 rpm)
질소원 세균밀도 ( 550 nm)
0시간째 24시간째 48시간째 72시간째
현미유(Rice oil) 0.06 2.58 2.94 3.17 c
현미유(Rice oil)+효모추출액(효모 추출물) 0.08 2.74 3.14 3.35 a
현미유(Rice oil)+NH4NO3 0.08 2.63 3.03 3.25 ba
a 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(7-2) 발효기내에서의 최적 배양 시간
상기의 플라스크 배양에서 선발된 대량배양용 배지인 현미유배지를 발효기에 넣고, A-7 균주을 접종하고 배양(30℃, 350 rpm, 1.5 기압, pH 7)하여 OD 값과 희석평판법으로 세균밀도를 측정한 결과를 하기의 표 18에 나타내었다. 표 18에서 알 수 있는 바와 같이, 72시간과 96시간 배양에서 각각 A550=9.12, A550=7.13으로 증식이 가장 높았으나, 생균수는 72시간, 96시간에서 각각 56ㅧ1017, 73ㅧ1017 cfu/㎖으로 가장 높게 나타났다. 따라서, 발효기에서 길항균을 배양하는 기간은 세균밀도가 가장 높은 72시간으로 정하였다.
[표 18] B. amyloliquefaciens A-7의 대량배양을 위한 발효기내 최적 배양 시간 (30℃, 350 rpm, 1.5 기압)
배양시간 세균밀도 (550 nm) 세균수 (cfu/㎖)aX1010
0 시간째 0.09 0.0
24 시간째 4.10 0.01
48 시간째 5.62 0.72
72 시간째 9.12 56.0
96 시간째 7.31 73.0
120 시간째 5.71 19.0
a 세균수는 영양배지(nutrient agar)상에 10단계희석법으로 도말한 후 콜로니수를 측정한 것임
(7-3) 균사생육 저해 효과
상기의 현미 유배지 4 L를 7 L용 발효기에 넣고 A-7 균주 400 ml 을 접종하여 72시간 배양(30℃, 350 rpm, 1.5 atm, pH 7) 후 배양액의 상등액을 농축하고 시료를 100배 희석하여 균핵병원균 YR-1균주와 대치배양하여 균사생육저해효과를 검정하였다. 그 결과, 저지대 직경은 15 mm이었다. 상기 결과를 하기의 표 19에 나타내었다.
[표 19] 발효기내 현미유 대량배지에서 배양한 B. amyloliquefaciens A-7의 균핵병원균의 균사생육저지효과 검정
배양대량배지 생육저지대 (mm)
현미유 배지 15
이상의 플라스크배양과 발효기배양의 결과, B. amyloliquefaciens A-7 균주의 대량배양용 배지로 증식과 항균물질에 의한 병원균의 균사생육저해효과가 높은 것으로 확인된 현미유배지를 최종 선발하였다.
〈실시예 8〉길항균 A-7 균주를 이용한 엽면살포제의 제형화
(8-1) 전달매체 선발
기존의 살포제 제형화를 위한 전달 매체로서 옥수수 전분, 타피오카 전분, 메주가루, 변성전분 등을 사용하여 수화제형으로 제조하였다. 이들은 물에 대한 용해성은 높으나 결구상추 잎에 살포된 후 약흔을 남겨 미관상 좋지 않았으며 살포기의 입구를 막는 등 여러 가지의 단점이 있었다. 이러한 단점이 보완된 액상 수화제형을 제조하고자, 본 실시예에서는 투명하면서 약흔을 남기지 않고 끈적임의 특성이 높은 찰옥수수전분, 썬 크리미, 썬 테더, 썬 프리젤, 썬 사이즈, 썬 캡, 썬 슈퍼젤, 썬 배터, 제오실, 변성전분(삼양제넥스(주), 한국) 등을 농도별로 달리 선발하여 액상 수화제로 제형화를 시도하였다. 시험 결과, 이들 중 액상수화제는 썬 크리미와 썬 캡을 첨가하였을 경우에 가능하였으며, 나머지의 경우는 수화제형으로 제조되었다. 본 실시예에서 시도된 제형화 기술은 미생물 농약 개발에 처음으로 시도되었으며, 이들은 모두 변성전분의 일종으로서 가격면에서도 저렴하여 산업경쟁력이 있으며, 자외선 차단 및 부착정도가 높아 이를 전달매체로 선발하였다.
(8-2) 제형화
(8-2-1) 1차 제형화 (A7A, A7B, A7C, A7D, A7E, A7F)
7 L 발효기에 대량배양용 배지인 현미유배지 4 L를 넣고, 병원균 YR-1균주의 길항균으로 나타난 공시균주 B. amyloliquefaciens A-7 균주 (KACC 91272P) 40 ml를 접종하여 30℃, 350 rpm, pH 7, 1.5 atm에서 3일간 배양하였다. 이 배양액에 옥수수 전분, 타피오카 전분, 메주가루, 변성전분 등의 전달매체를 첨가하고 혼합하여, 건조기(55℃)에서 2 내지 3일간 건조 후 분쇄기로 갈아 수화제형 1차 제제 (A7A, A7B, A7C, A7D, A7E, A7F)를 제조하였다. 상기 수화제형 1차 제제의 조성은 하기의 표 20과 같이 하였다 (단위: 중량%).
[표 20] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 1차 제형화된 제제의 조성
제제 조성
A7A 옥수수전분(Corn starch) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7B 옥수수전분(Corn starch) 40%
A7C 타피오카전분(Tapioca starch) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7D 타피오카전분(Tapioca starch) 40%
A7E 옥수수전분(Corn starch) 40%, 메주가루(Meju flour) 5%
A7F 변성전분Modified starch) 40%,메주가루(Meju flour) 5%
(8-2-2) 2차 제형화 (A7G, A7H, A7I, A7J, A7K, A7L)
상기 A-7균주 배양액에 옥수수 전분, 타피오카 전분, 올리브유, 프룩토오스 등의 전달매체를 첨가하고 혼합하여 수화제형 2차 제제(A7G, A7H, A7I, A7J, A7K, A7L)를 제조하였다. 상기 수화제형 2차 제제의 조성은 하기의 표 21과 같이 하였다 (단위: 중량%).
[표 21] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 2차 제형화된 제제의 조성
제제 조성
A7G 옥수수전분 40%, 올리브오일 5%, 프룩토오즈 2.5%
A7H 옥수수전분 40%, 프룩토오즈 2.5%
A7I 타피오카전분 40%, 올리브오일 5%, 프룩토오즈 2.5%
A7J 타피오카전분 40%, 프룩토오즈 2.5%
A7K 옥수수전분 40%, 현미유 5%, 프룩토오즈 2.5%
A7L 타피오카전분 40%, 현미유 5%, 프룩토오즈 2.5%
(8-2-3) 3차 제형화 (A7M, A7V, A7O, A7P, A7Q)
앞서의 제형화와 동일한 방법으로 배양한 A-7 균주의 배양액에 옥수수 전분, 타피오카 전분, 변성전분 등의 전달매체를 다양한 농도로 첨가하고 혼합하여, 건조기(55℃)에서 2 내지 3일간 건조한 후, 분쇄기로 갈아 수화제형 제제를 제조하였 다. A-7균주의 배양액에 옥수수 전분, 변성전분 등의 전달매체를 첨가하고 혼합하여 수화제형 3차 제제 (A7M, A7V, A7O, A7P, A7Q)제제를 제조하였다. 상기 수화제형 3차 제제의 조성을 하기의 표 22에 나타내었다 (단위: 중량%).
[표 22] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 3차 제형화된 제제의 조성
제제 조성
A7M 옥수수전분(Corn starch) 50%
A7N 옥수수전분(Corn starch) 30% , 변성전분(Modified starch) 20%
A7O 옥수수전분(Corn starch) 20% , 변성전분(Modified starch) 30%
A7P 옥수수전분(Corn starch) 10% , 변성전분(Modified starch) 40%
A7Q 변성전분(Modified starch) 50%
(8-2-4) 4차 제형화 (A7R, A7S, A7T, A7U)
앞서의 제형화와 동일한 방법으로 배양한 A-7 균주의 배양액에 옥수수 전분, 타피오카 전분, 변성전분 등의 전달매체를 다양한 농도로 첨가하고 혼합하여, 건조기(55℃)에서 2∼3일간 건조한 후, 분쇄기로 갈아 수화제형 제제를 제조하였다. A-7균주의 배양액에 타피오카 전분, 변성전분 등의 전달매체를 첨가하고 혼합하여 수화제형 4차 제제(A7R, A7S, A7T, A7U)를 제조하였다. 상기 수화제형 4차 제제의 조성을 하기의 표 23에 나타내었다.
[표 23] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 4차 제형화된 제제의 조성
제제 조성
A7R 타피오카전분(Tapioca starch) 50%
A7S 타피오카전분(Tapioca starch) 30%, 변성전분(Modified starch) 20%
A7T 타피오카전분(Tapioca starch) 20%, 변성전분(Modified starch) 30%
A7U 타피오카전분(Tapioca starch) 10%, 변성전분(Modified starch) 40%
A7Q 변성전분(Modified starch) 50%
(8-2-5) 5차 제형화 (수화제 A7-1, A7-3, A7-4, A7-5, A7-7, A7-8, A7V 제제, 액상수화제 A7-2, A7-6 제제)
앞서의 4차 제형화와 동일한 방법으로 배양한 A-7균주의 배양액에 찰옥수수전분, 썬 크리미, 썬 테더, 썬 프리젤, 썬 사이즈, 썬 캡, 썬 슈퍼젤, 썬 배터, 제오실, 변성전분 등은 삼양제넥스(주)에서 구입하여 전달매체로서 다양한 농도로 첨가, 혼합하여 건조기(55℃)에서 2 내지 3일간 건조한 후, 분쇄기로 갈아 수화제 및 액상수화제 제제를 제조하였다. 상기와 같이 얻어진 수화제 및 액상 수화제의 조성을 하기의 표 24에 나타내었다.
[표 24] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 5차 제형화된 제제의 조성
제 제 조성
A7-1 미강(Waxy rice) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7-2 썬크리미(Sun creamy) 8%
A7-3 썬텐더(Sun tender) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7-4 썬사이즈(Sun size) 8%
A7-5 썬프리겔(Sun fregel) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7-6 썬캡(Sun cap) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7-7 썬슈퍼겔(Sun supersel) 8%
A7-8 썬배터(Sun batter) 40%, 변성전분(Modified starch) 10%
A7V 제오실(Zeocil) 34%, 변성전분(Modified starch) 8.3%
(8-2-6) 6차 제형화(수화제, A7W 제제)
5차 제형화에서 제오실을 이용하여 만든 A7-V제제의 방제효과는 높았으나, 약흔이 많이 나타났다. 이런 문제점을 보완하기 위하여 제오실의 첨가농도를 10%로 낮추어서 변성전분 8.3%와 혼합하여 수화제형 제제를 제조하였다. A-7균주의 배양 액에 제오실과 변성전분을 첨가하고 혼합하여 수화제형 5차 제제(A7W)를 제조하였으며, 그 조성을 하기의 표 25에 나타내었다.
[표 25] B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 6차 제형화된 제제의 조성
제제 조성
A7W 제오실(Zeocil) 10% , 변성전분(Modified starch) 8.3%
〈실시예 9〉 Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 균핵병 방제용 엽면살포제의 방제효과
(9-1) 생육실 포트검정에서의 방제효과
(9-1-1) 1차 제형화
상기에서 B. amyloliquefaciens A-7 균주를 이용하여 제조한 1차 미생물 제제(A7A~A7F)의 100배 희석액과 화학농약 베노밀 1000배 희석액을 생육실 포트재배에서 방제효과를 검정하였다. 각 약제의 희석액을 파종하여 8주된 결구상추 잎의 앞, 뒷면에 100 ml씩 골고루 살포하고, 24시간 후에 S. sclerotiorum YR-1 균주의 접종원인 균사조각 부유액(A550=0.6) 40ml을 잎의 앞, 뒷면에 골고루 접종하여 상대습도 90%, 온도 24 내지 25℃의 생육실에 보관하였다. 7일 후에 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였다. 균사조각부유액의 조제는 다음과 같이 수행하였다: YR-1균주를 PDB 배지에서 3일간 진탕배양(25℃, 160 rpm)후 균사를 걸러내어 탈이온수로 5회정도 세척하였다. 이를 분쇄기(Warning, USA)로 15초간 균사를 절단한 후 그 농도를 A550=0.6이 되도록 3차 살균수로 조정하였다. 그 결과를 하기의 표 26에 나타 내었으며, 표 26에서 알 수 있는 바와 같이, 수화제형 A7A 제제가, 화학농약인 베노밀의 95.2%보다는 약간 낮지만, 87.7%의 방제가로 가장 높은 방제효과를 보이는 것으로 나타났다. 따라서, A7A 제제를 1차로 선발하였다.
표 26. Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 1차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7A + Pac 12.3 87.7bd
A7B + Pa 32.1 67.9d
A7C + Pa 22.7 77.3c
A7D + Pa 44.8 55.2e
A7E + Pa 52.4 47.6f
A7F + Pa 58.3 41.7g
화학농약(Benomyl) 4.8 95.2a
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0h
Control 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(9-1-2) 2차 제형화
1차 제제 개발 후 6종류의 미생물 제제를 2차로 추가 제조하여 결구상추 균핵병에 대한 방제 효과를 화학농약 베노밀과 비교 검정하였다. 그 결과 수화제형 A7I제제의 방제가가 60.1%로 가장 높았으나, 그밖의 A7G, A7H, A7L, A7J, A7K 제제는 48.4%, 41.7%, 38.8%, 36.6%, 29.8%로 전반적으로 방제가가 낮았다. 결국, A7I제제는 1차 선발 제제인 A7A제제의 87.8%의 방제가 보다는 낮아 선발되지 못하였다. 상기 결과를 하기의 표 27에 나타내었다.
[표 27] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 2차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7G + Pac 51.6 48.4cd
A7H + Pa 58.3 41.7cd
A7I + Pa 39.9 60.1b
A7J + Pa 63.4 36.6de
A7K + Pa 70.2 29.8e
A7L + Pa 61.2 38.8de
화학농약(Benomyl) 8.7 91.3a
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0f
Control 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(9-1-3) 3차 제형화
2차 개발된 제제의 방제효과가 다소 낮아 5종류의 미생물 제제를 3차로 추가 제조하여 결구상추 균핵병에 대한 방제 효과를 베노밀 및 1차 선발 제제인 A7A의 방제 효과와 비교 검정한 결과, 수화제형 A7Q 제제가 78.3%의 방제가로 높았다. 그러나, A7Q 제제는 1차 선발된 A7A제제의 86.5%의 방제가보다 방제효과가 낮아 선발되지 못하였다. 상기 결과를 하기의 표 28에 나타내었다.
[표 28] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 3차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7M + Pac 40.9 59.1dd
A7N + Pa 59.4 40.6e
A7O + Pa 38.5 61.5d
A7P + Pa 67.2 32.8f
A7Q + Pa 19.7 78.3c
A7A + Pa 13.5 86.5b
화학농약(Benomyl) 8.5 92.5b
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0g
무처리구 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(9-1-4) 4차 제형화
4차로 4종류의 미생물 제제를 추가 제조하여 결구상추 균핵병에 대한 방제 효과를 베노밀의 방제 효과와 비교 검정하였다. 그 결과, 모두 방제가 66.7% 이하로 전체적으로 매우 낮았다. 따라서, 1차 선발된 A7A보다는 모두 방제가가 낮아 추가 선발되지 못하였다. 상기 결과를 하기의 표 29에 나타내었다.
[표 29] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 4차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7R + Pac 36.5 63.5cdd
A7S+ Pa 33.3 66.7c
A7T+ Pa 45.8 54.2ef
A7U+ Pa 41.4 58.6e
화학농약(Benomyl) 9.7 90.3b
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0g
무처리구 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(9-1-5) 5차 제형화
9종류의 미생물 제제를 5차로 추가 제조하여 결구상추 균핵병에 대한 방제 효과를 베노밀과 비교한 결과, 액상수화제형 A7-2제제의 방제가가 90.2%로 가강 우수하였으며, 베노밀의 95.8% 보다는 낮았으나 유의차는 없었다. 다음은 수화제형 A7-4 및 A7V제제로 방제가가 각각 88.4%, 83.1% 이었다. 상기 결과를 하기의 표 30 및 도 16에 나타내었다.
[표 30] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 5차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7-1 + Pac 53.7 46.3efd
A7-2 + Pa 9.8 90.2abc
A7-3 + Pa 72.2 27.8g
A7-4 + Pa 11.6 88.4ad
A7-5 + Pa 46.6 53.4e
A7-6 + Pa 25.5 74.5d
A7-7 + Pa 24.8 75.1cd
A7-8 + Pa 68.1 31.9fg
A7V + Pa 16.9 83.1bcd
화학농약(Benomyl) 4.2 95.8ab
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0h
무처리구 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
또한, 5차 제제의 방제효과 검정에서 방제가가 높았던 A7-2 제제 외 4종류의 제제를 추가로 공시하여 방제효과를 재검정한 결과, A7-2제제의 방제가가 88.2%로 높았으며 다음은 A7-4 제제 및 A7V 제제 순이었으나, 서로간에 유의차는 없었다. 그러나, A7V 제제의 경우 처리한 결구상추에 약흔이 발생되어 미생물 제제로 이용하기에는 미관상 문제점이 발견되었다. 상기 결과를 하기의 표 31 및 도 17에 나타내었다.
[표 31] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 5차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 재검정
제제 Disease severity index (%)a Disease control value (%)b
A7-2 + Pac 11.8 88.2bcd
A7V + Pa 17.2 82.8cd
A7-4 + Pa 14.2 85.8cd
A7-6 + Pa 32.6 67.4e
A7-7 + Pa 20.0 80.0d
화학농약(Benomyl) 6.5 93.5ab
병원균 (Pa) 단독 100.0 0.0f
Control 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(9-1-6) 6차 제형화
수화제형 A7W 제제를 6차로 추가 제조하여 5차 제제 실험에서 방제효과가 우수하였던 2종의 제제 즉, 수화제형 A7-4제제 및 액상수화제형 A7-2 제제와 1차 선발된 수화제형 A7A 제제 등 모두 4종류 제제의 방제효과를 재검정하여 그 결과를 하기의 표 32에 나타내었다. 표 32에 나타낸 바와 같이, 4종류 제제간에 유의차가 없었으나, 그 중 A7-2와 A7A의 방제가가 각각 84.9%, 83.8%로 가장 높았다. 따라서, 생육실 포트재배의 방제효과 검정 결과, 방제가가 가장 높았던 Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용하여 제조한 액상수화제형 A7-2 제제 및 수화제형 A7A 제제를 균핵병 방제용 엽면살포제의 우수제형으로 최종 선발하였다.
[표 32] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 6차 제형화된 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정
제제 발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7A + Pac 9.3 83.8cd
A7-2 + Pa 8.6 84.9c
A7-4 + Pa 10.8 81.2cd
A7W + Pa 11.1 80.6cd
화학농약(Benomyl) 6.2 89.2b
병원균 (Pa) 단독 57.3 0.0f
무처리구 0.0 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
〈실시예 10〉 플라스틱 하우스내 토경재배에서의 방제효과 검정
(10-1) 균핵병 방제효과 검정
균핵병 방제용으로 최종 선발된 수화제형 A7A제제와 액상수화제 A7-2제제 외 플라스틱하우스 포트검정에서 방제효과가 높았던 수화제형 A7-4 및 A7W 제제 2 종류를 추가로 공시하여 플라스틱 하우스내 토경에서 재배한 결구상추에서 균핵병에 대한 방제효과를 검정하였다.
플러그포트에 파종하여 4주된 유묘를 하우스내토양에 재식한지 4주(파종 후 8주)된 성체식물인 결구상추 잎의 앞, 뒷면에 본 발명에 따른 미생물농약 제제를 100배로 희석하여 100 ml 씩 골고루 처리하였다. 24시간 뒤 균핵병원균 YR-1 균주의 균사조각부유액 접종원(A500=0.6) 80 ml을 역시 잎의 앞, 뒷면에 골고루 살포 접종하였다. 이 때, 대조약제로서 화학농약인 베노밀(품목명: Benomyl 수화제)을 1000배 희석하여 사용하였으며, 병원균 YR-1 균주의 균사조각부유액은 PDA배지에 이식한 YR-1 균주를 항온기에 4 내지 5일간 배양(암, 25℃)한 뒤, 절취한 균사절편(직경 1 cm)을 PDB 배지에 100 ml 당 5개씩 넣고 3 내지 4일간 진탕배양(25℃, 150 rpm)한 다음, 배양된 균사를 걸러내어 탈이온수로 5회 정도 세척하고, 이것을 분쇄기(Warning, USA)로 15초간 균사를 갈아 농도를 A550=0.6으로 조정하여 사용하였다.
각 처리구는 평균면적 2 m2(1 x 2 m) 당 20주 씩, 3반복, 완전임의배치법으로 실시하였으며, 적어도 2회 이상 평균하였다. 약제 처리 후 20일 후에 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였다. 그 결과, A7-2 제제가 살포 20일 째의 방제가가 80.5%로 가장 우수하였으며, 다음으로는 A7A 제제가 79.1%의 방제가를 보였다. 그 러나 이들은 서로간에 유의차는 없었으나 대조구인 베노밀 처리구 75.2%보다는 유의적으로 높았다. 상기 결과를 하기의 표 33에 나타내었다. 따라서, A7-2 제제와 A7A제제는 생육실 포트검정에서와 마찬가지로 플라스틱하우스내 토경재배에서도 균핵병 방제용으로 효과적인 것으로 확인되었다.
[표 33] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 우수 제제들의 결구상추 균핵병에 대한 플라스틱 하우스내 토경재배에서의 방제효과 검정
제제 제제처리 후 20 일째
방제가 (%)b
A7A + Pac 79.1bd
A7-2 + Pa 80.5b
A7-4 + Pa 70.2c
A7W + Pa 69.6d
화학농약(Benomyl) 75.2c
병원균 (Pa) 단독 0.0f
무처리구 100.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 병원균(Pa), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(10-2) 밑둥썩음병과 균핵병의 동시방제 효과
최종 선발된 균핵병 방제용 엽면살포제인 액상수화제 A7-2제제와 밑둥썩음병 방제용 엽면살포제인 수화제형 BW13-A 제제를 포트재배한 결구상추(파종 후 8주)에 분무 살포하여 밑둥썩음병과 균핵병을 동시 방제하기 위하여 생육실 포트검정을 하였다. 이는 포장에 적용하기 위한 예비실험 단계로서 A7-2제제와 BW13-A 제제의 단독처리 그리고 혼합처리(A7-2+BW13-A제제)를 각각 100배로 희석하여 결구상추에 골고루 100 ml씩 분무살포하였다. 24시간 후 결구상추에 밑둥썩음병원균(R. solani , A550=0.4) 및 균핵병원균(S. sclerotiorum , A550=0.8)의 균사조각부유액을 각각 40 ml 씩 단독 또는 혼합 접종하여 상대습도 90%, 온도 24∼25℃의 생육실에 보관하면서 7일 후에 발병도를 조사하여 방제가로 환산하였다. 그 결과, A7-2제제의 단독처리가 2종류의 병원균 혼합 접종에 대한 방제가가 81.3%로서 2가지 제제의 혼합처리 70.6%보다 높았으나 유의차는 없었다. 상기 결과를 하기의 표 34 및 도 18에 나타내었다.
[표 34] Bacillus amyloliquefaciens A-7 균주를 이용한 우수 제제들의 결구상추 균핵병과 밑둥썩음병에 대한 플라스틱 하우스내 토경재배에서의 동시방제효과 검정
제제 병원균 접종 후 7일째
발병도d (%) 방제가 (%)
A7-2 SS+RS 15.0 81.3ae
BW13-A SS+RS 38.3 52.1b
(A7-2 + BW13-A)a SS+RS 23.3 70.6ab
(A7-2 + BW13-A) SSb 23.9 70.5ab
(A7-2 + BW13-A) RSc 21.3 72.0ab
화학농약(Benomyl) SS 9.6 89.7a
화학농약(Pencycuron) RS 5.6 92.6a
무처리 SS+RS 80.3 0c
무처리 SS 90.8 0c
무처리 RS 73.1 0c
a 균핵병 방제용 A7-2제제와 밑둥썩음병 방제용 BW13-A 제제는 동일 양으로 혼합 처리.
b 결구상추 균핵병원균(SS), Sclerotinia sclerotiorum YR-1
c 결구상추 밑둥썩음병원균(RS), Rhizoctonia solani YR-1
d 방제가 (%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
e 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
그러나, BW13-A 제제의 단독처리는 2종류의 병원균 즉, 밑둥썩음병과 균핵병의 혼합 접종에 대해 방제가가 높지 않았다. 따라서, A7-2 제제 만으로도 두가지 병원균에 대한 방제는 가능할 것으로 판단되었다.
〈실시예 11〉미생물농약의 자연발생 농가실증시험
(11-1) 2004년 결구상추의 경상남도 의령군 재배포장에서의 방제효과
2004년 10월 말 경 경상남도 의령군과 2005년 3월 말경 김해시 대동면에서 균핵병이 자연발생하기 시작한 농가의 플라스틱하우스에서 앞서의 균핵병에 대한 토경재배 검정을 통해 최종 선발된 수화제형 A7A 제제와 액상수화제형 A7-2 제제를 화학농약과 비교하여 방제효과를 검정하였다. 자연발생지로는 2004년도에 경상남도 의령군과 2005년도에 김해시 대동면 소재의 농가의 플라스틱하우스 재배 포장을 임대하여 모든 실험을 수행하였다. 품종은 의령군에서는 샤크라멘트(상품명:세레나)를 8월 25일에 파종하고 파종 30일 후(9월 24일)에 재식한 다음 50 내지 60일 뒤에 수확하였고, 대동면에서는 엠파이어(상품명:유레이크) 품종을 1월 20일에 파종한 뒤 파종 40일 후(3월 8일)에 재식하여 80 내지 90일 후에 수확하였다.
본 실시예는 균핵병이 약간 발생하기 시작한 시점인 2004년 10월 24일과 2005년 3월 28일에 균핵병 발생이 시작된 플라스틱하우스를 골라 약제를 처리하였다. 처리방법은 미생물농약 수화제형 A7A제제와 액상수화제형 A7-2제제를 각각 100배와 500배로, 화학농약 베노밀 수화제는 1,000배로 희석하여 결구상추 잎의 앞과 뒷면에 골고루 살포하였는데, 1주 간격으로 3회 처리하고 4주 째인 의령군에서는 2004년 11월 14일과 대동면에서는 2005년 4월 14일에 각각 발병율을 이병주율로 조사하여 방제가로 환산하였다. 각 처리구는 평균면적 2 m2(1 x 2 m) 당 15주식 5반복, 완전임의배치법으로 실시하였다.
그 결과, A7-2 및 A7A제제 100배 희석 처리구와 베노밀처리구간의 유의차가 없었는데 무처리구의 60.0% 이병주율에 비하여 각각 방제가가 84.7%, 84.3%, 87.0%이었다. 한편 A7-2 제제 500배 희석처리에서도 70.3%의 방제가를 보였다. 실용적인 면에서 수화제 A7A 제제는 약하지만 약흔이 발생되었으나 액상수화제인 A7-2제제는 이러한 약흔의 단점을 보완하면서도 500배처리에서도 방제가가 높아 산업화의 가능성이 높은 제제로 확인되었다. 상기 결과를 하기의 표 35 및 도 19에 나타내었다.
[표 35] 경상남도 의령군 밑둥썩음병 자연병 발생지역에서의 2종 수화제형 제제의 결구상추 균핵병원균(sclerotinia rot)에 대한 방제효과 검정(2004)
제제 c 처리후 11일째
발병도 (%)a 방제가 (%)b
A7A (100배 희석) 9.4 84.3ad
A7-2 (100배 희석) 9.2 84.7a
화학농약 베노밀 (1,000배 희석) 7.8 87.0a
A7-2 (500배 희석) 17.8 70.3b
무처리구 60.0 0.0d
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 각 제제는 1주일 간격으로 처리되었으며, 발병도는 약제 처리 4주째에 조 사되어 방제가로 환산되었음.
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
(11-2) 2005년 김해시 대동면 재배포장에서의 방제효과
2005년 3월말경 균핵병이 자연발생하기 시작한 경남 김해시 대동면 결구상추의 재배포장의 플라스틱 하우스에서 경남 의령군의 재배포장에서 방제효과가 확인된 A7-2 제제를 처리 농도별로 달리하여 제제의 방제 효과를 화학농약인 베노밀 처리와 비교, 검정하였다. 그 결과, 무처리의 이병주율이 28.0%로서 A7-2제제 100배 처리가 76.7%의 방제가로 베노밀 처리의 75.0%와 유사하였으며, A7-2 제제의 500배에서는 60.7%로 이보다는 낮았다. 그러나, 2005년 대동면 재배지에서의 무처리 발병율이 2004년 의령군에 비하여 현저히 낮았음에도 불구하고 미생물 농약 뿐만 아니라, 화학농약에 의한 방제효과도 의령군에 비하여 약간 낮은 경향이었다. 상기 결과를 하기의 표 36에 나타내었다.
[표 36] 김해시 대동면 균핵병 자연발생지에서의 B. amyloliquefaciens A-7를 이용한 2종 수화제형 제제의 결구상추 균핵병에 대한 방제효과 검정(2005)
제제 약제 처리 후 4주째
발병도 (%) a 방제가 (%) b
A7-2 (500배 희석) 11.0 60.7bd
A7-2 (100배 희석) 6.5 76.7c
Benomyl (1,000배 희석) 7.0 75.0c
무처리구 28.0 0.0a
a 발병도(%)는 성체 결구상추 잎에 Sclerotinia sclerotiorum YR-1 균주에 의해 감염된 면적 계수를 백분율로 환산한 값임.
b 방제가(%) = (무처리구에서의 발병도-처리구에서의 발병도)/(무처리구에서의 발병도) x 100
c 각 제제는 1주일 간격으로 처리되었으며, 발병도는 약제 처리 4주째에 조사되어 방제가로 환산되었음.
d 통계처리, 던컨다중 검정(Duncan's multiple test p=0.05).
〈실시예 12〉토경재배한 결구상추에서의 A7-2제제의 엽권정착력(활성) 검정
상기에서 우수 미생물 제제로 나타난 액상 수화제형 A7-2제제의 엽권정착력 검정을 위해, 플라스틱하우스내 토경재배한 결구상추(파종 후 8주)에 A7-2제제를 1회 처리한 후 21일까지 근권토양, 밑둥부위 및 잎 부위별 1 g에 존재하는 B. amyloliquefacIens A-7 균주의 생균수를 조사하였다.
이때, 공시된 A7-2 제제는 A-7 균주를 rifampicin(100 ug/ml)이 포함된 nutrient agar(NA) 배지에 2주간 계대배양하여 획득한 rifampicin 저항성 균주(A-7R)로 액상수화제 (A7-2R 제제)로 제조하고 결구상추 잎의 앞, 뒷면에 골고루 1회 살포하였다. A-7 균주의 생균수는 rifampicin 100 ug/ml이 포함된 nutrient agar (NA) 배지에서 처리 부위별로 희석평판법으로 조사되었으며, 제제의 초기 세균수는 각각 2.8ㅧ1018 cfu/ml 이었다. Rifampicin 저항성 B. amyloliquefacIens A-7R 균주를 이용하여 제조한 액상수화제형 A7-2R 제제를 결구상추 잎에 1회 처리한 후 21일 동안 A-7 균주의 생균수를 근권토양, 밑둥부위 및 잎 부위에서 측정하였다.
그 결과, 초기 세균수는 2.8x1013 cfu/ml 이었으며 경시적으로 약간 감소하였으나 처리 21일째에 근권토양, 밑둥부위 및 잎 부위에서는 각각 2.8x109, 1.4x109, 6.8x109 cfu/ml로써 A-7 균주의 엽권정착력이 장기간 유지되는 것으로 확인되었다. 상기 결과를 하기의 표 37에 나타내었다.
[표 37] 항생제 저항성 A7R 균주(Bacillus amyloliquefaciens A7R)를 이용한 A7-2R 제제의 플라스틱 재배의 결구상추 잎에서의 세균 활성 조사
처리후 일수 (일) 세균수 (cfu/ ml)
근권토양 밑둥부위 잎
0 2.8×1013 2.8×1013 2.8×1013
1 4.0x1013 3.2x1013 1.3x1013
3 3.6x1012 1.6x1012 3.2x1012
5 2.8x1012 1.4x1012 6.6x1012
7 8.1x1011 5.9x1011 4.5x1011
14 5.6x1010 3.8x1010 3.5x1010
21 2.8x109 1.4x109 6.8x109
따라서, A7-2 제제 1회 처리 후에도 A-7 균주의 엽권정착력이 장기간 유지되는 것은 A7-2 제제는 물론 A7A제제의 방제효과가 균핵병 발생 포장에서도 높았던 원인일 것으로 생각된다.
〈실시예 13〉개발된 제제의 저장 안정성 검정
선발된 미생물제제인 수화제형 A7A와 액상수화제형 A7-2제제를 실온과 4℃에서 각각 보관하면서 매달 동일한 날짜에 제제에 포함되어 있는 A-7 균주의 생균수를 NA배지에서 희석평판법으로 조사하여 미생물제제의 안정성(storage stability)을 조사하였다. 또한 4℃에서 3개월과 8개월 동안 보관되어 있던 액상수화제 A7-2제제를 PDA 배지상에서 균핵병원균과 대치배양하였으며, 1년간 보관하였던 A7-2제제의 농도별(100, 500, 1000배) 희석액을 균핵병원균과 대치배양하여 저지대를 조사함으로서 이들의 장기간 보관 시의 안정성을 조사하였다.
선발된 미생물제제 수화제 A7A와 액상수화제 A7-2 제제를 저장 온도 및 저장 기간에 따른 안정성을 조사한 결과, 2003년 10월의 A7A제제 초기 세균밀도는 1.5x1018 cfu/ml 이었으며, 1년 후 2004년 12월의 4℃와 실온에서의 세균 밀도는 각각 2.0x1017 cfu/㎖와 7.0x1016 cfu/㎖이었다. 이는 2005년 9월까지 1년 8개월간 조사되었는데 각각의 세균 밀도는 4.1x1014 cfu/㎖와 3.2x1014 cfu/㎖로 초기보다는 낮아졌으나 여전히 높은 밀도의 세균수가 유지되고 있었다. 이때 실온과 4℃ 보관에 따른 세균의 밀도 차이는 초기 세균 밀도는 별 차이가 없었으나, 3개월째부터는 실온보관에서 101 cfu/ml 정도 낮아졌으나 큰 차이는 없었다.
액상수화제 A7-2제제의 경우, 2003년 10월의 초기 세균수는 3.8x1018 cfu/㎖ 이었으며 1년 뒤인 2004년 12월의 4℃와 실온에서의 세균 밀도는 각각 2.8x1017 cfu/㎖와 4.3x1016 cfu/㎖으로 4℃와 실온 보관에 따른 세균의 밀도 차이가 다소 낮아졌다. 연구가 종료되는 2005년 9월에는 각각 5.9x1014 cfu/㎖와 5.3x1014 cfu/㎖로 초기보다는 낮아졌으나, 여전히 높은 세균수가 유지되고 있었으며, A7A제제보다는 A7-2 제제가 다소 높은 세균수로 유지되는 경향이었다. 결과적으로, 선발 미생물제제(A7A, A7-2)의 보관상 안정성에는 문제가 없을 것으로 보여지며 보관방법은 실온보다는 4℃ 보관이 좋으나 실온에 보관하여도 안정성에는 문제가 없을 것으로 사료된다. 상기 결과를 하기의 표 38에 나타내었다.
[표 38] A7A제제의 다양한 온도에 따른 저장 안정성조사
세균농도 (cfu/㎖) 기간 (년월) 세균수 (cfu/㎖)a
A7A 제제 A7-2 제제
4℃ RT 4℃ RT
2003년 11월 0.9×1018 0.6×1018 2.5×1018 7.5×1018
12월 0.7×1018 0.6×1018 2.0×1018 3.0×1018
2004년 1월 0.7×1018 4.2×1017 2.3×1018 2.0×1017
2월 5.2×1017 3.5×1017 6.2×1017 1.6×1017
3월 4.3×1017 3.5×1017 5.8×1017 1.3×1017
4월 4.0×1017 2.4×1017 5.7×1017 1.0×1017
5월 4.0×1017 2.0×1017 6.0×1017 9.0×1016
6월 3.8×1017 8.2×1016 5.7×1017 1.9×1016
7월 3.7×1017 8.3×1016 5.2×1017 1.5×1016
8월 3.6×1017 7.5×1016 4.0×1017 0.9×1016
9월 2.5×1017 7.4×1016 3.2×1017 4.8×1016
10월 2.0×1017 7.0×1016 3.0×1017 4.8×1016
11월 2.0×1017 7.0×1016 3.1×1017 4.8×1016
12월 2.0×1017 7.0×1016 2.8×1017 4.3×1016
2005년 1월 8.0×1016 8.2×1015 1.7×1017 3.8×1016
2월 6.0×1016 7.2×1015 1.5×1017 3.2×1016
세균수 (cfu/㎖) 기간 (월일) 세균수 (cfu/㎖) a
A7A 제제 A7-2 제제
4℃ RT 4℃ RT
2005년 3월 7.5×1015 6.2×1015 4.8×1016 4.9×1016
4월 7.3×1015 5.8×1015 4.4×1016 8.8×1015
5월 6.5×1015 4.6×1014 4.3×1016 7.2×1015
6월 6.2×1014 3.9×1014 4.0×1015 6.0×1014
7월 4.6×1014 3.5×1014 3.2×1015 5.5×1014
8월 4.6×1014 3.0×1014 3.6×1014 5.0×1014
9월 4.1×1014 3.2×1014 5.9×1014 5.3×1014
a 본 결과는 2종의 제제(A7A, A7-2)의 저장온도에 따른 세균수 변화를 조사한 것으로서 최초농도(2003년 10월)는 각각 A7A제제가 1.5ㅧ1018 cfu/ml 이었고, A7-2 제제는 3.8ㅧ1018 cfu/ml이었다.
또한, 4℃에서 3개월과 8개월간 4℃에서 보관되어 있었던 A7-2제제를 PDA배 지상에서 균핵병원균과 대치배양한 결과, 각각 5.0 mm, 5.3 mm의 저지대를 보였으며, 1년간 보관한 A7-2제제를 농도별로 희석하여 대치배양한 결과 1000배 희석에서도 4.5 mm 이상의 저지대를 보여 장기간의 보관에도 매우 안정성이 매우 높음을 재차 확인하였다. 상기 결과를 도 20에 나타내었다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7(Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주는 특히 결구상추 균핵병 및/또는 밑둥썩음병에 대하여 탁월한 방제효과를 가지고 있어, 결구상추 균핵병 및/또는 밑둥썩음병을 효과적으로 예방하는 생체에 안전한 생물농약으로 유용하다.

Claims (19)

  1. 식물병원성 세균 또는 진균 방제 효과를 갖는 수탁번호 KACC 91272P의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7) 균주.
  2. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주의 배양 방법으로서,
    대량배양 배지로서 1종 이상의 탄소원 또는 1종 이상의 질소원 또는 이들 모두를 첨가한 배지를 사용하며, 상기 1종 이상의 탄소원은 글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분 및 셀로바이오스로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원 및 제빵 개량제, 쌀전분, 미강 및 현미유로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, 상기 1종 이상의 질소원은 효모추출액 및 질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고;
    배양 온도는 20 내지 35℃로 하며;
    배양 pH는 5 내지 8로 하고;
    배양 시간은 24시간 이내로 하는 것
    을 특징으로 하는 배양 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배지는 상기 1종 이상의 탄소원과 상기 1종 이상의 질소원이 모두 첨가된 것인 배양 방법.
  4. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배양물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (Bacillus amyloliquefaciens A-7, KACC 91272P) 균주를 1종 이상의 탄소원 또는 1종 이상의 질소원 또는 이들 모두를 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 것이며,
    상기 1종 이상의 탄소원은 글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분 및 셀로바이오스로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원; 및 제빵 개량제, 쌀전분, 미강 및 현미유로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원으로 구성된 군으로부터 선택된 것이고,
    상기 1종 이상의 질소원은 효모추출액 및 질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 것인
    식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배지는 상기 1종 이상의 탄소원과 상기 1종 이상의 질소원이 모두 첨가된 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배지는 현미유, 현미유+효모추출액 및 현미유+질산암 모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 함유하며,
    상기 생체 고분자 물질은 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 및 제오실로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이고,
    상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이며,
    상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인,
    식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-7 (KACC 91272P) 균주의 배양물, 및 상기 배양물 100 중량부에 대하여 타피오카전분 30 내지 50 중량부, 올리브오일 2 내지 10 중량부 및 수쿠로오스 1 내지 5 중량부를 포함하는 것인, 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물병원성 세균은 균핵병 원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  11. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 식물병원성 세균 또는 진균의 방제 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물병원성 세균은 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방제 방법.
  13. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는, 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 배양물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (Bacillus amyloliquefaciens A-2, KACC 91262P) 균주를
    글루코스, 프룩토오즈, 만니톨, 덱스트린, 수용성전분 및 셀로바이오스로 구성된 군으로부터 선택되는 저분자 탄소원; 및
    제빵 개량제, 쌀전분, 미강 및 현미유로 구성된 군으로부터 선택되는 고분자 탄소원
    으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 첨가한 배지에서 배양하여 얻어진 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 배지는 효모추출액 및 질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 질소원을 추가로 함유하는 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 배지는 현미유, 현미유+효모추출액 및 현미유+질산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 생체 고분자 물질, 보호제 및 영양물질로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 함유하며,
    상기 생체 고분자 물질은 옥수수 전분, 변성전분, 타피오카 전분, 메주가루, 미강, 썬크리미, 썬텐더, 썬사이즈, 썰프리겔, 썬캡, 썬슈퍼겔, 썬배터, 및 제오실로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이고,
    상기 보호제는 현미유 및 올리브유로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것이며,
    상기 영양물질은 수크로오스 및 프룩토오스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인,
    식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 A-2 (KACC 91262P) 균주의 배양물, 및 상기 배양물 100 중량부에 대하여 타피오카전분 30 내지 50 중량부, 올리브오일 2 내지 10 중량부 및 수쿠로오스 1 내지 5 중량부를 포함하는 것인, 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 식물병원성 세균 또는 진균 방제용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 균핵병원균 (Sclerotinia spp.), 밑둥썩음병원균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 딸기탄저병(Collectrichum fragariae), 및 흰가루병(Erysiphe cichoracearum)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 식물병원성 세균 또는 진균의 방제 방법.
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