KR101390457B1 - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ebn-tk3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제 - Google Patents

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ebn-tk3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3에 관한 것으로, 양돈과 양계 산업에서는 특히나 돼지 위축성비염 원인균인 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella Bronchiseptica)와 가금 티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)을 저해하는 항균효과가 뛰어남이 확인되었다. 또한, 작물의 병해를 유발시키는 잎집무늬마름병의 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f.sp. raphani) 그리고 덩굴쪼김병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)을 억제 및 저해하는 항진균 효과가 뛰어남도 확인되었다.

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제{Bacillus amyloliquefaciens EBN-TK3, antibiotic or antifungal agent thereof}
본 발명은 신규로 분리한 미생물 및 이를 이용한 항균 또는 항진균제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 및 이를 포함하는 항균 또는 항진균제에 관한 것이다.
최근 들어 1차 산업은 증수 및 밀식을 통한 대량생산 방식에서 질적 향상에 대한 소비요구도가 높아짐에 따라 유기농, 친환경 그리고 안전한 먹을거리를 추구하는 방식으로 변화되고 있다. 이러한 1차 산업의 변화 속에서 다양한 농축 수산자재가 개발되어 사용되고 있으나, 고품질 사육 및 양질의 작물 수확과 환경 모두를 위한 제제는 충분치 않은 실정이다.
화학적 제제의 경우, 원하는 효능, 효과를 내기에는 부족함이 없으나, 그 부작용으로 인해 환경 오염도가 높다. 특히, 항생제 남용(가축 사료에 인위적으로 첨가되는 항생제들이 첨가된 사료를 지속적으로 급여)할 경우 가축 자체에 내성이 생길 수 있고, 항생제 잔류 축산물을 소비자가 지속적으로 섭취하면 인체도 내성이 생겨 국민 보건에 심각한 문제를 일으키게 된다. 이와 같이 축산물에 존재할 수 있는 항생제 내성 문제가 사회적 문제로 인식되는 현실에서 이를 간과하고서는 축산업에서의 경쟁력 확보가 불가능하다.
한편, 돼지위축성비염 질병은 1958년 미국에서 들어온 종돈에서 처음으로 보고된 후 전국적으로 높은 발병률을 보이며, 양돈장의 큰 피해를 초래하고 있다. 위축성 비염(AR)의 발병기전을 살펴보면, 환경요인으로 암모니아 가스의 자극, AR 원인균의 침입인데, 비강 점막의 손상을 일으켜 조골세포가 파괴되고, 이로 인한 비갑개골 위축과 비중격 위축 등이 나타난다. 이러한 문제점들은 폐렴균들이 쉽게 폐에 침입하도록 도와주는 역할을 하여 각종 폐렴증상들이 나타나며, 특히 유행성 폐렴의 발생률이 매우 높아지고, 파스튜렐라성 폐렴과 흉막 폐렴발생이 높아 지게 된다.
위축성 비염은 보르데텔라균과 파스튜렐라균의 상호작용에 의한 것이라고 알려져 있다. 기관지패혈증 보르데텔라균(Bordetella bronchiceptica)이 근본적인 병인체이며, 파스튜렐라균(Pasteurella multocida)도 2차적으로 감염하여 병변을 조장하는 역할을 한다. 보르데텔라균은 비강점막상피에 자극을 줌으로써 파스튜렐라균의 정착을 허용케 하는 역할을 한다. 상기 위축성 비염은 만성 소모성 질병으로 자돈에서 발생하여 비염증세(재채기), 코와 안면 골의 변형(코 삐뚤림, 주둥이 위축 등), 증체량 저하 등을 발생시킨다.
돼지의 경우, 집단사육으로 인해 어린 자돈들이 과거에 비해 면역능력과 질병에 대한 항병력이 매우 낮아져 조그마한 스트레스가 가해져도 바로 병원체에 노출되어 높은 폐사율을 나타내고 있다.
한편, 양계산업에서 가금티푸스(Fowl typhoid:FT)는 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급, 만성의 전염병으로서, 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징인 질병이다. 원인체는 살모넬라균의 일종인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)이라는 세균으로 알려져 있다. 가금티푸스는 1900년대 초기에 전 세계적으로 발생하여 양계산업에 막대한 손실을 주었는데, 국내에서의 발생은 1992년 처음 보고되었고, 1994년 이후 전국적으로 발병하여 최근 양계농가에 막대한 경제적 손실을 주고 있다.
한편, 농업 분야에 있어서, 식물 병해의 발생은 작물 수확량의 대폭적인 감소를 일으키므로, 식물 병해의 방제는 농업기술상 필수적 수단이다. 방제에 있어, 농원예용 항진균제 또는 살균제에 의한 방제가 직접적이면서 가장 효과가 높다. 그러나, 환경오염 및 환경 생물에 미치는 영향 등과 같은 문제 때문에, 화합물 기반의 항진균제를 다량 사용하는 것은 바람직하지 못하다. 이에 최근 자연계에 보편적으로 존재하는 미생물이나 천적을 이용하여 각종 작물 병해나 해충을 방제하는 방법이 많이 논의되고 있다.
대한민국 특허출원번호 제10-2009-0042507호(출원일자: 2009. 04. 30)에는, "돼지 위축성 비염의 예방 및 치료를 위해 아미카신 및 이의약제학적으로 허용 가능한 염과, 베타-글루칸을 유효성분을 포함하는 비강 분무용 조성물"이 기재되어 있다. 대한민국 특허출원 제10-2008-0083840호(출원일자: 2008. 09. 19)에는, "항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 317"가 기재되어 있다 .
본 발명에서는 항균 및 항진균 효과가 있는 새로운 미생물을 분리하여 제공하고, 이를 바탕으로 항균, 항진균제 더 나아가 사료, 동물 의약품, 농약 비료로 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는그 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균제를 제공한다. 이때, 상기 항균제는 바람직하게 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella b ronchiseptica) 또는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생육 저해용인 것일 수 있다. 상기 항균제는 세정 용도의 세정제 또는 사료에 첨가되는 첨가제일 수도 있다.
한편, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제 또는 사료를 제공한다. 이때, 상기 사료 첨가제 또는 사료는 바람직하게 돼지 또는 닭의 사료 첨가제 또는 사료일 수 있다. 가축들은 사료를 통해 병원성 미생물에 오염되기 쉬운데, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 사료에 첨가할 경우, 병원균의 증식을 억제하여 병원균의 감염으로부터 가축을 보호할 수 있다.
한편, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항진균제를 제공한다. 이때, 상기 항진균제는 바람직하게 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f.sp. raphani), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f.sp. niveum) 중 선택되는 어느 하나의 생육 저해용일 수 있다. 또한, 상기 항진균제는 바람직하게 잎집무늬마름병, 시들 음병 및 덩굴쪼김병 중 선택되는 어느 하나 이상의 식물 질병 방제용일 수 있다. 상기 항진균제는 세정 용도의 세정제, 농약 또는 비료에 첨가되는 첨가제일 수도 있다.
한편, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 비료 첨가제 또는 비료를 제공한다. 비료 첨가제 또는 비료에 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 첨가할 경우, 병원성 진균의 증식을 억제하여 감염으로부터 식물을 보호할 수 있다.
본 발명에서 새롭게 분리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP)은 축산업에서, 돼지 위축성비염 원인균인 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella Bronchiseptica)와 가금 티푸스의 원인균인 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)을 저해하는 항균효과가 뛰어남이 확인되었다.
또한, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 EBN-TK3 (KCTC 12382BP)은 농업에서, 잎집무늬마름병의 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f.sp. raphani) 그리고 덩굴쪼김병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)을 억제 및 저해하는 항진균 효과가 뛰어남이 확인되었다.
도 1은 후보 균주에 의한 돼지위축성비염 원인균인 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica)의 생육저해 효과를 보여준다. ◇ : 대조군, □ : 10㎕/㎖ 처리, △: 30㎕/㎖ 처리, ○: 50㎕/㎖ 처리).
도 2는 후보 균주에 의한 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나룸( Salmonella gallinarum)의 생육저해 효과를 보여준다. ◇ : 대조군, □ : 10㎕/㎖ 처리, △: 30㎕/㎖ 처리, ○: 50㎕/㎖ 처리).
도 3은 본 발명에서 순수하게 분리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 모습이다.
도 4는 본 발명에서 순수하게 분리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 NB 배지에서의 배양결과를 나타낸다. ◇ : pH 4, □: pH 6, △: pH 7, ○ : pH 8.
도 5는 본 발명에서 순수하게 분리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 LB 배지에서의 배양결과를 나타낸다. ◇ : pH 4, □: pH 6, △: pH 7, ○ : pH 8.
도 6은 본 발명에서 순수하게 분리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 생균수 변화를 관찰한 결과이다. ◇ : pH 4, □: pH 6, △: pH 7, ○ : pH 8.
도 7은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 항진균능 테스트 결과이다. 도 7에서 좌측은 대조군이고, 우측은 실험군이다.
도 8은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f.sp. raphani)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 항진균능 테스트 결과이다. 도 8에서 좌측은 대조군이고, 우측은 실험군이다.
도 9는 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 항진균능 테스트 결과이다. 도 9에서 좌측은 대조군이고, 우측은 실험군이다.
도 10은 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 사이드로포어 활성에 의한 클리어 존의 형성을 보여준다. (좌: 1일 후, 우: 3일 후)
도 11은 배양 시간의 경과에 따른 KB 배지에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 사이드로포어 생성량 변화를 보여준다.
도 12는 배양 시간의 경과에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 람노리피드(rhamnolipid) 생성량을 보여준다.
도 13은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 람노리피드(rhamnolipid) 생성에 따른 클리어 존(clear zone) 형성 여부를 보여준다. 좌측은 "MS + 2% 글루코오스" 배지에서의 결과이고, 우측은 "MS + 2% 글리세롤" 배지에서의 결과이다.
도 14는 블러드 아가(Blood agar)에서, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 생물계면활성제(Biosurfactin) 생성에 따른 클리어 존 형성 여부를 보여준다. 좌측: 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)을 도말한 뒤 분리된 균주를 획선배양한 것으로 3시 방향에 있는 클리어존이 TK3에 의한 것임. 우측: 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica)을 도말 한 뒤, 분리된 균주를 획선배양한 것으로 9시 방향에 있는 클리어존이 TK3에 의한 것임.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실험 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 후보 균주의 분리]
본 실시예에서는 후보 균주를 분리하고자 하였다. 우선 사육중인 돼지의 비강으로 샘플을 분리하고자 하였다. 멸균한 면봉을 이용하여 비강을 5회 이상 문지른 후, 이 면봉을 멸균한 생리식염(0.85% NaCl)에 세척하고 이 생리식염수를 10- 6까지 단계 희석하였다. 각각의 희석된 생리식염수 100 ㎕를 LB 아가 배지 (10 g 염화나트륨, 5 g 이스트 익스트랙트, 10 g 트립톤, 15 g 아가 분말, 1 L 증류수)에 도말하고, 30℃ 암조건에서 정치배양하였다. 콜로니가 형성되면 형태나 색 혹은 특성에 따라 육안상 구분하고, 새로운 LB 아가 배지에 획선배양 하였다. 단일 콜로니로 나올 때까지 LB 아가 배지에서 계대배양을 계속 실시하여, 순수한 균주를 분리하였다.
[ 실시예 2: 후보 균주의 스크리닝]
본 실시예에서는 항균활성 테스트(clear zone test)를 통해 후보 균주를 스크리닝하고자 하였다. 즉, 상기에서 순수하게 분리된 균주들에 대해 항균, 항진균능 시험을 수행하여 후보 균주를 최종 선별하고자 하였다. 1차 선별을 위해, 돼지의 병원성균인 보르데텔라 브론키세프티카(B. bronchiseptica)와 가금류의 병원성균인 살모넬라 갈리나룸(S. gallinarum)을 각각 100 μl씩 LB 아가 배지에 도말한 뒤, 상기에서 순수 분리된 콜로니를 획선 배양하여 클리어존 형성 유무를 관찰함으로써 후보군을 선별하고자 하였다.
실험 결과, 후보 균주 1종에서 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchis eptica), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gall inarum)의 성장을 저해함을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 3: 후보 균주의 항균 활성 능력 확인]
본 실시예에서는 후보 균주의 항균 활성 능력을 확인하고자 하였다. 실험을 위해, 상기에서 선별된 후보 균주를 LB 배지에서 24h, 160rpm, 30℃의 조건으로 배양하였다. OD600에서 1로 보정한 뒤 36h 배양하였다. 그 후, 10000×g, 4℃, 20 min의 조건으로 원심분리하였다. 6N HCl로 상층액의 pH를 2로 만들고 4℃에서 30분간 놓아두었다. 그 후, 15 ml 메탄올로 용해시킨 뒤 10000×g, 20 min, 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 회수하여 버렸다. 펠렛을 제거한 뒤, 1N NaOH을 첨가하여 pH 7로 만들고 0.22 ㎛ 소수성 필터(hydrophobic filter)로 여과하였다. 이후, "Rotary vacuum evaporator"로 물질을 회수하였다. 동결건조기를 이용해서 회수한 물질을 동결건조하고 실험을 위한 샘플로 최종 준비하였다.
준비된 샘플을 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 다양한 농도로 처리하여 생육저해 정도를 확인하였다.
실험 결과, 30㎕/㎖이상 투입 시, 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 성장을 저해하는 것으로 확인되었다(도 1, 2).
도 1은 후보 균주에 의한 돼지위축성비염 원인균인 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica)의 생육저해 효과를 보여준다. ◇ : 대조군, □ : 10㎕/㎖ 처리, △: 30㎕/㎖ 처리, ○: 50㎕/㎖ 처리).
도 2는 후보 균주에 의한 가금 티푸스 원인균인 살모넬라 갈리나룸( Salmonella gallinarum)의 생육저해 효과를 보여준다. ◇ : 대조군, □ : 10㎕/㎖ 처리, △: 30㎕/㎖ 처리, ○: 50㎕/㎖ 처리).
[ 실시예 4: 후보 균주의 동정]
본 실시예에서는 상기에서 분리하고 항균 능력이 최종 확인된 균주를 동정하고자 하였다. 상기에서 최종 선별된 균주의 16S rRNA를 분석한 결과, 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었고, 균주명을 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3으로 하여 한국생명공학연구원에 기탁하여 KCTC 12382BP의 기탁번호를 부여받았다.
도 3은 본 발명에서 분리하고 기탁한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 형태를 보여주고, 표 1에 본 발명 균주의 간단한 특성을 나타냈다.

균주명
바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)
그람 염색 양성(+)
운동성 O
모양 간균
[ 실시예 5: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) EBN - TK3 (KCTC 12382 BP ) 균주의 배양 특성 분석]
본 실시예에서는 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주를 배양하여 배양 특성을 분석하고자 하였다.
LB 아가 배지에서 순수하게 분리된 균주의 콜로니 하나를 화염 멸균한 백금이를 이용하여 멸균된 LB 배지(Luria-Bertani broth) 및 NB(Nurient Broth) 배지에 접종하여, 30℃(50 rpm)의 암조건에서 1일간 배양하였다. 배지에 따른 성장도에서 LB가 NB에 비해 더 우수하게 나타났다.
NB 배지에서의 배양결과를 도 4에 나타냈고, LB 배지에서 배양결과를 도 5에 나타내었다. 도 4 및 5에서, ◇는 pH 4, □는 pH 6, △는 pH 7, ○는 pH 8의 결과이다.
한편, 도 6은 LB배지에서, pH에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 생균수 변화를 관찰한 결과이다. 도 6에서, ◇는 pH 4, □는 pH 6, △는 pH 7, ○는 pH 8의 결과이다. 접종 이후 16 ~ 20시간에 pH 7의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 생균수는 8.5 ~ 8.8 Log CFU/ml로 나타났다.
[ 실시예 6: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ( B. amyloliquefaciens ) EBN - TK3 의 항진균 효능 확인]
본 실시예에서는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquefaciens) EBN-TK3에 의한 작물 잎집무늬마름병 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp . raphani), 덩굴쪼김병원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp . niveum)의 억제능을 알아보기 위해 향진균능 테스트를 실시하였다.
본 테스트는 식물 병원성 곰팡이의 생장억제를 확인하기 위한 것으로, PDB(potato dextrose broth) 고체배지에서 실험을 실시하였다. 멸균된 필터 페이퍼(filter paper)에 TK3 균주를 접종한 것과 접종하지 않은 대조군을 고체 배지 정중앙에 위치시키고 가장 자리에 식물병원성 곰팡이 (지름 1cm)놓은 뒤 30℃에서 배양하였다. 그 뒤 대조군에 배양한 식물병원성 곰팡이가 필터 페이퍼에 접촉되면 실험을 종료하였다.
실험결과, 도 7, 8, 9로부터 확인되는 바와 같이 항진균 효능이 확인되었다.
도 7은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 항진균능 테스트 결과이다(좌측은 대조군, 우측은 실험군). 도 8은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f. sp . raphani)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 항진균능 테스트 결과이다(좌측은 대조군, 우측은 실험군). 도 9는 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f. sp . niveum)에 대한 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 항진균능 테스트 결과이다(좌측은 대조군, 우측은 실험군).
[ 실시예 7: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) EBN - TK3 (KCTC 12382 BP ) 균주의 사이드로포어 ( siderophore ) 생성 확인]
사이드로포어(siderophore)는 병원성 세균들을 포함한 미생물들이 다른 미생물과의 경쟁하여 주어진 환경에서 빠르게 성장 및 증식하기 위하여 생산하는 일종의 항생물질로서, 철 이온(Fe3 +)과 결합 후 철수송계(high-affinity iron-transport system)를 이용해 세포 내로 수송되며, 상기 철 이온(Fe3 +)을 미생물의 생육에 이용한다. 미생물은 경쟁적으로 철 이온(Fe3 +)을 이용하기 위하여 사이드로포어를 생산하며, 사이드로포어 생산이 많은 미생물에 의해 타 미생물의 생육이 억제되기도 한다.
본 실시예에서는 "chromee azurol S (CAS) agar plate assy" 방법을 이용하여 사이드로포어 활성을 측정하고 정량분석하였다.
(1) 사이드로포어 활성 측정
1)Ⅰ단계: 다크 블루 용액(dark blue solution) 제조
① 증류수 50 ml에 CAS 60mg 용해시킴.
② 10 mM HCl에 FeCl3·6H2O를 1 mM로 만들어 녹인 후, 10 ml를 상기 ①에 넣음.
③ 증류수 40 ml에 HDTMA 72.9 mg를 상기 ②에 넣음.
④ 멸균
2) Ⅱ단계
① 증류수 900 ml에 30.24 g PIPES(PIPERAZINE-1,4-bisethanesulfonic Acid, C8H18N2O6S2), 16g 아가를 넣음.
② pH를 6.8로 맞춘 후 멸균시킴
3) 상기Ⅰ 단계 제조 용액과 Ⅱ 단계 제조 용액을 혼합한 후, 거품이 나지 않도록 천천히 섞어주었다. 이후, 5mm 직경으로 구멍을 뚫고, KB(King's B) 배지에 배양 중인 본 발명의 균주를 70μl 넣어주었다. 그 후, CAS 고체배지가 파란색에서 노란색으로 변하는 것(clear zone)을 측정(cm)하여, 사이드로포어의 활성을 측정하였다.
도 10은 그 실험 결과를 보여준다. 도 10에서 보는 바와 같이 클리어 존의 형성을 확인할 수 있었다. 도 10은 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 사이드로포어 활성에 의한 클리어 존의 형성을 보여준다. (좌: 1일 후, 우: 3일 후)
(2) 사이드로포어의 정량분석
① 우선 하기 표 2와 같이 조성된 KB(King's B) 배지에, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주를 선 배양한 후, 600 nm에서 1.0 보정하였다.
시약 정제수에 대한 첨가 함량(g/L)
프로테아제 펩톤(protease peptone) 20
글리세롤(glycerol) 10ml
제1인산칼륨(KH2PO4) 1.5
황산마그네슘7수화물(MgSO4·7H2O) 1.5
수소이온지수(pH) 7.2로 적정
② 원심분리 후 상등액을 pH 2.9로 보정하였다.
③ 이후, 상등액에 동량의 아세트산에틸(ethyl acetate)을 혼합하여 추출하였다.
④ 이후 원심분리를 하여, 상층 아세트산에틸(ethyl acetate) 5 ml를 회수한 후, 하스웨이(hathway) 용액을 5 mL 첨가하고, 20분간 반응시켰다. 이때, 하스웨이 용액은 증류수 100 ml에, 0.1 M HCl 용액을 이용하여 만든 0.1 M FeCl3 1 ml와 0.1 M 페리시안화 칼륨(potassium ferric cyanide) 1 ml을 첨가해 제조하였다.
⑤ 반응 후, 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준곡선은 디히드록시 벤조산(dihydroxy benzoic acid)을 사용하여 작성하였다.
상기와 같은 실험 결과, 시간의 경과에 따른 사이드로포어의 생성이 확인되었는데, 도 11에서 보는 바와 같았다. 도 11은 시간의 경과에 따른 KB 배지에서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 사이드로포어 생성량 변화를 보여준다.
한편, 본 발명의 사이드로포어 생성량을 기존의 우수 균주와 비교해 보았고, 그 결과를 표 3에 정리하여 나타냈다.
균주명＼단위 사이드로포어 생성량(ｕmol/ml)
TK3 1057
PfMDU21 ) 14
RFO412 ) 40
1) 녹농균(Pseudomonas fluorescens) PfMDU2. (Nagarajkumar M., R. Bhaskaran and Velazhahan R. 2004. Involvement of secondary metabolites and extracellular lytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens in inhibition of Rhizoctonia solani, the rice sheath blight pathogen. Microbiological Research 159(1):73-81)
2) 바실러스균(Bacillus sp.) RFO41. (Lee, K.-H. and Song, H.-G. 2008. Production of antifungal materials by Bacillus sp . which inhibit growth of Phytophthora infestans and Fusarium oxysporum. The Korean Journal of Microbiology. 44, 258-263)
비교 결과, 사이드로포어 생성능이 우수한 선행 타 균주에 비해서, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)가 월등한 사이드로포어 생성능을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 균주는 병원성 진균류의 확산, 정착 등 예방에 우수한 효과를 낼 수 있을 것으로 예측할 수 있었다.
[ 실시예 8: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) EBN - TK3 (KCTC 12382 BP ) 균주의 람노리피드 ( Rhamnolipid ) 생성 확인]
녹농균으로 알려져 있는 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 속의 균들이 대사산물로 생산하는 물질에는 리포-펩타이드류(Lipo-peptides)와 람노리피드(Rhamnolipids), 파이롤리트린(Pyrrolnitrin), 파이오루테오린(Pyoluteorin), 페나진류(Phenazines) 등이 있다. 람노리피드는 글리코리피드(Glycolipid)계 당지질로 구성되며, 일반적으로 한 개 혹은 두 개의 람노스(Rhamnose)에 한 개 또는 두 개의 지방쇄(Lipid Chain)를 가진 베타-하이드록시데카노익액시드로, 항균기능과 함께 천연 계면활성제(Biosurfactant)로서의 기능을 가진다.
본 실시예에서는 하기의 표 4로 조성된 배지를 사용하여, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 람노리피드 생성능을 확인하고자 하였다.
EBN-TK3균주를 MS 배지(하기 표 4, 5)에서 선 배양한 뒤, RBSSM 배지(하기 표 6)에 지름 0.5cm로 구멍을 뚫은 뒤 접종하여 클리어 존 여부를 확인하였다. 클리어 존이 생성된 것을 보고 오르시놀 어세이(Orcinol assay)를 통해 람노리피드를 측정하였다.
MS 배지 정제수에 대한 첨가 함량 (g/L)
NaNO3 15
KCl 1.1
NaCl 1.1
FeSO4·7H2O 0.00028
KH2PO4 3.4
K2HPO4 4.4
MgSO47H2O 0.5
이스트 익스트랙트(yeast extract) 0.5
트레이스 엘리먼트 용액(trace element solution) 5 ml
트레이스 엘리먼트 용액 정제수에 대한 첨가 함량 (g/L)
ZnSO4 ·7H2O 0.29
CaCl2·7H2O 0.24
CuSO4·7H2O 0.25
MnSO4 ·7H2O 0.17
RBSSM 배지 정제수에 대한 첨가 함량(g/L)
비트추출물(beet extract) 1.0
글루코오스(glucose) 20.0
펩톤(peptone) 5.0
이스트 익스트랙트(yeast extract) 0.2
N,N,N-trimehtyl-1-hexadecane ammonium bromide 0.2
메틸블루(methyl blue) 0.005
아가(agar) 16.0
측정을 위해, MS 배지에서 선 배양 한 균주를 OD600=1.0으로 보정을 한 뒤 24시간 간격으로 하기와 같이 측정하였다.
① E-tube에 1ml의 균주배양액을 넣고 10,000×g로 원심분리하였다.
② 0.5 ml의 상층액에 클로로포름 : 에탄올 = 2 : 1 (v/v) 1 ml를 넣고 30분 동안 추출을 하였다.
③ 추출이 끝나면 원심분리기를 이용하여 10,000×g로 원심분리하였다.
④ 50 ml의 코니칼 튜브(conical tube)에 용매를 넣고 감압하여 용매를 증발시켰다.
⑤ 그 뒤 0.5 ml의 증류수를 넣고 잘 섞어주었다.
⑥ 0.1 ml를 황산 53%에 녹인 0.19 % 오르시놀 용액(orcinol solution)을 0.9 ml 넣어주었다.
⑦ 잘 섞어준 뒤, 암조건 80 ℃에서 30분간 가열을 하였다.
⑧ 암조건, 상온에서 3시간 식힌 후 OD421에서 흡광도를 측정함. 표준곡선은 L-Rhamnose를 이용하였다.
실험 결과, 배양 시간의 경과에 따른 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 람노리피드 생성량은 도 12와 같이 나타났다. 도 12는 배양 시간의 경과에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 람노리피드 생성량을 보여준다.
한편, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP)의 람노리피드 생성량을 종래의 우수한 생성능을 가진 균주와 비교해 보았고, 그 결과를 하기 표 7에 정리하였다.

분리균주＼단위
"MS + 글리세롤" 배지에서
람노리피드(rhamnolipid)의 생성량
(mg/L)

"MS + 글루코오스" 배지에서
람노람노드(rhamnolipid)의 생성량
(mg/L)
TK3 82.3 34.4
PEER021 ) -a3 ) 785
59C72 ) -a3 ) 1125
1) 선행보고된 람노리피드 생성 우수 균주인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) PEER02 (Wang, Q., Fang, X., Bai, B., Liang, X., Shuler, P. J., Goddard III, W. A. and Tang, Y. 2007. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology Bioengineering. 98, 842-853)
2) 선행보고된 람노리피드 생성 우수 균주인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 59C7 (Koch, A. K., K, O., Fiechter, A. and Reiser, J. 1991. Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants. Journal of Bacteriology. 173, 4212-4219)
3) not tested in this condition
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명 TK3 균주에 의해 람노리피드의 생성이 확인되었다. 다만, 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따라 생성량이 변화함을 확인할 수 있었다.
한편, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 람노리피드 생성에 따른 클리어 존(clear zone) 형성 여부를 확인하였는데, 도 13에서 보는 바와 같이 "MS + 2% 글루코오스", "MS + 2% 글리세롤" 고체 배지에서 본 발명 TK3 균주의 활성에 의한 투명대가 생겼다. 다만, 탄소원에 따라 람노리피드 생성능 차이가 확인되었다. 도 13은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 람노리피드 생성에 따른 클리어 존(clear zone) 형성 여부를 보여준다. 좌측은 "MS + 2% 글루코오스" 배지에서의 결과이고, 우측은 "MS + 2% 글리세롤" 배지에서의 결과이다.
[ 실시예 9: 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) EBN - TK3 (KCTC 12382 BP )의 서팩틴 ( Surfactin ) 생성]
서팩틴(M.W.: 1036 Da)은 헵타펩타이드(LLDLLDL)와 베타 히드록시 지방산을 함유한 고리형 리포펩타이드 생물계면활성제이다. 이 생물계면활성제는 항 미코플라즈마(anti-mycoplasma), 항 바이러스(anti-viral), 항 섬유소생성(anti-fibrinogenic), 항 고콜레스테롤(anti-hypercholesterolemic) 및 항염(anti-inflammatory) 기능의 다양한 생물학적 활성을 갖는 천연항균 물질로 알려져 있다.
본 실시예에서는 블러드 아가(Blood agar)에서, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 생물계면활성제(Biosurfactin) 생성에 따른 클리어 존 형성 여부에 대하여 실험하였다.
LB 액체 배지에 EBN-TK3과 두 병원균 (S. gallinarum and B. bronchiseptica)를 선배양 한 뒤 블러드 아가(blood agar)에 각각의 병원균을 도말 하였다. 그 뒤 동일한 간격으로 EBN-TK3를 획선배양 한 뒤 30℃에서 배양하여 클리어 존 형성 여부를 관찰하였다.
실험 결과, 도 14에서 보듯이 항균 펩티드(antimicrobial peptide, AMP) 활성에 의하여 클리어 존이 형성됨이 확인되었다. 도 14는 블러드 아가(Blood agar)에서, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 균주의 생물계면활성제(Biosurfactin) 생성에 따른 클리어 존 형성 여부를 보여준다. 도 14의 좌측은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)을 도말한 뒤 분리된 균주를 획선배양한 것으로 3시 방향에 있는 클리어존이 TK3에 의한 것이다. 도 14의 우측은 보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica)을 도말 한 뒤, 분리된 균주를 획선배양한 것으로 9시 방향에 있는 클리어존이 TK3에 의한 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12382BP 20130314

Claims (12)

  1. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP).
  2. 삭제
  3. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하며,
    보르데텔라 브론키세프티카(Bordetella bronchiseptica) 또는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생육 저해용인 것을 특징으로 하는 항균제.
  4. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사료 첨가제는,
    돼지 또는 닭 사료 첨가제인 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
  6. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 사료는,
    돼지 또는 닭 사료인 것을 특징으로 하는 사료.
  8. 삭제
  9. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하며,
    리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 라파니(Fusarium oxysporum f.sp. raphani), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 니베움(Fusarium oxysporum f.sp. niveum) 중 선택되는 어느 하나의 생육 저해용인 것을 특징으로 하는 항진균제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항진균제는,
    잎집무늬마름병, 시들음병 및 덩굴쪼김병 중 선택되는 어느 하나 이상의 식물 질병 방제용인 것을 특징으로 하는 항진균제.
  11. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 비료 첨가제.
  12. 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) EBN-TK3 (KCTC 12382BP) 또는 그 배양액을 함유하는 것을 특징으로 하는 비료.
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