KR101731034B1 - 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3) 균주 및 이를 함유한 미생물제제 - Google Patents

예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3) 균주 및 이를 함유한 미생물제제 Download PDF

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Abstract

기탁번호 KCTC18337P호로 기탁된 본 발명 잔디의 대취(thatch) 분해능과 항진균 활성화에 유용한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3)는 셀루로스(cellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 식물 세포벽을 강하게 분해하여 잔디 대취층을 효과적으로 분해하고, 이와 동시에 잔디 병원균에 대해 항균 활성이 우수하여 대취의 제거 및 방해방제에 효과가 있다.
또한, 본 발명 균주는 염류집적과 연작장해를 유발하는 인산을 가용화 활성시킴으로써, 농작물의 재배지, 골프장 등에서 잔디등 작물의 관리 생산성을 높일 수 있게 한다.

Description

예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3) 균주 및 이를 함유한 미생물제제{Bacillus amyloliquefaciens Ba3 strain having turf trash and thatch - decomposing activity and antifungal activity against plant pathogen, and microbial agent containing the same}
본 발명은 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 항진균 활성화에 유용한 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 및 이를 함유한 미생물제제에 관한 것으로써, 더 상세하게는 잔디에서 발생하는 예지물과 대취 축적층에 정착하여 셀루로스(cellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 식물 세포벽을 강하게 분해할 수 있는 미생물을 이용하여 대취층을 효과적으로 분해하고, 이와 동시에 식물 병원균 억제 효과가 우수한 미생물 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 및 이를 함유한 미생물제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하우스와 같은 농작물 재배지나 골프장에서 식물이 이용할 수 없는 형태로 축적되어 염류집적과 연작장해를 유발하는 주요 요인인 인산을 효과적으로 분해하여 농업 생산성을 높일 수 있도록 한 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 및 이를 함유한 미생물제제에 관한 것이다.
전 세계적으로 화학비료와 유기합성농약의 사용으로 농업 생산성이 증가하고 노동력과 시간을 줄이게 되었지만 이들의 사용으로 인해 발생되는 잔류 독성, 토양의 산성화, 먹이사슬에 미치는 영향, 수질 오염, 식물병원균의 농약 저항성 획득 등 환경에 심각한 부작용이 나타나고 있다.
이에 따라 유기합성농약의 사용량을 줄이는 활동이 늘어나고 있으며 Rio 환경회의에서 유기합성농약의 사용량을 2004년까지 50% 감소하자는 국가 간의 협약이 체결되었다. 근래 지속가능한 환경 친화적 농업에 관심이 점차 늘어나고 있으며 유기합성농약의 대안으로 생물학적 방제법에 관심이 점차 높아지고 있다.
이러한 사회적 이슈에도 골프장이나 학교 및 지자체 운동경기장에 이용되는 스포츠잔디의 관리는 화학농약과 비료를 다량으로 사용하고 있어 이들의 부작용으로 인한 주변 생태계의 위협은 물론 환경단체와 주변 지역주민들과의 마찰을 끊임없이 유발하고 있다.
잔디는 일반 농작물과 다르게 수확을 목적으로 하는 것이 아닌 스포츠 경기에 사용되므로 항상 최상의 상태를 유지하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고 코스관리자들은 화학농약과 비료를 다량으로 사용하는 것이 일반화되어 있고, 이는 잔디의 생육과 병방제에는 도움이 될 수 있으나 토양 산성화, 저항성 병해 증가, 환경오염 등의 부작용을 일으키고 있다.
잔디의 최대 수요지인 천연잔디운동장과 골프장에서는 수많은 사람과 장비에 의해, 지속적인 답압과 압밀화로 인하여 토양이 굳어지게 되는 조건 호기성 조건으로 변하기 쉽다. 이런 토양에서는 잔디의 생명이 다한 죽은 뿌리와 줄기 또는 예초에 의해 잘려진 잎이 축적되어 미분해 유기물(통상 대취(thatch)라고 함)로 존재한다.
토양에 축적된 대취는 토양 과습을 유발하기 때문에, 잔디 뿌리의 호흡작용을 어렵게 하여 식물체가 죽는 생리 장해를 유발하고 주요 병원균과 해충의 서식지 역할을 하여, 주요 병원균들의 발생 원인이 된다. 토양의 투수성과 통기성 불량을 제공하여, 시비효율을 감소시키는 등 잔디 관리상의 매우 중요한 문제를 야기하고 있다.
기존의 대취 관리는 배토(top-dressing), 코어링(coring) 및 그루밍(grooming) 등의 기계적 인위적 방법들로 이루어졌으나, 효과적인 관리 방법은 되지 못하였으며 이로 인한 잔디 관리 비용의 상승요인이 되었다.
또한 기계적 관리 방법은 잔디 표면을 단기적으로 손상시키는 결과를 초래하여, 비파괴적이고 효과적인 생물학적 대취 제거 방법을 찾기 위한 연구들이 수행되고 있으나 아직까지 뚜렷한 방법을 제시하지는 못한 실정이다.
따라서 잔디 식재지에 대취 구성성분을 비파괴적으로 감소시킬 수 있는 미생물의 이용은 대취가 주는 여러 가지 부정적 요소를 미연에 방지할 수 있으며, 기계적 관리에 필요한 비용과 인력을 절감하고 친환경적이라는 이점을 제공한다.
잔디에서 길항미생물을 이용한 식물병 방제 연구는 1993년 Hodges 등의 연구그룹이 Streptomyces 균주를 이용하여 동전마름병의 병원균인 Sclerotinia homeocarpa에 대한 항균활성을 보고하였고, 국내에서도 1996년 Hwang 등의 연구그룹에서 인삼의 뿌리썩음병 방제 미생물제제로 개발된 6가지 균주를 이용하여 잔디 피시움마름병(Phytium blight)에 대한 높은 방제 효과를 보고하였다.
최근 국내 기업에서 잔디 병해 방제를 위한 갈색잎마름병(Brown patch) 미생물 농약을 등록하였지만, 산업화 및 실용화는 극소수에 불과하였다. 또한 국내 토양 환경에 적합한 미생물을 이용하여 대취 관리를 목적으로 미생물 제제 산업화 연구는 전무한 실정이다.
미국특허 6,165,775 한국특허등록 10-0642283호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로써, 잔디에서 발생하는 예지물과 대취 축적층에 정착하여 셀루로스(cellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 식물 세포벽을 강하게 분해하여 잔디 대취층을 효과적으로 분해하고, 이와 동시에 잔디 병원균에 대해 항균 활성이 우수한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3) 균주와 이를 함유한 미생물제제를 제공하는 데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 하우스와 같은 농작물 재배지나 골프장에서 식물이 이용할 수 없는 형태로 축적되어 염류집적과 연작장해를 유발하는 주요 요인인 인산을 효과적으로 분해하여 농업 생산성을 높일 수 있도록 한 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 및 이를 함유한 미생물제제를 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하는 본 발명은 잔디 예지물 분해용 기탁번호 KCTC18337P호로 기탁된 잔디의 대취(thatch) 분해능과 항진균 활성화에 유용한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3)를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3) 균주를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
기탁번호 KCTC18337P호로 기탁된 본 발명 예지물 및 잔디의 대취(thatch) 분해능과 항진균 활성화에 유용한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3)는 셀루로스(cellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 식물 세포벽을 강하게 분해하여 잔디 대취층을 효과적으로 분해하고, 이와 동시에 잔디 병원균에 대해 항균 활성이 우수하여 대취의 제거 및 방해방제에 효과가 있다.
또한, 본 발명 균주는 염류집적과 연작장해를 유발하는 인산을 가용화 활성시킴으로써, 농작물의 재배지, 골프장 등에서 잔디등 작물의 관리 생산성을 높일 수 있게 한다.
도 1은 본 발명 미생물의 병원균(Rhizoctonia solani)에 대한 항균활성상태를 나타낸 사진
도 2는 본 발명 미생물의 병원균(Sclerotinia homoeocarpa)에 대한 항균활성상태를 나타낸 사진
도 3은 본 발명 미생물에 의한 셀룰로오즈 분해 활성상태를 나타낸 사진
도 4는 본 발명 미생물에 의한 펙틴 분해 활성상태를 나타낸 사진
도 5는 본 발명 미생물의 인산가용화 활성상태를 나타낸 사진
도 6은 본 발명 미생물의 이연가용화 활성상태를 나타낸 사진
도 7은 본 발명 미생물의 16S rRNA 염기서열에 따른 NCBI blast 결과
도 8은 본 발명 균주의 염기서열을 이용한 계통분류도(phylogenetinc tree)
도 9는 대취층(thatch layer)이 표현된 경기장에서 채취된 잔디의 단면사진
도 10은 잔디의 세포벽 구조를 설명도
본 발명 기탁번호 KCTC18337P호(한국생명공학원 미생물자원센터)로 기탁된 잔디의 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3)는 셀루로스(cellulose), 펙틴(pectin) 등과 같은 식물 세포벽(도 10 참조)을 강하게 분해하여 잔디 대취층(도 9 참조)을 효과적으로 분해하고, 이와 동시에 잔디 병원균에 대해 항균 활성이 우수하여 대취의 제거 및 방해방제에 효과가 있는 것으로써, 본 발명의 균주는 잔디 재배지 근권 토양 또는 잔디 예지물을 포함하는 토양에서 분리한 것으로, "Ba3"로 명명한다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 리족토니아 속(Rhizoctonia spp.), 스크레로티니아 속(Sclerotinia spp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 식물 병원균에 대한 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 리족토니아 속, 스크레로티니아 속의 식물 병원균 모두에 대한 항진균 활성을 갖는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)에 대한 항진균 활성을 나타낼 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 리족토니아 솔라니, 스크레로티니아 호모에오카르파에 대한 항진균 활성을 갖는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 잔디 대취층의 주요 구성성분인 셀룰로스(cellulose) 및 펙틴(pectin) 분해능 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는 농업 토양에서 문제되고 있는 인산집적에 대하여 분해 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는, 잔디의 갈색마름병 또는 동전마름병 등을 일으키는 식물 병원균을 방제하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는, 잔디의 대취(thatch)를 관리하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는, 하우스와 같은 농작물 재배지나 골프장에서 식물이 이용할 수 없는 형태로 축적되어 있는 인산에 대하여 인산가용화 세균으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제는, 유효성분 이외의 성분으로서, 예를 들어 소정의 담체, 점결제, 증점제, 고착제, 방부, 방미제, 용제, 안정화제, 산화 방지제, 자외선 방지제, 결정 석출 방지제, 소포제, 물성 향상제, 착색제 등을 함유할 수 있다.
담체로는, 고체 담체 또는 액체 담체 중 어느 하나 또는 둘 다 사용할 수 있다. 고체 담체로서 예를 들면, 전분, 활성탄, 대두 분말, 밀 분말, 나무 분말, 어류 분말, 분유 등의 동식물성 분말, 탈크, 카올린, 벤토나이트, 제올라이트, 규조토, 화이트카본, 클레이, 알루미나, 탄산칼슘, 염화칼륨, 황산암모늄 등의 광물성 분말을 사용할 수 있다. 액체 담체로서 예를 들면, 물, 이소프로필알코올, 에틸렌글리콜 등의 알코올류, 시클로헥사논, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노-n-부틸에테르 등의 에테르류, 케로신, 경유 등의 지방족 탄화수소류, 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 메틸나프탈렌, 용매 나프타 등의 방향족 탄화수소류, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류, 지방산의 글리세린에스테르 등의 에스테르류, 대두유, 유채씨유 등의 식물유를 사용할 수 있다.
점결제, 증점제, 고착제로서 예를 들면, 전분, 덱스트린, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸전분, 풀루란, 알긴산나트륨, 알긴산암모늄, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 구아검, 로커스트빈 검, 아라비아 고무, 크산탄 검, 젤라틴, 카제인, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌프로필렌 블록 중합체, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등을 사용 할 수 있다.
또한, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약은, 잔디의 갈색마름병 또는 동전마름병 등을일으키는 식물 병원균을 방제하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약은, 잔디의 대취(thatch)를 관리하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약은 살균제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약은 생장조절제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 잔디의 생장조절제일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 농약은 천연식물보호제일 수 있다.
"농약"이란, 농작물(수목, 농산물과 임산물을 포함한다)을 해치는 균, 곤충, 응애, 선충, 바이러스, 잡초, 그 밖에 농림축산식품부령으로 정하는 동식물을 방제하는 데에 사용하는 살균제살충제제초제, 농작물의 생리기능을 증진하거나 억제하는 데에 사용하는 약제 및 그 밖에 농림축산식품부령으로 정하는 약제를 말한다(농약관리법 제12426호, 2014.3.18., 개정 참조). 이와 같이 농약은, 용도에 따라, 살균제, 살충제, 제초제 또는 생장조절제 등으로 분류되며, '미생물 농약'은 세균, 바이러스 따위를 써서 식물의 해충이나 병균 따위를 죽이는 생물 농약을 말한다.
"천연식물보호제"란, 진균, 세균, 바이러스 또는 원생동물 등 살아있는 미생물을 유효성분으로 하여 제조한 농약 및 자연계에서 생성된 유기화합물 또는 무기화합물을 유효성분으로 하여 제조한 농약 중 어느 하나에 해당하는 농약으로서 농촌진흥청장이 정하여 고시하는 기준에 적합한 것을 말한다(농약관리법 제12426호, 2014.3.18., 개정 참조).
또한, 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 부산물 비료를 제공한다.
"비료"란, 식물에 영양을 주거나 식물의 재배를 돕기 위하여 흙에서 화학적 변화를 가져오게 하는 물질, 식물에 영양을 주는 물질, 그 밖에 농림축산식품부령으로 정하는 토양개량용 자재 등을 말하며, "부산물비료"란 농업임업축산업수산업제조업 또는 판매업을 영위하는 과정에서 나온 부산물, 사람의 분뇨, 음식물류 폐기물, 토양미생물 제제(제제, 토양효소 제제를 포함한다), 토양활성제 등을 이용하여 제조한 비료로서 농림축산식품부장관이 지정하는 것을 말한다(비료관리법 제11998호, 2013.8.6., 개정 참조).
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 부산물 비료는, 식물 성장을 촉진하거나 본 발명 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주의 성장을 촉진할 수 있도록 각종 영양분을 보충하는 함량으로 토양 또는 식물에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 부산물 비료는, 고체 입상 또는 응집된 배합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 부산물 비료는, 용액에 비료가 분산되도록 하기 위한 계면활성제, 유화제, 소포제 또는 분산제와 혼합될 수 있으며, 균질 수용액 또는 수성 불균질 현탁액 배합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 식물 또는 이의 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 재배지에서 발생하는 진균 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 진균 방제 방법은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 잔디 또는 이의 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) Ba3 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 잔디 또는 이의 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 잔디의 대취(thatch) 조절 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 제제를 식물 또는 이의 재배지에 처리하는 수단은, 예를 들어 미생물 제제를 잎의 표면 또는 이면에 도포하는 방법, 소정의 담체 등을 이용하여 미생물 제제를 잎의 표면 또는 이면에 부착시키는 방법, 미생물 제제를 잎에 산포 또는 공급하는 방법 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 미생물 제제의 도포량 또는 산포량은, 유효 성분의 농도, 제제의 형태, 대상 병해나 작물의 종류, 병해에 의한 피해의 정도, 시용 장소, 시용 방법, 시용 시기, 혼용병용하는 약제나 비료 등의 사용량, 종류 등의 여러가지 조건에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
미생물 Ba3 균주의 분리
잔디 재배지 근권 토양 또는 잔디 예지물을 포함하는 토양의 시료를 채취하고, 세균 분리는 채취한 토양 10g에 멸균 생리식염수로 10- 3 까지 희석하고 이를 영양한천(nutrient agar) 평판 배지(plate media)에 도말하였다. 26℃에서 48시간 동안 배양하여 자란 콜로니(colony)를 수집하여 다시 2~3회 정도 계대 배양하여 균을 순수분리 하였다.
각 균주별로 멸균한 백금이(platinum loop)를 이용하여 획선배양법(streak culture)으로 200개의 단일 콜로니를 다시 분리하여 실험에 사용하였다.
항진균 활성
분리된 미생물의 항진균 활성 측정은 분리 미생물을 접종원으로 사용하기 위하여 액체배지(NB broth)에 30℃, 24시간 동안 120rpm으로 진탕 배양하였으며, 식물 병원균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)(도 1), 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)(도 2) 균주는 미리 준비된 PDA 배지에 cork borer를 사용하여 병원균 균사를(1cm 크기) 90mm petridish를 사용하여 만들어진 PDA 배지에 3개의 점을 만들어 상부에 치상하였다.
병원균에서 30mm 떨어진 지점에 분리된 미생물들의 현탁액을 접종하고 26℃에서 5일간 배양하였고, 다른 한쪽은 멸균수(dH2O)을 대조구로 사용하였다. 후보 미생물 균주 콜로니의 가장자리와 각 식물 병원균주 콜로니의 가장자리 사이의 거리를 측정하였다. 그 결과, 표 1에서와 같이 Ba3 균주의 항진균 활성을 확인하였다. 위 실험을 2회 추가 반복 수행하였을 때에도 매우 유사한 경향을 나타내었다.
분리한 유용미생물의 잔디 병원균에 대한 길항능 평가
microorganism Rhizoctonia solani Sclerotinia homoeocarpa
Bacillus sp. 2.5±0.5b 9.2±3.0
Controla 0.0±0.0 0.0±0.0
a 멸균수 접종, b 값(mm)±표준편차
셀룰로즈 분해능
분리 미생물 접종원을, 0.5g/L의 K2HPO4, 0.25g/L의 MgSO4, 1.88g/L의 셀룰로스 분말(cellulose powder), 0.2g/L의 콩고 레드(Congo red), 2g/L의 젤라틴(gelatine) 및 15g/L의 한천 분말(agar powder)을 포함하는 셀룰로스 콩고 레드 한천(cellulose congo red agar) 고체 배지에 3개의 점을 만들어 미생물들의 현탁액을 접종하고 26℃에서 48시간 배양한 후, 각 접종원 주변에 투명환(clear zone, halo zone)이 형성되는지 여부에 따라 셀룰로스를 탄소원으로 이용하는 미생물의 투명환의 크기를 측정함으로써 셀룰로스 분해 정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서와 같이 투명환이 형성되지 않았던 대조군과 비교하여, Ba3 균주의 셀룰로스 분해능 활성을 확인하였다. 위 실험을 2회 추가 반복 수행하였을 때에도 매우 유사한 경향을 나타내었다.
펙틴 분해능
분리 미생물을 접종원을, 0.7g의 펙틴(pectin), 1.0g의 효모 추출물(yeastextract), 1.5g의 한천을 포함하는 중성 pH의 고체 배지에 26℃에서 48시간 배양한 후, 각 콜로니에 요오드 용액을 처리하였으며, 각 단일 콜로니 주변에 투명환(clear zone, halo zone)이 형성되는지 여부에 따라 펙틴을 탄소원으로 이용하는 미생물의 투명환의 크기를 측정함으로써 펙틴 분해 정도를 관찰하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 투명환이 형성되지 않았던 대조군과 비교하여, Ba3 균주의 펙틴 분해능 활성을 확인하였다.
분리한 유용미생물의 대취 구성성분인 cellulose, pectin 분해능 평가
microorganism cellulose degradation activity pectin degradation activity
Bacillus sp. 7.5±2.0b 4.2±1.8
Controla 0.0±0.0 0.0±0.0
a 멸균수 접종, b 값(mm)±표준편차,
인산분해능 및 아연분해능 평가
분리미생물의 인산 가용화능과 아연 가용화능을 측정하기 위해 Pikovskaya 배지에 0.5% TCP (Tricalcium phosphate)와 0.12% ZnO를 첨가하여 사용하였다.
배지에 균주를 접종 후 배양된 콜로니 주변의 투명대를 형성하는 특징을 이용하여 가용화 효율을 확인하였으며(표 3), 시험결과 Ba3 균주의 인산 가용화능(도 5) 및 아연가용화능(도 6)을 확인하였다. 인산은 하우스와 같은 농작물 재배지나 골프장에서 식물이 이용할 수 없는 형태로 축적되어 염류집적과 연작장해를 유발하는 주요 요인이기 때문에 분해능이 높은 미생물의 분리 및 이용은 농업 생산성을 높인다.
분리한 유용미생물의 인산가용화 및 아연 이용 능력 평가
microorganism phosphate soluble ability zinc soluble ability
Bacillus sp. 3.4±1.5b 1.5±0.3
Controla 0.0±0.0 0.0±0.0
a 멸균수 접종, b 값(mm)±표준편차,
미생물 Ba3 균주의 동정
선발된 Ba3 균주를 분자생물학적으로 동정(identification)하기 위하여, Ba3 균주의 콜로니를 NB(Nutrient Broth) 배지에 접종하여 26℃에서 3일 간 배양한 후, 솔젠트사의 정제 비드(SolGent purification bead)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
PCR(Polymerase chain reaction)에 사용한 프라이머(primer)는 하기 [표 4]에 나타낸 서열과 같았고, 솔젠트사의 EF-태그(SolGent EF-Taq)를 사용하였으며, PCR은, 95에서 15분간 DNA를 변성(Denaturation)시킨 후, 95℃에서 20초, 50℃에서 40초 및 72℃에서 1분 30초의 사이클(cycle)을 각 30회 반복한 다음, 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다.
PCR 생성물을 솔젠트사의 정제 키트(SolGent PCR purification kit)로 정제한 후, 1% 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)하여 확인하였고, 시퀀싱(sequencing)을 통해 16S rRNA의 서열(서열목록 1)을 확인하였다.
시퀀싱 결과를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm)에서 BLAST로 검색하여 99%의 상동성으로 Bacillus amyloliquefaciens 균주임을 도 7과 같이 확인하였고, CLUSTRAL X 프로그램 및treev32 프로그램으로 균주의 계통학적 위치를 도 8과 같이 확인하였다.
16S rRNA의 증폭을 위한 프라이머
프라이머 염기서열
forward primer : primer 27F 5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3'
reverse primer : primer 1492R 5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3'
<110> HANWOOL <120> Bacillus amyloliquefaciens Ba3 strain having turf trash and thatch - decomposing activity and antifungal activity against plant pathogen, and microbial agent containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1476 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA <400> 1 gggcatttgc gggtgctata catgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60 ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120 ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180 cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240 ccacccaagg gcaacgattg cgtagcsrac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300 agaacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtargga atcttccgca wtggacgaar 360 gttctgacgg agcaacgccg cggtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg 420 ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aacccagaaa 480 gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga 540 attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct 600 caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc 660 cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc 720 tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg 780 gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg 840 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca 1020 gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg ggttaagtcc 1080 cgcaacgagc gcaaaccctt gatcttagtt gccagcattt cagttggsca ctctaaggtg 1140 actgcmggtg acaamccgga ggaaggtggg gatgacggtc aaatcatcat gcccsttatg 1200 acstggsyta cacacgtgcc taacaatgga cmgaaacmaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260 taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320 agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380 tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440 taggagccag ccgccgaagg tggacaggtt ttgttc 1476

Claims (3)

  1. 기탁번호 KCTC18337P호로 기탁된, 예지물 및 대취(thatch) 분해능과 식물 병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖되,
    상기 식물 병원균은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 또는 스크레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquefaciens Ba3)균주.
  2. 삭제
  3. 제 1 항의 균주 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
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