KR102560771B1 - 유기물 분해 활성이 높은 리시니바실러스 마크로이데스 ｄｐｃｃ６ 및 이를 이용한 잔디의 대취 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유기물 분해 활성이 높은 Lysinibacillus macroides ＤＰＣＣ６ 및 이를 이용한 잔디의 대취 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 Lysinibacillus macroides DPCC6 균주(기탁번호 KFCC11884P)는 섬유소 및 단백질의 유기밀 분해활성이 높아, 잔디의 대취(thatch)이 분해에 유용하며, 아우러 잔디 라지패취 병원균에도 길항 효과를 가지고 있어서, 골프장의 잔디의 관리에 유용한 미생물이다.

Description

유기물 분해 활성이 높은 리시니바실러스 마크로이데스 ＤＰＣＣ６ 및 이를 이용한 잔디의 대취 조절 방법{Lysinibacillus macroides DPCC6 having high degradation activity of organic matter and methods of controlling the thatch of turfgrass by using thereof}

본 발명은 유기물 분해 활성이 높은 Ｌysinibacillus macroides에 관한 것이다.

전 세계적으로 화학비료와 유기합성농약의 사용으로 농업 생산성이 증가하고 노동력과 시간을 줄이게 되었지만 이들의 사용으로 인해 발생되는 잔류 독성, 토양의 산성화, 먹이사슬에 미치는 영향, 수질 오염, 식물병원균의 농약 저항성 획득 등 환경에 심각한 부작용이 나타나고 있다. 잔디는 일반 농작물과 다르게 수확을 목적으로 하는 것이 아닌 스포츠 경기에 사용되므로 항상 최상의 상태를 유지하는 것이 중요하다. 그럼에도 불구하고 코스관리자들은 화학농약과 비료를 다량으로 사용하는 것은 잔디의 생육과 병방제에는 도움이 될 수 있으나 토양 산성화, 저항성 병해 증가, 환경오염 등의 부작용의 원인이 된다.

대취(thatch)는 잔디의 잎, 줄기 및 뿌리 등이 노화되거나 깎기작업 후에 나온 찌거기가 잔디밭에 쌓인 것을 말한다. 즉, 아직 분해가 되지 않아 토양이나 지상부에 쌓여있는 유기물 층이다. 대취층(thatch layer)은 지상부의 잔디와 표토층 사이에 형성되는 혼합 유기물층으로서 그 구성요소는 잎, 줄기, 뿌리 등의 조직이 서로 얽혀 있다. 대취층은 잔디밭에 나타나는 특성중의 하나로 유기물의 생성속도가 분해속도보다 빠를 때 쉽게 나타난다. 매트는 무기화합물과 혼합된 대취를 말한다. 매트층은 대취층과 마찬가지로 지상부의 잔디와 표토층 사이에 형성되며 보통 골프코스에서 느끼는 잔디밭의 쿠션은 매트층에 의한 것이다.

대취가 과다하게 되면 병해충 발생조장 및 잔디생육에 큰 영향을 미치므로 적정수준이 넘지 않도록 경종적 방법이나 기계를 이용하여 제거해야 한다. 대취는 높은 리그닌을 포함하고 있으며 미생물에 의하여 분해가 잘 되지 않는다. 잔디줄기의 절간과 관부 조직은 분해가 가장 잘되지 않으며 줄기와 뿌리는 보통이며 잎은 분해가 가장 잘되는 부위이다. 대취는 공기와 비료의 효율적인 이동을 방해하여 잔디생육을 약화시키며, 병원균 및 해충의 서식지로 병 발생의 원인이 될 수 있다. 또한, 화학적으로는 리그닌 함량이 높기 때문에 물을 배척하는 소수성(hydrophobic)을 띠므로 잔디밭에 부분적으로 건조피해를 일으키기도 한다.

기존의 대취 관리는 배토(top-dressing), 코어링(coring) 및 그루밍(grooming) 등의 기계적 인위적 방법들로 이루어졌으나, 효과적인 관리 방법은 되지 못하였으며 이로 인한 잔디 관리 비용의 상승요인이 되었다. 또한 기계적 관리 방법은 잔디 표면을 단기적으로 손상시키는 결과를 초래하여, 비파괴적이고 효과적인 생물학적 대취 제거 방법을 찾기 위한 연구들이 수행되고 있으나 아직까지 뚜렷한 방법을 제시하지는 못한 실정이다. 따라서 잔디 식재지에 대취 구성성분을 비파괴적으로 감소시킬 수 있는 미생물의 이용은 대취가 주는 여러 가지 부정적 요소를 미연에 방지할 수 있으며, 기계적 관리에 필요한 비용과 인력을 절감하고 친환경적이라는 이점을 제공한다.

미생물은 유기물을 분해해서 식물의 영양소로 공급하는 역할을 한다. 골프장 잔디로 부터 만들어진 유기물은 미생물에 의해 다시 분해가 이루어져야 골프 잔디가 흡수하여 사용할 수 있다. 미생물의 역할에 의하여 식물이 이용하기 어려운 특수한 성분도 식물에 의해 흡수될 수 있는 형태로 변화될 수 있다. 따라서 유기물 분해효율이 높은 미생물은 토량의 개량에 유용하다. 골프장에서는 토양 대취층(유기물)이 라지패취의 발생에 주요한 원인이 되므로 높은 유기물 분해 능력은 라지패치의 발생을 감소시킨다.

유기물 분해능이 높은 균주는 여러종이 개시되었다. 한국 특허출원 10-2014-0161005호에서는 예지물 및 대취 분해능과 식물병원균에 대한 항진균 활성화 기능을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 Ba3(Bacillus amyloliquenfaciens Ba3)에 대해 개시하고 있다. 한국 특허출원 10-2007-0141682호에서는 유기물 분해 활성이 높은 내염성 할로모나스 속 균주를 개시하고 있다. 한국특허출원 10-2019-0158939호에서는 리그닌 분해활성을 가지는 Phlebiopsis crassa 균주를 개시하고 있다. 한국 특허 10-2020-0069592호에서는 탄수화물과 단백질 및 섬유소에 대한 분해능을 가진 Bacillus subtilis BS30 균주를 개시하고 있다.

본 발명자들은 골프장의 토양으로부터 라지 패치 병원균인 Rhizoctonia solani AG 2-2에 대한 길항 작용을 가지면서 높은 유기물 분해 활성이 높은 미생물을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유기물 분해효율이 높은 미생물 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 조성물를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 잔디의 대취(thatch) 조절제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 잔디의 대취 조절 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 위해서 본 발명의 제 1 의 목적은 유기물 분해효율이 높은 미생물 균주를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 상기 미생물은 Ｌysinibacillus macroides DPCC6(기탁번호 KFCC11884P)이다.

본 발명의 또 다른 형태는 Ｌysinibacillus macroides DPCC6(기탁번호 KFCC11884P)를 포함하는 유기물 분해용 미생물 제제를 제공 한다.

본 발명에 따른 Ｌysinibacillus macroides DPCC6(기탁번호 KFCC11884P) 균주 또는 이를 유효성분으로 함유하는 미생물은, 유효성분 이외의 성분으로서, 예를 들어 소정의 담체, 점결제, 증점제, 고착제, 방부, 방미제, 용제, 안정화제, 산화 방지제, 자외선 방지제, 결정 석출 방지제, 소포제, 물성 향상제, 착색제 등을 함유할 수 있다.

담체로는, 고체 담체 또는 액체 담체 중 어느 하나 또는 둘 다 사용할 수 있다. 고체 담체로서 예를 들면, 전분, 활성탄, 대두 분말, 밀 분말, 나무 분말, 어류 분말, 분유 등의 동식물성 분말, 탈크, 카올린, 벤토나이트,제올라이트, 규조토, 화이트카본, 클레이, 알루미나, 탄산칼슘, 염화칼륨, 황산암모늄 등의 광물성 분말을 사용할 수 있다. 액체 담체로서 예를 들면, 물, 이소프로필알코올, 에틸렌글리콜 등의 알코올류, 시클로헥사논, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 프로필렌글리콜모노메틸에테르, 디에틸렌글리콜모노-n-부틸에테르 등의 에테르류, 케로신, 경유 등의 지방족 탄화수소류, 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 메틸나프탈렌, 용매 나프타 등의 방향족 탄화수소류, N-메틸-2-피롤리돈 등의 아미드류, 지방산의 글리세린에스테르 등의 에스테르류, 대두유,유채씨유 등의 식물유를 사용할 수 있다.

점결제, 증점제, 고착제로서 예를 들면, 전분, 덱스트린, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸전분, 풀루란, 알긴산나트륨, 알긴산암모늄, 알긴산프로필렌글리콜에스테르, 구아검, 로커스트빈 검, 아라비아 고무, 크산탄 검, 젤라틴, 카제인, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜, 에틸렌프로필렌 블록 중합체, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등을 사용 할 수 있다.

본 발명의 또다른 태양은 본 발명에 따른 리시니바실러스 마크로이데스 균주 또는 이를 포함하는 미생물제제를 처리하는 단계를 포함하는 잔디의 대취(thatch) 조절 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 미생물 제제를 식물 또는 이의 재배지에 처리하는 수단은, 예를 들어 미생물 제제를 잎의 표면 또는 이면에 도포하는 방법, 소정의 담체 등을 이용하여 미생물 제제를 잎의 표면 또는 이면에 부착시키는 방법, 미생물 제제를 잎에 산포 또는 공급하는 방법 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 미생물 제제의 도포량 또는 산포량은, 유효 성분의 농도, 제제의 형태, 대상 병해나 작물의 종류, 병해에 의한 피해의 정도, 시용 장소, 시용 방법, 시용 시기, 혼용병용하는 약제나 비료 등의 사용량, 종류 등의 여러가지 조건에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물은 섬유소에 대한 분해 능력이 우수하다. 섬유소는 고분자 유기물로 자연 분해되는 데 많은 시간이 걸리기 때문에 섬유소 분해 능력을 가진 미생물은 페어웨이 토양의 대취 관리에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 미생물은 단백질에 대한 분해능력도 우수하였다. 또한 라지패취의 병원균의 성장 저해율이 우수하여 잔디의 대취관리 및 라지패치 병원균을 억제하여 골프장의 관리에 매우 유용한 미생물이다.

도 1은 본 발명에서 분리된 미생물 8종의 순수배양 결과를 보인다.
도 2 분리된 각각의 미생물의 라지패취 병원균 생육 억제 실험 결과를 보인다.
도 3은 분리된 각각의 미생물의 라지패취 병원균 생육 억제 실험 결과 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 분리된 각각의 미생물의 브라운패취 병원균 생육 억제 실험 결과를 보인다.
도 5는 분리된 각각의 미생물이 브라운패취 병원균 생육 억제 실험 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 분리된 각각의 미생물의 섬유소 분해 활성 실험 결과를 보인다.
도 7은 분리된 각각의 미생물의 단백질 분해 활성 실험 결과를 보인다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

나아가, 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 발명을 한정하려는 의도가 아니며, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.

[실시예 1] 균주의 분리

라지패취가 상습적으로 발생하는 지역과 병 발생이 거의 없는 지역을 선정하여 토양 샘플을 채취하였다(토양 채취 지역; 파크 4번, 10번 홀). 채취한 토양을 실온에서 2시간 건조한 후 위 아래를 잘 섞고, 잘 섞인 토양을 37℃ 건풍건조기에서 2시간 건조한 후, 건조된 시료를 다시 잘 섞어서 50g을 측정하여 100ml의 멸균수에 넣어 1시간 동안 진탕배양기에서 희석 혼합하였다. 5분간 안정시킨 후 상층액을 수집하였다. LB 배지 (MB cell, MB L-4478) 20g과 Agar(한천) 15g을 증류수 1L에 희석하여, 고온멸균기를 이용하여 1.2기압, 121℃에서 15분간 멸균한 후, 60℃이하까지 식힌 후 멸균대에서 오염에 조심하여, 페트리디쉬에 소분하고 굳힌 다음 수분이 없게 말려서 미생물 배지(LB 한천 배지)를 제조하였다. 상기 제조된 LB 한천 배지에 상기 수집된 상층액을 멸균수를 이용하여, 원액, 1/10,1/100, 1/1,000까지 희석하여준 후 희석된 시료별로 3반복하여 LB 한천배지에 도말하였다. 도말된 LB 한천배지를 잘 밀봉하여 25℃ 및 37℃에서 24시간 배양하였다. 상기 배양을 통해서 8종의 미생물을 분리하였고(도 1 참고), 잔디병원균에 대한 길항력 및 유기물 분해 능력을 검증하였고, 이중 유기물 분해능력이 우수한 균주를 선정하였고(DPCC6), DNA를 추출하여 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3; 서열번호 1)’와 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’; 서열번호 2) 프라이머를 이용하여 서열분석을 하였고, 분석결과 8종의 미생물로 동정되었고 이를 표 1로 나타내었다.

구분	유전자 분석 동정 결과
DPCC1	Pseudomonas straminea
DPCC2	Lysinibacillus pakistanensis
DPCC3	Bacillus paramycoides
DPCC4	Bacillus thuringiensis
DPCC5	Lysinibacillus boronitolerans
DPCC6	Lysinibacillus macroides
DPCC7	Lysinibacillus xylanilyticus
DPCC8	Bacillus wiedmannii

이 중 Lysinibacillus macroides DPCC6이 라지패치 병원균의 억제 및 유기물 분해활성이 높은 것을 확인하고, 이를 2021년5월 27일자 한국미생물보존센터에 기탁하였고, KFCC11884P로 기탁번호를 부여받았다.

[실시예 2] 잔디병원균에 대한 항균 활성의 검증

25℃에서 라지패취 병원균 Rhizoctonia solani AG 2-2 및 브라운패취 병원균 Rhizoctonia solani AG 1-1A와 분리된 미생물과 병원균들을 48시간 대치 배양하였다(3반복). 무처리구로는 병원균만 배양한 것을 사용하였다. 미생물별 대치 배양 후 클리어존 형성 여부 및 정도를 분석하여 잔디 병원균에 대한 길항력을 시험하였고, 라지패취 병원균 Rhizoctonia solani AG 2-2 에 대한 길항 실험 결과를 도 2 및 이의 3반복 실험결과를 평균하여 도 3에 그래프로 나타내었고, 브라운패취 병원균 Rhizoctonia solani AG 1-1A에 대한 길항 활성 실험 결과를 도 4에 및 3반복 실험결과를 평균하여 도 5에 나타내었다. 분리된 8개의 미생물 중 라지패취 병원균의 성장을 억제 능력이 우수한 미생물은 총 4종(DPCC5, DPCC6, DPCC7, DPCC8)이었고, 분리된 8개의 미생물 중 브라운패취 병원균의 성장을 억제하는 능력이 우수한 미생물은 총 2종(DPCC4, DPCC7)이었다.

[실시예 3] 분리된 미생물의 유기물 분해 능력 검증

분리된 미생물의 유기물 분해 능력을 검증하기 위해 CMC 배지(Carboxy-methyl cellulose; 섬유소 배지)를 이용해 미생물 배양을 하였다. CMC 배지는 증류수 800ml에 CMC 10g , 이스트 익스트렉트 2g, KH₂PO₄ 0.5g , MgSO₄ 0.2g를 넣고 서서히 가열하면서 녹인 후 pH 7.0로 조정하여 1% CMC를 제조하고, 2L 플라스크에 아가(Agar) 15g을 넣고 1% CMC 배지를 넣고 혼합한 다음, 삼각플라스크에 옮긴 후 고온멸균기를 이용하여 멸균 실시(멸균 조건, 1.2기압, 121℃에서 15분간 멸균)한 후 60℃이하까지 식힌 후 멸균대에서 오염에 조심하여 페트리디쉬에 소분하고 굳히고 수분이 없게 말렸다. 각각의 미생물을 CMC 배지에 접종하여 2일간 배양한 후 섬유소 분해 균주임을 확인하기 위해 Congo Red 염색 수행한 후 5M NaCl, 초산을 이용하여 형태를 고정하여 분해된 섬유소로 인해 생성된 할로(halo)의 크기를 측정하여 미생물별 분해 능력을 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 분리된 8개의 미생물 중 5종의 미생물(DPCC2, DPCC3, DPCC4, DPCC5, DPCC6)이 섬유소 분해 효능을 가지고 있었으며 그 중 3종(DPCC3, DPCC4, DPCC6)의 효능이 매우 우수하였다.

[실시예 4] 분리된 미생물의 단백질 분해 능력 검증

분리된 미생물의 단백질 분해 능력을 검증하기 위해, 1% 스킴 밀크(Skim milk) 배지를 제조하였다. 간략하게 소개하면, 두개의 삼각플라스크에 각각 600ml, 400ml의 증류수를 채우고, 600ml의 증류수를 채운 플라스크에 Yeast extract 1g을 넣고, 400ml의 증류수를 채운 플라스크에는 스킴밀크(skim milk) 10g을 넣고 혼합한 후 상기 600ml의 증류수를 채운 플라스크에 15g의 아가(Agar)를 넣었다. 상기 2개의 삼각플라스크를 멸균기를 이용하여 멸균(멸균 조건, 1.2기압, 121℃에서 15분간 멸균)하고, 멸균 완료 후 60℃이하까지 식힌 후 멸균대에서 두 개의 플라스크를 섞어주고 오염에 조심하여 페트리디쉬에 소분하고 굳혀서, 스킴 밀크 배지를 제조하였다. 각각의 미생물을 스킴 밀크 배지에 접종하여 2일간 배양하였다. 스킴 밀크내 단백질이 분해되면서 배지가 투명해지므로 생성된 할로( halo)의 크기를 측정하여 미생물별 분해 능력을 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 실험 결과 분리된 8개의 미생물 중 5종의 미생물(DPCC2, DPCC3, DPCC4, DPCC6,DPCC8)이 단백질 분해 효능을 가지고 있었으며 그 중 4종(DPCC3, DPCC4, DPCC6, DPCC8)의 효능이 매우 우수하였다.

[실시예 5] 분리된 미생물의 전분 분해 능력 검증

분리된 미생물의 단백질 분해 능력을 검증하기 위해,1% 녹말(Starch) 배지 제조하였다. 간략히 설명하면, 증류수 800㎖에 비프 익스트렉트(Beef extract) 5g, 펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 수용성 전분 10g을 녹이고 pH 6.8로 조정하고 아가(Agar) 15g에 넣고 녹인 후 전체 부피를 1L에 맞춘 후, 삼각플라스크에 옮긴 후 고온멸균기를 이용하여 멸균(멸균 조건, 1.2기압, 121℃에서 15분간 멸균)한 후 60℃이하까지 식힌 후 멸균대에서 오염에 조심하여 페트리디쉬에 소분하고 굳히고 수분이 없게 말린 다음, 각각의 미생물을 녹말(Starch) 배지에 접종하여 2일간 배양한 후 요오드 용액을 배지에 부어 생성된 할로(halo)의 크기를 측정하여 미생물별 녹말의 분해 능력을 분석하였으나, 분리된 8개의 미생물 중 전분 분해 효과를 보이는 미생물은 없었다.

<110> Dream Park Cultural Foundation Sudokwon Landfill Site Management Corporation <120> Lysinibacillus macroides DPCC6 having high degradation activity of organic matter and methods of controlling the thatch of turfgrass by using thereof <130> PN210032 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat cctggctca 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1. Lysinibacillus macroides DPCC6 균주(기탁번호 KFCC11884P).
2. 제 1 항에 따른 Lysinibacillus macroides DPCC6 균주(기탁번호 KFCC11884P)를 포함하는 섬유소 분해 조성물.
3. 제 1 항에 따른 Lysinibacillus macroides DPCC6 균주(기탁번호 KFCC11884P)를 포함하는 단백질 분해 조성물.
4. 삭제
5. 제 1 항에 따른 Lysinibacillus macroides DPCC6 균주(기탁번호 KFCC11884P)를 포함하는 섬유소 및 단백질 분해 조성물.
   
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제