KR20140095876A

KR20140095876A - Cellulose 분해능이 있는 길항미생물을 이용한 대취제거 및 병억제 방법

Info

Publication number: KR20140095876A
Application number: KR1020130008808A
Authority: KR
Inventors: 윤주천; 최상용; 권오범; 서성원
Original assignee: (주)누리바이오텍
Priority date: 2013-01-25
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2014-08-04

Abstract

본 발명은 대취의 생물학적인 처리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Cellulose분해능을 가지는 동시에 라지패취 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항작용을 하는 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)을 골프장 토양에서 분리하여 동정하고, 이 균주를 포함하는 미생물제제(조성물) 및 이를 이용한 대취제거 및 라지패취 병억제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 미생물제제는 대취 층의 유기물을 분해하여 영양원으로 이용하므로 대취를 제거하는 동시에 균주가 생산하는 활성성분이 병해를 유발하는 병원균의 생육을 억제시키고, 생균이 적용현장에서 서식하면서 병원균의 생육을 원천적으로 억제하는 작용기작에 의해 대취제거와 병원균의 억제에 지속적인 효과가 있다.

Description

Cellulose 분해능이 있는 길항미생물을 이용한 대취제거 및 병억제 방법 {Method of dethatching and preventing plant disease by antagonistic microorganisms to produce cellulase}

본 발명은 골프장에서 병원균의 서식처인 대취의 근본적인 해결을 위한 생물학적 처리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 골프장토양에서 Cellulose를 분해하는 미생물을 1차 분리하고 상기 분리된 균주 중에서 라지패취의 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia Solani)에 대한 길항능력이 있는 신규한 미생물인 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 분리, 이의 순수배양 물을 함유하는 미생물제제 및 이를 이용한 대취제거와 라지패취 병억제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)은 강원도인근 골프장토양에서 분리된 균주로 carboxyl methyl cellulose(CMC)가 포함된 고체배지에서 1차선별 후 선별된 상기 미생물들을 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항균활성 실험을 통해 선별된 가장 우수한 길항력이 있는 균주로 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)로 동정되었다. 본 발명에서 제조된 미생물제제의 실제 골프장에서의 효과를 알아보기 위해 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)을 배양하여 대취 층이 많이 형성된 1개 지역과 라지패취 병에 감염된 1개 지역에 처리하였다. 본 발명에 따르면 병원균 및 해충의 서식처인 대취 층의 빠른 제거는 물론 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia Solani)에 대한 방제용으로 효과가 있다.

대취(thatch)는 죽거나 살아있는 식물체의 새싹, 줄기, 뿌리의 혼합유기물 층으로 지상부의 잔디와 표토층 사이에 형성되며 특히 한국잔디류는 다른 잔디류보다 부식되기 어려운 리그닌 조직을 상대적으로 많이 함유하여 낮은 생육에도 불구하고 두꺼운 대취 층이 형성된다.

대취는 물을 배척하는 소수성이 있어 물의 침투를 방해하여 부분적인 드라이 스팟(dry spot)을 일으키고, 토양층에 공기와 비료의 이동을 저해하여 잔디의 생육을 약화시키며, 병원균 및 해충의 서식처 역할을 한다. 또한 잔디밭에 살포되는 살균, 살충제의 약효를 저하시키고, 잔디의 뿌리, 지하경의 생장이 대취 층 에서 이루어져 토양에 의한 보호력 상실로 고온장해, 동해, 건조해 에 대한 내성이 약화되며, 대취의 축적이 많을수록 잔디의 스캘핑(scalping) 현상이 잘 일어난다.

이러한 문제를 일으키는 대취를 제거하기 위해서 종래 골프장 등에서는 보통 스위퍼(sweeper)나 버티컷(verticut) 등의 기계적인 방법을 이용하고 있지만, 이러한 방법은 간편한 방법이라고는 말하기 어렵고 정기적으로 실시해야하며 대취를 충분히 제거할 수 없다. 그러므로 대취를 처리할 적절한 조치가 요구되나 현재까지 실제 골프장 등에서 적절하게 적용할만한 실효성 있는 방법은 없는 실정이다.

라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)는 대취 층에서 흔히 발견되는 병원균으로 잔디병중 가장 피해가 큰 병중에 하나인 라지패취(Large patch)를 발병시킨다. 발병지역에서 1~2년 주기로 계속 발병하며 특히 토양의 배수성이 불량하고 대기습도가 높을 때 발병이 심하다. 대취 층 에서 밀도가 가장 높고 대취 층의 지제부를 통해 전염되며 포자는 형성하지 않고 잔디의 잔사물, 대취, 살아있는 포복경 등에서 균사 혹은 균핵으로 월동하며 발병온도는 15~25도 전후이다. 방제 약제는 표면보호제인 몬세렌, 리조렉스와 부분 침투제인 로브랄, 선단이생성인 몬카트, 아족시스프로빈, 터부코나졸 등이 사용되고 있다. 그러나 잔디 병원균을 억제하기위해 사용되는 여러 화학농약은 환경오염을 초래하게 되고, 생태계를 따라 인간의 건강에도 영향을 미치게 된다. 뿐만 아니라 환경농약에 대한 병원균의 저항성 증가로 더 많은 농약을 사용하게 되는 문제가 발생된다. 따라서 화학농약의 사용을 줄이고 자연과 인간에 피해가 없이 사용할 수 있는 미생물제의 개발이 요구된다.

본 발명자들은 병원균의 서식처인 대취를 효과적으로 분해함과 동시에 라지패취 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항력이 있는 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)을 토양으로부터 분리하고 이를 이용하여 효과적인 잔디관리를 위한 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 첫 번째 목적은 Cellulose 분해능과 병원균에 대한 길항력을 함께 가지는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 두 번째 목적은 잔디병원균의 서식처인 대취를 빠른 속도로 분해하여 잔디병원균의 발생 및 확산을 미연에 방지할 수 있는 신규한 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 세 번째 목적은 대취 층에서 흔히 발생되는 라지패취의 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 길항적으로 작용하는 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 네 번째 목적은 한국의 골프장 토양에서 분리되어 한국의 골프장 토양에서 생육이 적합한 미생물을 이용하여 대취를 제거하는 방법 및 병원균에 길항작용을 하는 미생물의 처리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 강원도 인근의 골프장에서 Cellulose를 분해하는 미생물을 1차선별한 후 이 중 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 길항력이 있는 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)을 최종 선별하여 균주의 특성을 파악하고, 이 균주를 액체배양 하여 1×10⁵CFU/㎖ ~ 1×10¹⁰CFU/㎖ 바람직하게는 1×10⁸CFU/㎖으로 균수를 맞추어 대취 축적이 많은 지역과 라지패취 병에 감염된 지역에 처리하여 빠른 대취제거 및 라지패취 병억제에 효과적임을 밝혀냄으로써 달성되었다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)균주, 이를 포함하는 미생물제제(조성물)를 제공한다.

본 발명은 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)균주의 액체배양 방법과 이 배양액(미생물제제, 조성물)의 처리방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 특히 상기 균주의 배양조성물의 상태가 생균이거나 포자상태로 제공됨을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 특히 상기 균주의 배양조성물을 액체 또는 지지체에 고정화시킨 고체로 제공됨을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 제공되는 미생물제제를 대취지역 및 라지패취 피해지역에 처리함에 있어, 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 최적 생육시기(평균기온 30~40℃)가 아닌9월~10월(평균기온 20~10℃)에 처리되었음에도 불구하고 대취층 37% 감소와 라지패취 병반의 억제에 큰 효과를 보여 잔디가 식재되어 관리되는 경기장, 공원, 골프장 등에서 효과적으로 처리할 수 있으며, 특히 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)은 내생포자를 형성하여 미생물제제의 보존기간연장 및 미생물제제의 액체, 고체 및 열처리가 필요한 형태로의 제형변화가 용이하므로, 본 발명은 산업적으로 매우 유용한 발명이다.

도 1은 Cellulose 분해능을 갖는 1차 선별된 6균주들의 CMC액체 배지에서의 생육정도를 나타낸 것이다.
도 2는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 병원균에 대한 길항미생물 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 생육저지효과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 미생물제제를 대취 층이 형성된 잔디에 처리전과 후의 대취높이를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 미생물제제를 라지패취 병에 감염된 잔디에 처리하여 발병억제 효과를 보여주는 사진으로 무처리는 대조군을 나타낸다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기의 실시예 는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.

[골프장토양에서 Cellulose를 분해하는 균주분리]

강원도 인근 골프장에서 잔디 근권의 토양을 채취한 후, 채취된 토양 시료를 현장에서 채로 걸러 큰 입자를 제거한 후 4℃의 냉장고에 보관하였다.

상기 토양 중 1g를 0.5%(w/v)의 carboxyl methyl cellulose(CMC)을 함유하는 CMC고체배지(0.5% CMC, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5%KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄, 1.5% Agar, pH7.0)를 사용하여 37℃에서 2일간 배양하였다. 각 배지에서 얻어진 단일 균주를 다시 CMC고체배지를 사용하여 37℃에서 2일간 배양한 후 0.5% Congo red 용액을 처리하여 30분간 염색하였다. 반응하지 않은 congo red용액을 제거 후, 1M NaCl용액으로 15분간 처리하여 colony주위에 노란색의 환을 형성하는 colony를 취하여 트립틱소이아가(Tryptic Soy Agar, TSA)배지에 사면배양 하여 4℃에서 보관하였다.

분리된 균주들의 생육특성을 알아보기 위해 상기 분리된 균주 중 노란색 환이 크게 형성된 6개의 균주만을 선택하여 CMC액체배지(0.5% CMC, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄, pH7.0)를 삼각플라스크에 50㎖씩 분주하여 37℃에서 180rpm으로 48시간동안 배양하면서 UV-Vis Spectrophotometer를 사용하여 600nm에서 O.D 값으로 측정하여 각 균주의 배양상태를 확인하였다[도1].

[Cellullose를 분해하는 균주 중 잔디병원균에 길항력을 갖는 균주선별 및 동정]

상기 실시예 1에서 1차 분리된 Cellulose를 분해하는 균주 중에서 라지패취를 발생시키는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항력을 갖는 균주를 선별하였다. 선별방법은 실시예 1에서 선발된 각각의 균주를 트립틱소이브로스(Tryptic Soy Broth, TSB)배지에서 37℃, 180rpm으로 24시간 배양시켜 준비하고, 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, PDA)위에 일정거리를 두고 놓여진 5 mm 크기의 culture disc에 준비된 각각의 배양액 을0.5㎖씩 점적하고 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 감자한천배지의 중앙에 이식하여 25℃에서 7일간 배양하면서 균사의 자라남을 관찰하였다. 7일 경과 후 균사가 자라지 못하는 No.6 균주를 최종 선별하였다[도2]. 최종 선별된 균주는 TSA사면배지에 이식하여 37℃로 24시간 동안 배양한 후 4℃냉장고에서 저온저장 하였다. 균체의 형태적 특징은 균체 폭 0.6 ∼ 0.8㎛ 의 간균(桿菌) 이며, 타원형의 아포(芽胞)가 약간 중앙에 존재하고 고체배지에서 연미색의 콜로니를 형성하고 광택은 없으며 콜로니 표면에 주름이 있다. 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과 NRB-6균주는 바실러스 서브틸리스와 99％의 상동성을 나타내어 본 발명에서 최종 선별된 미생물을 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)로 명명하였다.

[선별된 균주의 효과 검증]

상기 실시예 1, 2를 통해 최종 선발된 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 효과를 검증하기 위해 미생물제제를 제조하여, 강원도 인근의 골프장에서 대취층이 형성된 지역과 라지패취 병에 감염된 지역에 처리하였다. 미생물제제 제조를 위해 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 종균배양은 4℃저온 저장중인 균주를 100㎖의 TSB배지에 1 Loop를 접종하여 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 본 배양은 50L Fermenter에 증식용 액체배지(1.5% Glucose, 0.5% Sucrose, 0.5% Starch, 0.3% Yeast extract, 0.1% Ammonium sulfate, 0.1% KH₂PO₄)를 이용하여 37℃로 3일간 배양하였다. 이때 Air는 1vvm, 내압은 0.5kg/cm²로 유지하였고, 200rpm에서 700rpm까지 회전속도를 조절하여 원활한 배양조건 유지하였다. 배양이 완료된 미생물 배양액을 1×10⁵CFU/㎖ ~ 1×10¹⁰CFU/㎖ 바람직하게는 1×10⁸CFU/㎖으로 희석하여 2012년 9월 3일부터 강원도 인근의 골프장에서 대취 층이 많이 형성된 1개 지역과 라지패취 병에 감염된 1개 지역에 10일 간격으로 총 3회 살포하고 최종 살포 후 20일이 경과된 2012년 10월 23일 각각의 결과를 확인하였다.

1. 대취분해 효과

대취분해 효과검증은 처리 전, 후 홀커터를 이용하여 대취 층의 시료를 채취하여 높이를 측정함으로 대취분해 효과를 확인하였다. [도3]의 결과에서 보이듯 미생물제제를 처리하기 전(A) 8cm이었던 대취 층의 높이가 처리 후(B) 5cm로 37% 감소하였으며 이때 무처리지역의 대취높이는 8cm로 동일하였다. 상기 분해정도는 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 생육 최적조건인 30~40℃에서 이루어지지 않았음을 감안하면 5월 중순 이후부터 9월 중순 즉, 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6)의 생육 최적시기에 처리하면 보다 효과적인 대취분해가 이루어질 것이다.

2. 라지패취 억제효과

라지패취 억제효과는 미생물제제를 처리하기 전과 후 병반의 크기 및 잎의 색, 재생 흔적 등을 육안으로 관찰하였다. [도4]에서 보이듯 무처리지역은 실험시작일인 9월23일과 비교해 실험종료일인 10월23일에 큰 변화 없이 라지패취의 흔적이 그대로 남아있다. 이에 반해 처리지역은 실험시작일인 9월23일 라지패취 병반이 뚜렷하게 나타나며, 잎은 말라있으나 실험종료일인 10월23일에는 라지패취의 병반이 억제되어 병 발생이 더이상 이루어지지 않았으며, 주위 잔디와 크게 차이가 없을 정도로 재생이 되었다.

본 발명의 Cellulose분해능을 가지는 동시에 라지패취 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항작용을 하는 신규한 미생물 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6) 및 이의 조성물(미생물제제)은 대취제거와 병원균에 대한 길항작용의 효과가 우수하고, 액체 및 고체 등의 제형개발에 유용하며, 친환경적이고 유해하지 않아 산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims

Cellulose분해능을 가지는 동시에 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 길항작용을 하는 바실러스 서브틸리스 NRB-6(Bacillus subtilis NRB-6).
제1항 균주를 유효성분으로 포함하는 대취분해 미생물제제.
제1항 균주를 유효성분으로 포함하는 라지패취 병억제 미생물제제.
바실러스 서브틸리스 균주를 이용하여 대취제거와 라지패취 병억제 방법.