KR100429586B1 - 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 ｋｍ112 균주 및 그를이용한 항진균성 조성물 - Google Patents

신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 ｋｍ112 균주 및 그를이용한 항진균성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112 균주 및 그를 이용한 항진균성 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 항진균성 조성물 제조방법은 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 액체배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계와 상기 수득한 배양액을 분리하여 항진균성 조성물을 수득하는 단계로 이루어지며, 본 발명의 항진균성 조성물은 곰팡이의 성장을 특이적으로 억제할 뿐 아니라, 화학적으로 합성하지 않고 미생물로부터 분리 및 정제한 것으로서 환경친화적 항진균 제제로 이용할 수 있는 우수한 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 ＫＭ112 균주 및 그를 이용한 항진균성 조성물{Novel Bacillus Amyloliquefaciens KM112 Strain and Antifungial Composition Using the Same}
본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112 균주 및 그를 이용한 항진균성 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체배양을 유효성분으로 포함하는 항진균성 조성물, 및 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 액체배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계와 상기 수득한 배양액을 분리하여 항진균성 조성물을 수득하는 단계로 이루어지는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112 균주 및 그를 이용한 항진균성 조성물에 관한 것이다.
곰팡이의 발생억제 및 방제를 위한 방법으로 현재 주로 사용되고 있는 것은 화학적 합성농약이다. 상기 화학적 합성농약의 예로는 디클로로디페닐-트리클로로에탄(Dichlorodiphenyl-trichloroethane, DDT), 벤젠헥사클로라이드(Benzene-hexachloride: BHC), 염화제2수은(HgCl2),페르밤(Ferbam) 및 에디펜(Edifen) 등이 있다.
그러나, 상기 방제방법 및 약제는 독성이 매우 강하고 잔류성도 높기 때문에 자연 생태계의 파괴를 초래하고, 잔류 독성으로 인한 인체의 약제중독, 발암, 기형 및 각종 질환을 유발할 가능성이 매우 높아서 그 사용이 제한되고 있다.
상술한 바와 같이 종래의 농약의 결점을 극복할 수 있는 항진균성 항생물질의 개발을 위한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 항진균 효과가 우수하며, 무독성, 잔류성이 낮은 약제가 아직 개발되지 못한 상태이다.
따라서, 곰팡이의 성장만을 선택적으로 억제할 수 있고, 인체에 대한 독성이 없는 항진균성 약제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자는 상술한 종래의 농약의 문제점을 해결한 새로운 항진균제를 개발하고자 연구한 결과 대한민국의 토양으로부터 분리한 새로운 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112의 배양액이 우수한 항진균 효과를 나타내고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항진균성 물질을 생산하는 신규 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112의 액체 배양액을 유효성분으로 함유하는 항진균성 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 항진균성 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 항진균성 물질을 생산하는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112 균주와 이를 이용한 항진균성 조성물, 및 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 액체배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계와 상기 수득한 배양액을 분리하여 항진균성 조성물을 수득하는 단계로 이루어지는 항진균성 조성물의 제조방법을 제공함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 세포 지방산 조성을 GC-MIDI 시스템을 이용해서 동정 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 액체배지에서의 배양시간에 따른 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 성장과 항진균성 물질의 생산을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 항진균성 물질을 생산하는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112 및 상기 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체 배양을 유효성분으로 포함하는 항진균성 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 항진균성 조성물의 제조방법은 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 액체배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계 및 상기 수득한 배양액을 분리하여 항진균성 조성물을 수득하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 신규한 미생물은 대한민국의 토양으로부터 분리 및 동정된 것으로서,바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens)에 속한 새로운 균주이고, 우수한 항진균 활성을 나타내는 물질을 생산하는 특징이 있다. 또한, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체 배양액을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물은 상기 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 대사산물로서 세포밖으로 배출되는 항진균성 물질을 이용한다.
본 발명의 항진균성 조성물의 제조방법에 있어서, 바람직하게는 상기 액체 배지에서 사용되는 탄소원은 포도당, 유당, 젖당, 전분 및 글리세롤으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 그리고 질소원은 효모 추출액, 모노소디움(Monosodium) 글루타민산 및 탈지대두분으로 이루어지는 군으로부터 선택되어 사용된다.
또한, 본 발명의 제조방법에서 실시되는 분리단계는 당 업계에서 통상적으로 이용하는 분리방법, 예를 들면 멤브레인(Membrane)을 이용한 분리를 이용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 상기 멤브레인을 이용한 분리단계 이후에, 정제단계를 실시한다. 바람직하게는 해당 정제단계는 당 업계에서 통상적으로 이용하는 컬럼 크로마토그래피 과정을 포함한다. 예를 들면, 이온교환 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 다이 배위자(配位子) 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, HPLC, TLC 등과 같은 당 업계에서 이용되는 크로마토그래피를 적절하게 조합하여 컬럼 크로마토그래피 과정을 실시할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 분리 및 동정
항진균 활성이 있는 미생물의 분리를 위해서 전국 15개 지역에서 500여점의 토양시료(0∼10㎝ 깊이의 토양시료)를 채취하였다. 이 토양시료 1g을 영양배지(Nutrient Broth, NB) 10㎖에 현탁한 다음, 1㎖를 취하여 영양배지 9㎖를 넣어둔 시험관에 첨가하여 희석하였다. 이와 같은 희석방법을 반복하여 10⁴∼ 107까지 시료를 희석하였다.
상기 희석시료를 미리 준비한 피검진균(Penillium sp.)이 첨가된 PDA(Potato dextrose agar) 평판배지에 도말하여, 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양한 평판배지에서 피검진균의 저지환이 나타낸 5종의 미생물 군락을 백금이로 취하여, LB 평판배지에 4분 도말하여 30℃에서 1일 동안 배양하여 단일군락을 얻었다. 항진균 활성을 나타낸 5종의 미생물 중에 항진균 활성이 가장 강하게 나타난 미생물 1종을 선택하여 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 의뢰하여 미생물 지방산 분석법에 의하여 선별된 미생물을 동정하였다. 상기 동정결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
상기 과정에 의해 분리 및 동정된 미생물을 바실러스 아밀로리퀴페션스(Bacillus amyloliquefaciens) KM112이라 명명하고, 이를 대한민국 기탁기관이며 부다페스트 조약에 의한 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 2000년 12월 28일자로 기탁하여, 기탁번호 KCCM-10235을 부여받았다.
실시예 2 : 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 특성조사
실시예 1에서 분리, 동정된 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 배양학적 특성, 형태학적 특성 및 생리학적인 특성을 다음과 같이 조사하였으며, 각각의 특성을 하기 표 1, 표 2 및 표 3에 나타내었다.
본 발명 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 배양학적 특성
콜로니 형태 원 형
콜로니 표면 거칠음
콜로니 모서리 파 상
콜로니 엘리베이션 돌 출
콜로니 흐림도 불투명
콜로니 색깔 크림색
콜로니 광택성 무광택
본 발명 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 형태학적 특성
형 태 단간균
운동성 양 성
그람 염색 양 성
포자 형성 양 성
포자 모양 타원형
포자 위치 중 앙
본 발명 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 생리학적 특성
성장 온도 17-45℃
성장 pH범위 4∼9
포 도 당 +
젖 당 +
전 분 +
설 탕 +
글리세롤 +
덱스트린 +
효모 추출액 +
펩 톤 +
트립톤(Trypton) +
탈지 대두분 +
실시예 3 : 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체배지 배양
실시예 1에서 분리 및 동정된 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 LB 평판배지(1%트립톤, 0.5%효모추출액, 1%소금, 1.5%한천)에 백금이로 4분 도말한 다음, 30℃에서 2일 동안 배양하였다.
실시예4 : 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체배지 배양
실시예 1에서 배양한 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 DYS배지(0.8%전분, 0.2%포도당, 2%효모 추출액, 0.02%소금, pH5.6)에 접종한 다음, 30℃에서 3일 동안 200rpm으로 진탕(振蕩) 배양하였다. 이어서, 배양액을 고속원심분리(200rpm, 4℃, 20분)하여 세포를 제거한 후, 100kDa 멤브레인으로 내생포자를 제거하고, 여액을 분리하여 항진균성 조성물로 이용하였다.
도 2는 액체 배지에서의 배양시간에 따른 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의성장과 항진균성 물질의 생산을 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에 따르면 배양한 후 3일 이후에 세포성장은 정지기에 도달하며, 배양 1일 이후부터 항진균성 물질이 생산되고, 배양 약 3일 이후에 항진균성 물질의 생산이 최대에 도달함을 알 수 있다.
본 발명의 미생물의 성장은 파장 600nm에서의 흡광도를 측정하여 확인하였고, pH는 겔 타입 전극(Ingold社)를 이용해서 온-라인으로 측정하였다. 또한, 항진균성 물질의 양은 종이 디스크 한천 확산법( Paper disc agar diffusion method)을 이용해서 다음과 같이 확인하였다.
우선, 각 피검진균(Penicillium sp.)의 포자 현탁액을 100㎕씩 PDA평판배지에 현탁한 다음, 실시예 2에서 얻은 여액 100㎕에 해당하는 양을 농축하여 페이퍼 디스크(직경6mm)를 적시었다. 이어서, 상기 페이퍼 디스크를 상기 제조된 검체 평판배지에 놓아 30℃에서 2일 동안 배양하여 저지환의 형성을 확인하였다.
실시예 5 : 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 항진균성 물질 생산에 미치는 탄소원 및 질소원의 조사
실시예 4에서 사용한 액체배지의 조성에서, 탄소원 및 질소원을 변화시켜 항진균성 물질의 생산과 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112 미생물의 생육을 측정함으로써, 항진균성 물질의 최대수율을 나타내는 영양원을 선별하였다.
사용한 탄소원 및 질소원의 종류는 하기 표 4에 나타내었다. 배양조건은 실시예 2와 동일하며, 미생물의 측정 및 항진균 활성의 측정은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
본 실험에서 타 영양원에 의한 영향을 최소화하기 위하여 실험대상이 아닌 영양원은 모두 동일한 조성인 단일 영양원을 사용하였고, 예를 들면 탄소원별 실험을 실시한 경우에는 질소원으로 실시예 2의 조성으로 효모 추출액을 사용하였으며, 질소원별 실험을 실시한 경우에는 탄소원으로 실시예 2의 조성으로 포도당을 1% 첨가하여 사용하였다. 실험결과는 하기 표 4에 나타내었다.
바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 항진균성 물질 생산에 미치는 탄소원 및 질소원의 조사
구 분 성 분 OD600 저지환(mm)
탄소원 포도당 1.594 19
젖 당 1.759 19
수크로스 1.539 14.5
엿 당 1.701 17.5
전 분 1.772 17
글리세롤 1.682 18
질소원 효모 추출액 1.688 18
MSG 1.027 15
탈지 대두분 1.879 14.5
NH4NO₃ 0.983 14
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이 탄소원으로 포도당, 유당, 젖당, 전분 및 글리세린을 이용한 경우에는 작은 차이는 있으나, 우수한 미생물 성장 및 항진균성 활성물질의 생산이 관찰되었다. 한편, 질소원의 경우에는 효모 추출액, 모노소듐 글루타민산(Monosodium glutamate : MSG) 및 탈지 대두분이 우수한 미생물 성장 및 항진균성 물질생산을 나타내었다.
실시예 6 : 항진균성 성분의 정제
실시예 4에서 얻어 수득한 항진균성 조성물을 이용하여 농작물에 곰팡이 병해를 유발하는 곰팡이에 대한 항균 스펙트럼을 확인하고자 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일하게 페이퍼 디스크 한천 확산법을 이용하여 실험을 행하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
항진균성 성분의 정제
검체 진균 저지환의 생성여부
페니실리움(Penillium) spp. OB 17.0
페니실리움(Penillium) spp. GZ 0
페니실리움 푸로렌스(Penillium furolense) 0
트리코더마(Trichoderma) spp. 15.0
콜렉토리쿰 글로에오스포리오드스(Collectorichum gloeosporiodes) 12.0
푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporium) 11.0
패네로키에이트 크리소스포리움(Phanerocheate chrysosporium) 16.0
히포크레아(Hypocrea) spp. 18.0
표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항진균성 조성물은 일부의 농작물 병해 진균을 제외한 다수의 진균에서 항진균 활성을 나타내고 있으며, 그 저지환의 형성이 매우 명확하게 나타났다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 항진균성 조성물은 곰팡이의 성장을 예방 및 억제할 수 있고, 곰팡이병 방제용 미생물 제제로 이용할 수 있으며, 특히 농업용으로 사용하는 경우 시설작물에 대해 약해는 없으면서도 곰팡이병의 원인 진균 및 기타의 병원성 진균류에만 특이적으로 작용하여 시설작물의 생육을 촉진시키므로 작물의 진균성 질병의 예방 및 치료제, 작물의 보존제로 사용될 수 있는 효과가 있으며, 또한 항곰팡이와 관련된 천연 식품보존제 및 진균류와 관련된 향후 의약품 개발의 가치가 충분한 것으로 사료되므로 약제 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (4)

  1. 항진균성 물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 신규한 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112 균주(기탁번호: KCCM-10235).
  2. 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112의 액체 배양액을 유효성분으로 포함하는 항진균성 조성물.
  3. 바실러스 아밀로리퀴페션스 KM112를 액체배지에서 배양해서 배양액을 얻는 단계 및 상기에서 얻은 배양액을 분리해서 항진균성 조성물을 수득하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항진균성 조성물의 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 액체배지에서 사용되는 탄소원은 포도당, 유당, 젖당, 전분 및 글리세롤으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 질소원은 효모 추출액, 모노소디움(Monosodium) 글루타민산(Glutamate) 및 탈지 대두분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항진균성 조성물의 제조방법.
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