KR101764184B1 - 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 hr391 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391)(수탁번호 KACC92095P) 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 상기 균주 또는 상기 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 나타냄으로써 친환경적인 생물제어제로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 나타냄으로써 친환경적인 생물제어제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
최근 많이 사용되고 있는 웰빙(well being) 혹은 로하스(lifestyle of health and sustainability, LOHAS)라는 용어에서 알 수 있듯이 전 세계적으로 건강한 삶과 환경 보존을 동시에 추구하고 실천하려는 움직임이 커지고 있다. 그 중에서도 식생활, 특히 농산물은 건강과의 연관성이 강하고 직접 섭취함으로써 효과가 비교적 빠르게 나타나기 때문에 이러한 변화에 민감한데, 우리나라 또한 2000년대 이후 황사, 광우병, 구제역 등의 환경재해, 환경오염에 대한 우려로 인해 안전한 먹거리에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있다. 그에 따라 친환경농산물에 대한 선호도가 커지며 친환경농산물 재배를 위한 생물농약과 같은 생물학적 방제에 대한 관심과 연구가 증가하는 추세이다(Roberts et al., 2005).
한편, 작물에 나타난 병원성 진균을 조절하는 기존 방법으로는 부분적인 저항 품종 개량, 경작과 화학적 항진균제 사용 등이 있다. 그러나, 새로운 품종 개량은 많은 시간이 소요되고 병원균들이 식물의 저항성에 적응, 변이를 일으켜 이로운 효과가 짧게 나타나며 윤작이나 토양 일광요법은 큰 규모의 농업에서는 시행되기 어렵다는 문제점이 있다. 또한, 화학적 항진균제는 비용에 비해 효과가 낮고 환경과 인간의 건강에 악영향을 미친다는 보고가 있다(Xue et al., 2013). 그 중 농업 생산에 있어 화학적 항진균제(농약)는 작물의 수량과 품질을 향상시키고 인구증가에 따른 공급량을 증가시킨다는 면에서 중요성이 부각되어 왔으며 지금까지 화학비료와 유기합성농약을 통한 화학적 방제가 주를 이루었다(Loqman et al., 2009). 하지만 농약의 과다사용으로 인한 난분해성 잔류독성이 공기, 토양, 지하수를 오염시켜 환경과 생태계에 미치는 악영향과 식물병원균의 농약 저항성 획득 등에 의한 약효감소 등의 부작용이 증가하고 있다(Goudjal et al., 2014). 이러한 부작용에 대해 미생물제제를 이용한 생물학적 방제법은 식물병에 효과적이고 지속가능한 대체방법으로 바실러스 속(Bacillus spp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.)과 비병원성 푸사리움 속(Fusarium spp.)과 같은 미생물로 토양 유래 식물 병원균 방제를 위한 연구를 수행하고 있다(Faheem et al., 2015). 생물학적 방제법은 잔류독성이 없고 농업생태계를 교란하지 않는다는 점에서 효과적인 대처법으로 각광받고 있으나 아직 전 세계 농약시장에서 생물학적 방제에 대한 비중은 낮다. 2010년 한국과학기술연구원의 보고에 따르면 국내외 생물농약 시장 규모는 화학농약 대비 약 11% 수준이며, 국내 미생물농약 시장은 80억 원이다. 그러나 세계적으로 농약 시장에서 합성농약은 줄어드는 반면 생물농약은 연 평균 약 10% 씩 증가하고 있으며 이에 따라 국내 생물농약 역시 2015년 이후 약 1800억 원의 규모로 성장할 것으로 예상하고 있다. 현재 우리나라에서는 시도별 친환경 농산물 인증 사업이 시행되고 있으며 그 규모는 점차 증가하고 있지만 대부분의 미생물제제를 수입에 의존하고 이들 미생물이 우리나라의 기후, 토양과 같은 환경조건에 적응하지 못해 효과를 충분히 발휘하지 못하는 경우가 많다.
생물학적 방제에 사용되는 미생물의 항균기작은 미생물에 의한 직접적 길항작용과 식물의 면역기능을 활성화하여 저항성을 유도하는 간접적 길항작용으로 나눌 수 있다(Berendsen et al., 2012). 직접적인 길항작용에 의한 생물학적 방제는 생물제어제(biocontrol agent)가 분비하는 세포벽 가수분해효소인 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase), 셀룰라아제(cellulase) 및 프로테아제(protease)에 의한 용균작용(Getha and Vikineswary, 2002), 철이온에 대한 높은 친화력을 가지고 병원균과 경쟁하여 생장을 억제하는 시데로포어(siderophore)와 같이 영양분과 기질을 경쟁하여 길항작용을 나타내거나 병원균에 기생하여 생육을 저해하는 기생 작용이 있을 수 있다. 또한, 병원성 진균의 생장을 직접적으로 억제하는 항생물질을 생산하여 곰팡이의 사멸 또는 생육을 정지시켜 식물병 유발을 감소시킬 수 있다(Kamensky et al., 2003). 이와 같은 다양한 항진균 기작을 가진 미생물을 생물제어제로 이용하여 친환경적으로 식물병을 조절할 수 있다. 그러나, 식물 질병의 생물학적 방제에 사용되는 생물제어제는 병원성 진균과 작물 종류에 따라 다양한 결과를 보이며 일부만이 완전한 방제가 가능하다. 따라서, 효율적인 식물병 방제를 위해서는 지속적인 새로운 생물학적 방제 미생물 탐색이 수행되어야 한다. 새로운 생물제어제를 개발하는 효과적인 방법으로는 새로운 생리활성물질을 탐색하는 것으로 계속적인 생리활성물질 탐색을 통해 현재 천연 항생물질의 2/3 가량을 잠재적인 생물제어제 중 하나로 여겨지는 방선균으로부터 분리하였다(Kumar et al., 2014).
토양에 존재하는 주된 미생물 중 하나인 방선균은 균사 형태를 띠고 형태분화를 하는 그람양성 토양미생물이며 복잡한 형태적 분화뿐만 아니라 스트렙토마이신, 악티노마이신 및 린코마이신과 같은 항생제, 항암제, 면역억제제로 대표되는 다양한 종류의 이차대사산물을 생산한다(Boukaew et al., 2014). 또한, 식물병원균으로부터 뿌리를 보호하고 인돌 아세트산(indole-acetic acid, IAA)과 같은 다양한 식물 호르몬을 분비하여 식물체의 발달에 영향을 주기도 한다(Kalbe et al., 1996). 특히, 전체 토양 방선균의 50%를 차지하는 스트렙토마이세스 속은 상업적 및 의약적으로 유용한 항생물질의 75-80%를 생성한다고 보고되고 있으며(Mellouli et al., 2003), 실제 스트렙토마이세스 속에 의해 생성되는 스트렙토마이신을 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)에 의해 유발되는 사과와 배의 불마름병 조절을 위해 사용하였으며, 이는 작물 보호를 위해 미생물의 대사산물을 이용한 초기의 성공적인 예로 보고되고 있다(Vanneste et al., 1992).
하지만 현재 생물학적 방제에 이용되는 생물제어제로 고초균, 효모 및 광합성균 등으로 대표되는 다양한 유용미생물을 사용하고 있으나 아직까지 방선균의 연구와 활용은 미비한 상태이다. 이에, 본 발명에서는 식물에 병원성을 나타내는 4가지의 주요 곰팡이를 대상으로 항진균성 방선균을 분리하고 여러 항진균 기작을 조사하여, 우리나라의 환경에 적응하여 토착화 및 우점화가 용이한 균주를 선발하고자 하였다.
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본 발명자들은 항진균성 방선균에 대하여 연구하던 중, 신규 동정된 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주가 항진균 활성, 생물계면활성 및 높은 생장률을 나타냄으로써, 친환경적인 생물제어제로 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 신규한 방선균을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391)(수탁번호 KACC92095P) 균주가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 식물은 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391) 균주를 유효성분으로 포함하는 시들음병, 덩굴쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 제제화하기에 적합한 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따라, 상기 균주 또는 상기 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는 시들음병, 덩굴쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병의 방제 방법이 제공된다.
본 발명에 의해, 신규 동정된 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391)(수탁번호 KACC92095P) 균주가 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 나타내고, 식물생장 촉진물질인 시데로포어를 생성하고, 키티나아제 활성, 세포벽 가수분해 효소인 β-1,3-글루카나제 활성, 셀룰라아제 활성, 항균펩티드 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 상이한 항진균 기작인 생물계면활성 시험 결과, 배양 1일에 가장 높은 유화활성을 나타내었으며, 대표적인 생물계면활성제인 글리코리피드 중 람노리피드가 검출되었고, 이투린 A 및 서팩틴과 같은 생물계면활성을 나타내는 리포펩티드를 생성하는 것으로 확인되어, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 다양한 항진균 기작을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 높은 생장률을 나타냈으며, 다양한 배지 조성에서도 배양이 가능할 뿐만 아니라, 다양한 탄소원과 질소원을 조합한 배지에서 항진균능을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 식물의 생장을 직접적으로 촉진할 수 있는 식물 호르몬인 IAA, 제아틴과 지베렐린을 분비하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 다양한 항진균 기작을 가지고 있으며 빠른 생장 효과를 나타냄으로써, 친환경적인 생물제어제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 그람 염색된 균주의 형태를 현미경(400배 배율)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 KB 배지에서 분리된 HR391 균주의 시간에 따른 시데로포어 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 0.2% 콜로이드성 키틴 포함 펩톤 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 키티나아제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 0.2% 라미나린 포함 펩톤 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 β-1,3-글루카나제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CMC 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 셀룰라아제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 S. 코스타리카누스 HR391에 의해 생성된 상이한 농도의 항균펩티드 첨가에 따른 식물 병원성 진균류에 대한 억제 활성을 나타낸 그래프이다(◇: F. oxysporum f. sp. lycopersici; □: Fusarium oxysporum f. sp. raphani ; △: F. oxysporum f. sp. niveum).
도 7은 GYE 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 생물계면활성제 활성을 7일 간 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 2% 글리세롤 첨가 MS 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391 균주에 의한 람노리피드 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 S. 코스타리카누스 HR391 균주 리포펩티드의 TLC 및 생물학적 정량 결과로서, 이투린 A 및 서팩틴을 양성 대조군으로 사용한, HR391의 부탄올 추출물의 TLC 전개 결과(A) 및 R. solani에 대한 생물학적 정량 결과(B)이다.
도 10은 베넷 배지(□)와 GYM 배지(◇)에서의 120 시간 동안의 S. 코스타리카누스 HR391 균주의 생장 곡선이다.
도 2는 KB 배지에서 분리된 HR391 균주의 시간에 따른 시데로포어 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 0.2% 콜로이드성 키틴 포함 펩톤 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 키티나아제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 0.2% 라미나린 포함 펩톤 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 β-1,3-글루카나제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CMC 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 셀룰라아제 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 S. 코스타리카누스 HR391에 의해 생성된 상이한 농도의 항균펩티드 첨가에 따른 식물 병원성 진균류에 대한 억제 활성을 나타낸 그래프이다(◇: F. oxysporum f. sp. lycopersici; □: Fusarium oxysporum f. sp. raphani ; △: F. oxysporum f. sp. niveum).
도 7은 GYE 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391의 생물계면활성제 활성을 7일 간 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 2% 글리세롤 첨가 MS 배지에서 S. 코스타리카누스 HR391 균주에 의한 람노리피드 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 S. 코스타리카누스 HR391 균주 리포펩티드의 TLC 및 생물학적 정량 결과로서, 이투린 A 및 서팩틴을 양성 대조군으로 사용한, HR391의 부탄올 추출물의 TLC 전개 결과(A) 및 R. solani에 대한 생물학적 정량 결과(B)이다.
도 10은 베넷 배지(□)와 GYM 배지(◇)에서의 120 시간 동안의 S. 코스타리카누스 HR391 균주의 생장 곡선이다.
본 발명은 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391)(수탁번호 KACC92095P) 균주를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 식물은 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물일 수 있다.
상기 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(수탁번호 KACC92095P) 균주는 유기물이 풍부한 토양에서 분리될 수 있으며, 항진균활성 조사 방법(예를 들어, 원판확산법)을 통하여 여러 병원성 진균에 대하여 우수한 항진균능을 보이는 균주를 선별함으로써 분리할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 순수분리 된 균주 중 항진균 활성이 가장 높은 균주를 선별하여, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391로 동정하였다.
본 발명에서 신규 동정된 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주의 항진균 물질 생성 여부를 시험한 결과, 식물생장 촉진물질인 시데로포어를 생성하였고, 키티나아제 활성, 세포벽 가수분해 효소인 β-1,3-글루카나제 활성, 셀룰라아제 활성, 항균펩티드 활성을 나타냈다. 또한, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주에 대하여 상이한 항진균 기작인 생물계면활성 시험 결과, 배양 1일에 가장 높은 유화활성을 나타내었으며, 대표적인 생물계면활성제인 글리코리피드 중 람노리피드가 검출되었고, 이투린 A 및 서팩틴과 같은 생물계면활성을 나타내는 리포펩티드를 생성하는 것으로 확인되어, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주가 다양한 항진균 기작을 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한, 대부분의 방선균이 느린 생장을 보이는 반면에, HR391 균주는 GYM 배지에서 배양 24시간만에 흡광도값이 1.733으로 높은 생장을 나타냈으며, 베넷 배지에서도 비교적 생장이 빠르고, 다양한 배지 조성에서도 배양이 가능하였으며, 균주 생장배지 조성에 따른 항균활성 시험 결과, 탄소원과 질소원을 각각 글리세롤과 효모 추출물로 사용했을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타내는 것을 포함하여, 다양한 탄소원과 질소원을 조합한 배지에서 항진균능을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, HR391 균주는 식물의 생장을 직접적으로 촉진할 수 있는 식물 호르몬인 IAA, 제아틴과 지베렐린을 분비하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주는 다양한 항진균 기작을 가지고 있으며 빠른 생장을 통해 친환경적인 생물제어제로의 적용 가능성이 높은 균주임을 알 수 있다.
본 발명은 또한, 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391) 균주를 유효성분으로 포함하는 시들음병, 덩굴쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 제제화하기에 적합한 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 계면활성제로는 이에 한정되지 않지만 폴리카르복실레이트, 리그노술폰산 나트륨, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 X-100, 트윈 20 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 상기 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는 시들음병, 덩굴쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병의 방제 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<
실시예
>
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 균주의 분리 및 동정
강원도 춘천시 봉의산, 구봉산 등산로 주변 토양으로부터 토양시료를 채취하였다. 채취한 시료는 실험실로 옮겨와 0.85% NaCl 용액 40 ml과 혼합하여 10-3~10-4까지 연속희석 하였고, SCN 배지(starch casein nitrate agar, SCN[soluble starch 10.0 g, KH2PO4 2.0 g, casein 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.05 g, CaCO3 0.02 g, FeSO4 ·7H2O 0.01 g, actidione 40 ㎍/ml, agar 15 g, 1 L 증류수, pH 7.0]) 및 올슨 배지(Olson's agar[sodium caseinate 2.0 g, asparagine 0.1 g, sodium propionate 4.0 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, FeSO4·7H2O 1.0 mg, glycerin, 5.0 g, actidione 40 ㎍/ml, agar 15 g, 1 L 증류수, pH 7.0])에 100 ㎕씩 첨가하여 도말하였다. 그 후 7~14일 동안 30℃, 암조건에서 배양한 후 사상성 형태의 집락을 분리하고 현미경으로 균사를 조사하였으며, 분리한 균주들은 베넷 한천 배지(Bennett agar[glucose 10 g, beef extract 1 g, yeast extract 1 g, peptone 2 g, agar 15 g, 1 L 증류수])에 획선배양하여 4℃에서 보관하였다.
분리한 균주들 중 항진균 활성이 가장 높은 균주를 HR391라고 명명하였으며 베넷 한천 배지에 배양하여 (주)마크로젠에 16s rRNA 유전자 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열 결과는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 등록 균주들과 상동성을 비교하여 동정하였다.
2. 항진균 활성 조사
2-1. 원판확산법(Disc plate diffusion method)
식물 병원성 진균류인 시들음병 병원체(Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 덩굴쪼김병 병원체(F. oxysporum f. sp. niveum), 시들음병 병원체(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 및 잎집무늬마름병 병원체(Rhizoctonia solani)에 대한 항진균 활성을 알아보기 위해 원판확산법(disc plate diffusion method)을 이용하였다. 감자한천 배지(Potato dextrose agar, PDA[Potato dextrose agar{Difco Lab, USA} 39 g, 1 L 증류수])의 양쪽 끝에 직경 1 cm의 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 잘라낸 식물병원성 곰팡이 디스크(disc)와 분리균주 디스크를 두어 대치한 실험군과 분리균주 디스크를 놓지 않은 대조군을 이용하였으며, 각각 30℃에서 7일간 배양하여 생육저지환(inhibition zone)의 유무와 크기를 조사하였다(Loqman et al., 2009).
2-2. 균주 상등액의 항진균 활성 조사(
건조균체량
)
분리 균주를 GYM 배지(glucose-yeast extract-malt extract[glucose 4 g, yeast extract 4 g, malt extract 10 g, 1 L 증류수. pH 7.0]) 40 ml에 선배양하고 분광광도계를 이용해 OD600이 1이 되도록 보정한 후 새로운 LB 배지에 10% 배지에 접종하여 배양하였다(72 h, 30℃, 150 rpm, 암조건). 배양액은 원심분리하여(3400×g, 30 min, 4℃) 상등액을 회수하고 PDB 배지(potato dextrose broth[Potato dextrose broth{Difco Lab., USA} 24 g, 1 L 증류수])와 혼합하여 총 100 ml이 되도록 상등액을 1, 10, 20 및 25 ml 첨가하고 대조군으로는 상등액 대신 GYM 배지를 첨가하였다. 상등액을 포함한 PDB에 직경 1cm의 코르크 보러를 이용하여 잘라낸 식물병원성 곰팡이 디스크(Fusarium oxysporum f. sp. raphani, F. oxysporum f. sp. niveum, F. oxysporum f. sp. lycopersici, Rhizoctonia solani)를 넣어 5일간 30℃, 150 rpm과 암조건으로 진탕배양하였다. 배양액은 여과지(Whatman No. 2 filter paper)로 여과하여 60℃에서 2시간 건조하여 건조균체량을 측정하였다(Boukaew et al., 2014).
3. 항진균 물질
생성능
조사
항진균능이 있는 균주들을 대상으로 경쟁적 길항작용으로 곰팡이의 생장을 저해하는 시데로포어의 분비량을 측정하고 곰팡이의 세포벽을 분해시키는 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제, β-1,3-글루카나제, 셀룰라아제와 프로테아제의 생산량을 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS) 방법을 통해 정량하였다. 또한, 진균 포자의 발아를 저해한다고 알려진 살리실산, 생물계면활성제인 람노리피드(rhamnolipid), 항진균성 리포펩티드(lipopeptide) 및 항균펩티드(antimicrobial peptide, AMP)를 조사하고 여러 항생물질을 측정하였다.
3-1.
시데로포어의
정성 및 정량 분석
균주의 시데로포어 분비 유무를 조사하기 위해 먼저 크롬 아주롤 S(chrome azurol S, CAS) 한천평판법(agar plate assay)을 통해 정성적으로 확인하였다. CAS 플레이트 평판배지(dark blue solution, Pipes 32.24 g, agar 16 g, 1 L 증류수, pH 6.8)에 직경 5mm 코르크 보러를 이용하여 구멍을 낸 뒤 KB 배지(King's medium B[peptone 20 g, glycerin 10 ml, KH2PO4 1.5 g, MgSO4·7H2O 1.5 g, 1 L 증류수, pH 7.2])에 배양한 균주배양액을 70 ㎕를 넣어주었다. CAS 플레이트는 30℃에서 암조건에서 48시간 동안 배양하였으며 노란색 환의 형성 유무를 확인한 후 활성물질을 시데로포어로 판단하고 정량분석을 진행하였다. 균주는 KB 배지 40 ml에 선배양하였으며(48 h, 30℃, 150 rpm, 암조건) 배양액은 분광광도계(Shimadzu UV-1700, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 OD600이 1이 되도록 보정한 후 90 ml의 KB 배지에 10 ml씩 보정된 균주를 접종해서 배양하였다(48 h, 30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 균주 배양액을 50 ml 코니칼 튜브에 15 ml씩 넣고 원심분리 하고(3400×g, 30 min, 4℃) 상등액을 추출하여 1 M HCl로 pH 2.9가 되도록 보정하였다. 보정한 상등액과 동량의 에틸 아세테이트를 혼합하여 추출 교반기(extraction shaker, Recipro shaker RS-1, Jeio Tech)로 1회 추출하고(300 rpm, 30 min) 추출한 용액을 원심분리 하여(3400×g, 15 min, 4℃) 상층의 에틸 아세테이트 5 ml과 헤쓰웨이(Hathway) 반응 용액(0.1 M HCl을 이용해 만든 0.1 M FeCl3 1 ml, 0.1 M potassium ferricyanide 1 ml, 0.1 L 증류수) 5 ml을 30분간 반응시켰다. 반응 후 분광광도계를 이용해 OD700에서 흡광도를 측정하였으며(Nagarajkumar et al., 2004), 표준곡선은 디히드록시 벤조산(dihydroxy benzoic acid)을 이용하여 정량하였다.
3-2.
키티나아제
활성 조사
균주의 키티나아제 활성을 측정하기 위해 먼저 콜로이드성 키틴(colloidal chitin)을 제조하였다. 콜로이드성 키틴의 제조방법은 5 g의 키틴에 50 ml의 진한(concentrated) HCl을 첨가하여 6시간 동안 교반한 후 4℃에서 250 ml의 100% 에탄올을 첨가하여 계속해서 교반하였다. 그리고 1 M 아세트산나트륨을 이용하여 pH 6.0-6.5가 되도록 보정한 후 원심분리 하고(3400×g, 40 min, 4℃) 상등액을 제거하였다. 제거한 상등액과 동량의 1 M 아세트산나트륨을 넣고 다시 pH를 측정하여 6.0-6.5로 보정되었는지 확인한 후 원심분리 하여(3400×g, 40 min, 4℃) 상등액을 제거하고 남아있는 콜로이드성 키틴을 여과지 위에 올려놓고 감압하여 사용하였다. 키티나아제 활성을 조사하기 위해서 키틴-펩톤 배지(glucose 5.0 g, peptone 2.0 g, colloidal chitin 2.0 g, K2HPO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g, 1 L 증류수, pH 6.8) 40 ml에서 선배양한(48 h, 30℃, 150 rpm, 암조건) 균주를 분광광도계를 이용하여 OD600이 1이 되도록 보정한 후 키틴-펩톤 배지에 10% 접종하여 배양하였다. 24시간 간격으로 균주 배양액 1 ml을 20분간 원심분리(12,000×g, 4℃)한 뒤, 상등액 0.25 ml, 1 M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.3) 0.3 ml 그리고 0.1% 콜로이드성 키틴 0.5 ml을 각각 혼합하여 50℃ 항온수조에서 4시간 반응시켰다. 키티나아제 활성은 DNS 방법를 사용하여 콜로이드성 키틴이 분해하여 생성된 환원당을 정량하였고 1 유닛(unit)은 1분간 1μmol의 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine, NAG)을 생성하는 효소량으로 하였다. 또한, 브래드포드법(Bradford method)을 이용하여 시료의 단백질량을 정량하였다(Nagarajkumar et al., 2004; Ghose, 1987). 결과는 키티나아제 생성량을 단백질 정량 대비 값으로 나타내었다.
3-3. β-1,3-
글루카나제
활성 조사
β-1,3-글루카나제 활성을 조사하기 위해 0.2% 라미나린이 첨가된 펩톤 배지(glucose 5.0 g, peptone 2.0 g, 0.2% laminarin 2.0 g, K2HPO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g, 1 L 증류수, pH 6.8) 40 ml에서 대수생장기가 끝나는 시점까지 선배양 한 후 OD600이 1이 되도록 보정하여 새로운 라미나린-펩톤 배지에 10% 접종하여 배양하였다(48 h, 30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 균주 배양액 1 ml을 원심분리 하고(12,000×g, 20 min 4℃) 상등액 0.25 ml, 0.1 M 인산 완충액(pH 5.5) 0.5 ml, 0.2% 라미나린 0.5 ml을 각각 혼합하고 2시간 동안 40℃ 항온수조에서 반응시켰다. β-1,3-글루카나제 활성은 DNS 방법를 이용하였으며 1 유닛은 1분간 1μmol의 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)을 생성하는 효소량으로 하였고 브래드포드법으로 시료의 단백질을 정량하였다. 표준곡선은 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 이용하였다.
3-4. 셀룰라아제 활성 조사
균주의 셀룰라아제 활성을 조사하기 위해 카르복시메틸 셀룰로오즈 배지(CMC 배지[NH4H2PO4 1 g, KCl 0.2 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, yeast extract 1 g, carboxymethyl cellulose 26 g, 1 L 증류수, pH 7.0]) 40 ml에 균주를 배양 한 후 분광광도계를 이용하여 OD600이 1이 되도록 보정한 후 새로운 LB 배지에 10% 접종하여 배양하였다(30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 균주 배양액 1 ml을 원심분리하고(12,000×g, 20 min 4℃) 상등액 0.5 ml과 기질 용액(0.05 M sodium citrate buffer를 이용해 만든 2% 카르복시메틸 셀룰로오즈) 0.5 ml을 섞어 50℃ 항온수조에서 30분간 반응시켰다. 그 후 혼합액에 대하여 상기와 같이 DNS 방법을 수행하였으며 1 유닛은 1분간 1μmol의 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)을 생성하는 효소량으로 하였고 브래드포드법으로 시료의 단백질을 정량하였다.
3-5.
항균펩티드
(AMP) 조사
분리 균주가 생성한 항균펩티드(AMP)의 활성을 조사하기 위해 균주를 LB 배지에서 30℃, 암조건, 150 rpm으로 선배양 한 뒤 분광광도계를 사용하여 600 nm에서 흡광도 값이 1.0이 되도록 보정하였다. 새로운 LB 배지에 보정된 배양액 10%를 접종하여 30℃, 암조건, 150 rpm에서 36시간 배양한 뒤 원심분리(3400×g, 20 min, 4℃) 하였다. 상등액을 회수하여 6N HCl를 사용하여 pH를 2로 보정하고 30분간 4℃에 반응시킨 후 원심분리(3400×g, 20 min, 4℃)하여 상등액을 버리고 남은 펠렛을 메탄올 15 ml에 용해시켰다. 그리고 1N NaOH를 이용하여 pH 7로 보정 한 뒤 필터(0.22 ㎛ pore size)로 여과를 하고 진공 증발기를 사용하여 감압 증발시키고 증류수 1 ml을 넣어 재추출하였다. PDB 배지에서 배양한 4종류의 병원성 진균을 분광광도계를 이용하여 흡광도 값이 1.0이 되도록 보정을 한 뒤, 보정된 병원성 진균 배양액 150 ㎕와 재추출한 AMP 물질을 10, 30, 50 ㎕/ml를 첨가하여 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 37℃, 암조건, 150 rpm에서 6시간 간격으로 30시간 동안 분광광도계(multimode microplate reader Infinite M200, Tekan, Crailsheim, Germany)를 이용하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 AMP 대신 증류수를 넣어 병원성 진균의 생장을 동시에 측정하였다(Xu et al., 2013).
4.
생물계면활성
조사
4-1.
생물유화제
(
Bioemulsifier
) 생성 조사
균주의 생물유화제 생성을 알아보기 위해 GYM 배지에서 분리 균주를 3일간 선배양하고 분광광도계를 이용해 OD660에서 흡광도 값을 1로 보정하여 새로운 GYM 배지에 10% 접종 후 배양하였다(7 d, 30℃, 150 rpm, 암조건). 배양 후 24시간 간격으로 배양액을 원심분리 하여(12000×g, 20 min 4℃) 상등액 3 ml을 회수하고 다양한 종류의 오일(olive oil, mineral oil, soy bean oil)을 0.5 ml 첨가하였다. 그리고 2분간 강하게 와류교반한 뒤 30℃에서 1시간 동안 정치하여 층을 분리 후 수용액층을 회수하여 400 nm 파장에서 흡광도 값을 측정하였다. 400 nm 파장에서 측정한 흡광도 값을 0.01 유닛으로 하며, 1 유닛은 1 ml 당 유화활성 지수(EU/ml)를 의미한다. 가장 높은 유화 활성을 보인 오일을 이용하여 동일한 방법으로 접종 후 1일-11일간 유화활성을 측정하였다(Khopade et al., 2012).
4-2. 람노리피드 활성 조사
생물유화제 생성을 확인한 후 생물계면활성제인 글리코리피드의 람노리피드를 조사하기 위해 MS 배지(mineral salt 배지[glycerol 20 g, sodium nitrate 15 g, potassium chloride 1.1 g, sodium chloride 1.1 g, KH2PO4 3.4 g, K2HPO4 4.4 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, yeast extract 0.5 g, 5 ml trace element solution 1 L 증류수])(Wang et al., 2007)에 분리 균주를 선배양 하였다. 선배양액을 분광광도계를 이용하여 OD660에서 흡광도값을 1로 보정하고 새로운 MS 배지에 10% 접종 후 배양하였다(30℃, 150 rpm, 암조건). 24시간 간격으로 배양액을 원심분리 하여(12000×g, 20 min 4℃) 상등액 0.4 ml을 회수하고 에틸 에테르 0.75 ml을 첨가하여 3분간 와류교반 하였다. 잠시 정치하여 층을 분리하고 유기용매층을 회수한 뒤 동일한 방법으로 반복하여 1.5 ml의 에틸 에테르 층을 회수하고 바이알에 넣어 랩으로 감싸 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후에는 0.4 ml의 인산 완충액(pH 4.8)을 첨가하여 재추출하고 재추출액 0.1 ml과 오르시놀 시약(orcinol reagent[53% sulfuric acid에 녹인 0.19% orcinol]) 0.9 ml을 혼합하여 암조건에서 끓는 물에 넣어 30분간 반응시켰다. 그리고 상온까지 냉각시켜 421 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며 공 시료는 인산 완충액(pH 8)을 사용하고 표준물질은 L-람노오스를 이용하여 정량하였다(Ballot et al., 2009).
4-3.
리포펩티드
조사
리포펩티드 생성 조사를 위해 MOLP 배지(medium optical for lipopeptide production[peptone 30 g, saccharose 20 g, yeast extract 7 g, citric acid 10 mg, KH2PO4 1.9 g, 1 L 증류수, pH 7.0])에 분리 균주를 선배양하고 분광광도계를 이용해 OD660에서 흡광도값을 1로 보정하고 10%를 새로운 배지에 접종했다. 접종한 배지를 5일간 30℃, 150 rpm과 암조건으로 진탕배양하고 배양액 100 ml을 원심분리(3000×g, 30 min 4℃)한 후 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 분별깔때기에 넣고 부탄올 25 ml을 첨가하여 30분간 300 rpm으로 진탕시키고 15분간 정치하여 유기용매층을 분리하여 회수하였다. 위의 방법을 3번 반복하여 총 75 ml의 부탄올 추출물을 분리하고 진공 증발기를 이용하여 60℃에서 감압 증발시켜 메탄올 3 ml로 재추출하였다. 재추출액은 리포펩티드 성분을 분리하기 위한 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석시료로 사용하였다. 각 시료는 TLC 플레이트(PLC silica gel 60 F254 plate, Merck, Darmstadt, Germany)의 하단으로부터 30 mm가 되는 지점에 점적하였고, 스팟 간의 거리는 옆 시료에 의해 방해받지 않도록 2 cm 이상 차이나도록 하였다. 또한, 분석시료와 함께 표준물질로 서팩틴(surfactin)과 이투린 A(iturin A, Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.)를 희석하여 함께 분석하였다. 전개용매는 클로로포름:메탄올:물 혼합액(65:25:4)을 사용하였으며, 전개가 끝난 TLC 플레이트는 건조시킨 후 증류수로 관찰하였다. 분석 결과, 표준물질과 동일한 RF 값(retention factor)을 갖는 분획을 긁어 메탄올에 녹여 항진균활성을 조사하였다. 항진균활성이 나타난 분획물은 필터(0.2 ㎛ pore size)로 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였으며 서팩틴과 이투린 A의 이동상은 각각 아세토니트릴-트리플루오로아세트산(acetonitrile-triflouroacetic acid, 80:20, vol/vol)과 메탄올-물(70:30, vol/vol)을 이용했다. 유속은 두 물질 모두 1 ml/min이고 서팩틴과 이투린 A를 각각 210과 270 nm 파장에서 측정하였다(Afsharmanesh et al., 2014).
5. 균주 생장측정
항진균능 활성을 조사하여 선별된 균주를 대상으로 최대의 항진균 활성을 위한 최적 배양조건을 구축하기 위하여 베넷(Bennett)과 GYE 배지 종류에 따른 생장률을 측정하였다. 순수 분리한 HR391 균주를 베넷 배지(glucose 10 g, peptone 2 g, yeast extract 1 g, beef extract 1 g)와 GYE 배지에서 대수생장기가 끝나는 시점까지 선배양 하였으며 선배양한 균주의 배양액은 OD600이 1이 되도록 보정하였다. 보정된 배양액 10 ml을 새로운 베넷 배지 90 ml, GYE 배지가 들어있는 250 ml 삼각플라스크에 접종한 뒤 배양 조건은 pH 7, 30℃, 150 rpm, 암조건으로 통일시켰다. 이후 24시간 간격으로 배양액을 분광광도계를 이용하여 600 nm 파장에서 생장률을 조사하였다.
6. 균주
생장배지
조성에 따른 항균활성 비교
균주 배지 조성 중 탄소원과 질소원에 따른 항균활성을 비교하기 위하여 탄소원으로는 글리세롤, 포도당(glucose) 및 말토오스(maltose), 질소원으로는 효모 추출물(yeast extract)과 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 이용하고 나머지 배지 조성은 K2HPO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, CaCO3 3.0 g, NaCl 3.0 g, (NH4)2HPO4 1.0 g, 탄소원 15.0 g, 질소원 10.0 g 및 증류수 1 L이고, pH 7.2로 조정하여 사용하였고, 다양한 탄소원과 질소원 조합 배지를 제조하였다. 그리고 각각의 배지에 스트렙토마이세스 벨로서스 HR29(Streptomyces vellosus HR29) 균주 및 HR391 균주를 각각 접종하고 3일간 배양하여(30℃ 150 rpm, 암조건) 원심분리를 통해(3400×g, 30 min, 4℃) 상등액을 회수하였다. 병원성 진균은 PDB 배지에 7일간 배양하고(30℃ 150 rpm, 암조건) 분광광도계를 이용하여 OD660에서 흡광도값을 1로 보정하고 0.1 ml을 PDA 배지에 도말하였다. 도말 후 직경 5 mm의 코르크 보러를 이용해 배지에 웰을 만들어 다양한 탄소원과 질소원 조합 배지에서 배양한 균주의 상등액 70 ㎕를 첨가하였고 30℃에서 48시간 배양하여 웰 주위의 생장 저지환의 직경을 조사하였다. 대조군으로는 균주를 접종하지 않은 배양액을 이용하였으며 3번 반복하여 실험하였다.
7.
식물호르몬
생성능
조사
분리 균주의 식물생장 촉진능을 조사하기 위하여 식물호르몬인 IAA, 지베렐린(gibberellin)과 제아틴(zeatin)의 생성능을 조사하였다. 분리 균주는 BHB 배지(brain heart broth 배지[peptone 27.5 g, glucose 2 g, sodium chloride 5 g, Na2HPO4 2.5 g, 1 L 증류수, pH 7.0])에서 분리균주를 선배양하여 배양액을 분광광도계를 이용해 OD600에서 흡광도값을 1로 보정하고 10%를 새로운 BHB 배지에 접종하여 진탕배양하였다(3 d, 30℃, 150 rpm, 암조건). IAA 측정을 위해서는 보정한 선배양액을 접종한 BHB 배지에 IAA의 전구체인 트립토판(trytophan) 1 mM을 필터(0.2 ㎛ pore size)로 여과한 후 BHB 배지에 추가하여 진탕배양하였다. 3일간 배양한 배양액 100 ml을 원심분리(3000×g, 30 min 4℃)한 후 상등액을 회수하고 호르몬 산화 방지제인 부틸레이티드하이드록시톨루엔(butylated hydroxy toluene, BHT) 1 mg을 첨가하고 7 M HCl과 7 M NaOH를 이용해 pH를 보정하였다. 이때 IAA와 지베렐린은 pH 2.5, 제아틴은 pH 7로 보정하였으며 상등액을 분별깔때기로 옮겨 에틸 아세테이트 15 ml을 첨가하고 추출 교반기에서 30분간 300 rpm으로 진탕하였다. 진탕 후에는 15분간 정치하여 에틸 아세테이트층을 분리하여 에틸 아세테이트층을 옮겨 담고 위의 과정을 총 3회 반복하여 45 ml의 에틸 아세테이트층을 회수하였다. 회수한 에틸 아세테이트층은 진공 증발기를 이용하여 40℃에서 감압 증발시킨 후, 5 ml의 메탄올을 첨가하여 재추출하였다. 농축한 추출물은 필터(0.2 ㎛ pore size)로 여과하여 HPLC로 분석하였다. 분석에는 컬럼(Spursil 5μ C18 column, 250×4.60 mm)을 사용하고 IAA는 1% 아세트산이 포함된 35% 메탄올, 지베렐린은 0.1 M H3PO4를 이용하여 pH 3.0으로 보정한 30% 메탄올 그리고 제아틴은 70% 메탄올을 각각의 이동상으로 하였다. 또한 시료 주입량은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min으로 하여 IAA, 지베렐린과 제아틴을 각각 280, 254와 208 nm의 파장에서 30분간 측정하였다. 표준곡선은 각각의 표준물질을 구매하여 에탄올에 녹여 정량하였다(Karadeniz et al., 2006).
Ⅱ. 결과
1.
분리균주의
형태학적 특징 및 동정
항진균 활성이 우수한 방선균을 분리하기 위하여 강원도 춘천시 봉의산, 구봉산 등산로 주변의 유기물이 풍부한 토양에서 약 400여개의 방선균을 분리했으며 항진균활성 조사 방법으로 원판확산법를 통하여 여러 병원성 진균에 대하여 우수한 항진균능을 보이는 균주를 선별하고 HR391이라고 명명하였다. 동정 결과 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 HR391 균주는 스트렙토마이세스 코스타리카누스(Streptomyces costaricanus)로 99.0%의 상동성을 가지며 동정되었다(하기 표 1 참조).
| 균주(strain) | 과학적 명칭 | 기준주(type strain) | 상동성(%) |
| HR391 | Streptomyces costaricanus | NBRC100773 | 99.0 |
도 1에 나타난 바와 같이, HR391 균주는 형태학적 특징을 조사한 결과 포자를 생성하는 그람양성 사상균이었으며, 베넷 배지에서 48시간 배양 후 관찰한 결과 균사가 배지 속으로 신장하는 영양균사의 모습을 볼 수 있었으며, 72시간 이후에는 배지 위로 균사와 회백색 포자를 형성하였다.
2. 항진균 활성 조사 결과
2-1. 원판확산법
4 종류의 식물 병원성 곰팡이를 분리 균주 HR391과 함께 7일간 대치 배양하여 생육저지환의 유무를 조사해본 결과 시들음병 병원체(Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 덩굴쪼김병 병원체(F. oxysporum f. sp. niveum), 시들음병 병원체(F. oxysporum f. sp. lycopersici) 및 잎집무늬마름병 병원체(Rhizoctonia solani)에 대하여 각각 32, 35, 36 그리고 25균주가 병원성 곰팡이의 생장을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 3종류 이상의 식물 병원성 곰팡이를 억제하는 균주가 7균주, 4종류 이상의 곰팡이를 모두 억제하는 균주가 3균주로 조사되었다. 이 중 HR391 균주를 대상으로 식물 병원성 곰팡이에 대한 생육저지환의 크기를 조사한 결과, F. oxysporum f. sp. raphani, F. oxysporum f. sp. niveum, F. oxysporum f. sp. lycopersici와 R. solani에 대하여 분리균주를 놓지 않은 대조군과 비교했을 때 각각 26.52, 26.2, 21.2 및 23.8%로 모든 식물 병원성 진균에 대하며 비슷한 수치의 우수한 생장 저해활성을 보여주었다(하기 표 2 참조).
| 식물 병원성 곰팡이 | 원판확산 (mm) | 균사 생육저해능(%) |
| HR391 | HR391 | |
| F. oxysporum f. sp. raphani | 19.1 | 26.52 |
| F. oxysporum f. sp. niveum | 18.9 | 26.2 |
| F. oxysporum f. sp. lycopersici | 15.3 | 21.2 |
| Rhizoctonia solani | 17.2 | 23.8 |
2-2. 균주 상등액의 항진균 활성 조사(
건조균체량
)
고체배지에서 HR391균주와 병원성 진균의 대치배양을 통해 항진균능을 조사한 후 다양한 부피의 균주 배양 상등액을 첨가한 PDB 배지에 병원성 진균을 접종하고 5일간 배양하여 균사 생장 저해능을 조사하였다. 그 결과 전체 배지의 20%의 상등액을 첨가하였을 때 대조군에 비해 Fusarium oxysporum f. sp. raphani의 생장이 98.70 ± 0.62% 감소하였으며 전체 배지의 25%의 상등액을 첨가하였을 때는 99.05 ± 0.78%의 높은 균사 생장 저해능을 보였다. 또한 F . oxysporum f. sp. niveum, F. oxysporum f. sp. lycopersici와 Rhizoctonia solani도 25%의 상등액 첨가 배지에서 상등액을 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 64.57 ± 0.06, 45.27 ± 0.01과 54.23 ± 1.62% 감소하였다. 또한, 전체 배지의 1%만 상등액을 첨가해주었을 때도 모든 병원성 진균에서 20-30%의 생장 저해능을 나타냈다(하기 표 3 참조).
| 배양 상등액의 첨가량 (ml/100ml PDB 배지) | 균사체 생장 억제율 (%) (평균 ± 표준편차) | |||
| F. oxysporum f. sp. raphani | F. oxysporum f. sp. niveum | F. oxysporum f. sp. lycopersici | Rhizoctonia solani | |
| 0 | - | - | - | - |
| 1 | 23.24±1.85 | 27.60±3.45 | 21.30±0.59 | 30.32±0.79 |
| 10 | 61.82±7.16 | 34.62±8.13 | 26.39±5.69 | 38.58±0.79 |
| 20 | 98.70±0.62 | 45.52±1.02 | 36.31±2.88 | 53.54±8.54 |
| 25 | 99.05±0.78 | 64.57±0.06 | 45.27±0.01 | 54.23±1.62 |
3.
항진균능
물질
생성능
조사 결과
3-1.
시데로포어
생성능
조사
크롬 아주롤 S 한천평판법(Chrome azurol S agar plate assay)을 통해 정성적으로 탐색한 결과 노란색 환을 형성하며 활성을 나타낸 HR391 균주를 대상으로 시데로포어 생성능을 조사하였다. 그 결과 배양 후 48시간째 최대 활성을 보이며 0.093 mM 생성하였고 48시간 이후 활성이 지속적으로 감소하는 경향을 보였다(도 2 참조).
3-2.
키티나아제
활성 조사
세포벽 가수분해 효소인 키티나아제 활성을 정량하기에 앞서 먼저 정성적으로 탐색하기 위해 키틴-펩톤 평판 배지에 배양한 결과 HR391균주는 집락을 형성하여 키틴을 이용하는 것으로 나타났다. 이에 따라 HR391 균주로 키티나아제 활성을 측정해본 결과 72시간 째 최대 0.87 μmol glucose min-1 mg protein-1로 높게 분비하는 것을 알 수 있었다(도 3 참조).
3-3. β-1,3-
글루카나제
활성 조사
HR391 균주를 대상으로 세포벽 가수분해 효소인 β-1,3-글루카나제 활성을 DNS 방법과 균주의 단백질 정량을 통하여 조사한 결과, 0.2% 라미나린을 첨가한 펩톤 배지에서 24시간 째 0.46 μmol glucose min-1 mg protein- 1를 생산하며 최대 활성을 보인 후 감소하였다(도 4 참조).
3-4. 셀룰라아제 활성 조사
HR391 균주의 세포벽 가수분해 효소인 셀룰라아제 생성량을 단백질 정량 대비 값으로 나타낸 결과 셀룰라아제 활성은 CMC 배지에서 배양 1일 째부터 급격히 증가하여 0.43 μmol glucose min-1 mg protein-1만큼 생성한 후 4일까지 유지하였다. 그리고 다시 증가하여 5일 째 소폭 증가한 후 6일 째 0.58 μmol glucose min-1 mg protein-1로 최대 활성을 보인 후 감소하였다(도 5 참조).
3-5.
항균펩티드
(AMP) 조사
HR391 균주의 AMP 활성을 조사한 결과 AMP의 농도가 높아질수록 항진균능이 증가하였으며 50 ㎕/ml의 AMP를 첨가했을 때, Fusarium oxysporum f. sp. raphani, F. oxysporum f. sp. niveum와 F. oxysporum f. sp. lycopersici를 각각 11.8, 8.46와 7.35%를 억제하였다. 그러나 AMP 농도를 100 ㎕/ml로 높였을 때 항진균 활성은 큰 차이가 없었다(도 6 참조).
4.
생물계면활성
조사 결과
4-1.
생물유화제
(
Bioemulsifier
) 생성 조사
균주의 생물유화제 활성을 조사하기 위하여 다양한 종류의 오일(olive oil, mineral oil, soy bean oil)을 첨가하여 탁도를 조사하였으며 그 중 올리브 오일을 이용하여 실험을 수행하였을 때 가장 높은 활성을 보여주었다. 따라서 올리브 오일을 사용하여 접종 후 7일간 24시간 간격으로 생물유화제 생성을 조사하였으며 배양 1일 째 184.44 EU/ml로 가장 높게 나타났으며 그 이후 감소하였다(도 7 참조).
4-2.
람노리피드
활성 조사
생물유화제 생성을 확인한 후 생물계면활성제 중 하나인 글리코리피드인 람노리피드의 활성을 조사한 결과 10%의 선배양액을 접종한 후 배양 1일 째 87.49 mg/L로 가장 높은 활성을 보인 후 감소하여, 도 7의 생물유화활성과 비슷한 경향을 보였다(도 8 참조).
4-3.
리포펩티드
조사
리포펩티드 활성을 조사하기 위해 균주 배양액 추출물을 이용해 TLC를 수행한 결과 HR 391 균주는 이투린 A, 펜기신(fengycin), 서팩틴과 미지의 물질을 생성하는 것으로 예상할 수 있으며(도 9(A) 참조), 각 분획물을 긁어 생물학적 정량을 수행한 결과 이투린 A가 가장 높은 항진균 활성을 보였다(도 9(B) 참조). 또한 각 분획물을 동일하게 혼합하여 항진균능을 조사한 결과 단일 분획물의 활성이 더 높게 나타났으며 결과는 제시하지 않았지만 표준물질을 혼합한 결과도 동일하게 나타났다. 항진균 활성이 나타난 분획물인 이투린 A와 서팩틴을 HPLC를 이용해 정량한 결과 각각 10.89 ± 0.3 mg/L와 4.27 ± 0.1 mM로 조사되었다(하기 표 4 참조).
| 농도 | HR 391 |
| 이투린 A (mg/L) 서팩틴 (mM) |
10.89 ± 0.3 4.27 ± 0.1 |
5. 균주 생장측정
HR391 균주의 최대 항진균 활성을 위한 최적 배양을 위해 베넷 배지와 GYM 배지에서의 생장을 조사한 결과 흡광도값이 각각 0.795와 1.773으로 조사되었으며 GYM 배지에서 약 2배 높은 생장을 보였다(도 10 참조).
6. 균주
생장배지
조성에 따른 항균활성 비교
균주 생장배지를 구성하는 탄소원과 질소원에 따른 항진균능을 조사하였으며 그 결과 다양한 탄소원과 질소원 조합 배지에서 탄소원으로는 글리세롤, 질소원으로는 효모 추출물을 사용할 경우 가장 높은 항진균능을 보였다(하기 표 5 참조).
| 균주 | 생장 저지환의 직경 (mm) | |||||
| gk+y | gk+a | gl+y | gl+a | m+a | m+y | |
| HR29 | 5 | 8 | 13 | 8 | 9 | 14 |
| HR391 | 20 | 18 | 23 | 22 | 20 | 23 |
| gk: 포도당(glucose), gl: 글리세롤, m: 말토오스, y: 효모 추출물, a: 황산 암모늄 | ||||||
7.
식물호르몬
생성능
조사
HR391 균주가 식물의 생장을 직접적으로 촉진할 수 있는 식물호르몬을 생성할 수 있는지 알아보기 위해 BHB 배지에 균주를 배양하고 배양액에서 생성된 제아틴, 지베렐린과 IAA를 HPLC를 이용하여 정량하였다. 그 결과 HR391 균주는 72시간 째 제아틴, 지베렐린과 IAA를 각각 0.59±0.01 mM, 2.40±0.20 mM과 46.30±1.50 μM을 생성한 반면 앱시스산(abscisic acid)은 생성하지 못하였다(하기 표 6 참조).
| 균주 | 식물호르몬 생성 | |||
| 제아틴(mM) | 지베렐린(mM) | IAA(μM) | 앱시스산 | |
| HR391 | 0.59±0.01 | 2.40±0.20 | 46.30±1.50 | 비검출 |
Ⅲ. 결론 및 토의
본 발명에서는 주요 식물 병원성 곰팡이를 대상으로 항진균능이 우수한 방선균을 분리하는 것을 목적으로 하였으며 여러 항진균 물질의 생성능을 측정하여 생물학적 방제를 위한 새로운 생물제어제로의 가능성을 조사했다.
강원도 춘천시 봉의산, 구봉산 등산로 주변의 토양 시료로부터 분리한 우수한 항진균능을 가진 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391 균주를 대상으로 시들음병(Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 덩굴쪼김병(F. oxysporum f. sp. niveum), 시들음병(F. oxysporum f. sp. lycopersici)과 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani)과 같은, 시설작물에 빈번하게 발생하는 식물 병원성 진균에 대한 항진균능과 기작을 조사하였다. PDA 배지에서 7일간 HR391 균주와 식물 병원성 진균의 대치 배양을 통하여 항진균능을 조사한 결과 식물 병원성 곰팡이 종류에 따라 생장 저해 정도는 차이가 있었으나, 분리 균주를 두지 않고 실험한 대조군에 비해 각각 26.52, 26.2, 21.2 및 23.8%의 균사 생육저해능을 보였다(표 2 참조). 고체배지에서 대치배양을 통한 항진균 조사뿐만 아니라 균주 배양 상등액을 첨가한 PDB 배지에서의 진균의 생장 저해와 항진균성 휘발성 화합물에 의한 진균의 생장 저해를 추가로 조사하였다. 다양한 방식을 이용하여 항진균능을 조사하는 이유는 각각의 진균마다 생장 속도와 특성이 다양하기 때문에 하나의 항진균 조사 방법만으로는 균주의 정확한 활성을 알 수 없기 때문에 한 단계 이상의 과정을 통해 수행하였다(Xue et al., 2013).
미생물의 경우 다양한 항진균 기작을 통하여 식물 병원성 진균의 생장을 제어하는데 대표적으로 진균의 세포벽을 구성하고 있는 키틴, β-글루칸과 셀룰로오즈와 같은 성분들을 분해할 수 있는 세포벽 가수분해효소의 분비를 통한 용균작용(Patil et al., 2013), 식물 병원균에 기생하여 병원균의 생육을 저해하는 중복기생작용, 영양분이나 필수 미량원소를 경쟁하여 병원균의 생육을 억제시키는 경쟁적 길항작용(Gopalakrishnan et al., 2011), 미생물이 생산하는 항생물질을 통해 직접적으로 병원균의 생장을 억제하는 항생작용(Raaijmakers et al., 2002) 그리고 미생물이 분비하는 물질에 의해 식물체의 면역기능을 활성화 시켜 스스로의 저항성을 유도하는 전신 유도저항성 기작이 있다(Palaniyandi et al., 2013). 따라서 우수한 항진균능이 조사된 HR391 균주의 여러 항진균 기작을 조사한 결과 먼저 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균의 억제와 동시에 식물체에 철을 공급하여 식물 생장을 촉진하는 시데로포어를 생성하였으며 정량 결과 12~13 μmol ml-1을 생성한다고 보고된 P. fluorescens PFMDU3, PFMDU8와 PFMDU9 균주 보다 매우 높은 생성량을 나타내었다(Nagarajkumar et al., 2004). 또한 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제 활성 조사 결과 최대 0.85 μmol glucose min-1 mg-1 활성을 보인 Aeromonas schubertii 균주와 비교하였을 때 HR391의 키티나아제 활성은 약간 높은 결과를 보였다(Guo et al., 2004). 또 다른 세포벽 가수분해 효소인 β-1,3-글루카나제 활성 조사 결과는 0.46 μmol glucose min-1 mg-1로 선행 논문의 여러 균주보다 비슷하거나 낮게 조사되었다(Park et al., 2012). 셀룰라아제 활성을 알아보기 위해 균주를 CMC 배지에서 배양하여 생육저지환(clear zone)을 정성적으로 일차 확인하였으며 정량 결과 6일 째 0.58 μmol glucose min-1 mg protein-1로 최대 활성을 보였다. 세포벽 가수분해효소 이외에 지질막에 결합하여 병원균의 막을 파괴한다고 알려진 18-50개의 아미노산으로 이루어진 항균펩티드(AMP)를 조사한 결과 배양 후 30시간 동안 10% 내외의 병원성 진균의 생장 저해 활성을 보였으나 전신유도저항성 물질인 살리실산은 분비하지 않는 것으로 나타났다(도 6 참조).
추가적으로 다른 항진균 기작을 조사하기 위해 분리 균주의 생물계면활성을 측정하였는데 미생물의 생물계면활성은 항세균, 항진균, 항바이러스뿐만 아니라 면역 조절분자로 이용되며 백신이나 유전자 치료에도 사용되고 있다(Rodrigues et al., 2006). 미생물은 당, 글리세롤, 기름을 대사하여 생물계면활성제를 생산하는 것으로 알려져 있으며(Mukherjee et al., 2006) HR391 균주는 올리브 오일을 이용한 유화 활성이 가장 높게 나타났으며 이는 2012년 높은 생물계면활성이 보고된 Nocardiopsis sp. B4 균주가 올리브 오일 첨가 시 198 EU/ml의 활성을 보인 것과 비슷한 수치로 HR391 균주가 높은 유화활성을 갖는 것을 알 수 있다(Khopade et al., 2012). 7일간 올리브 오일을 이용한 균주의 유화활성 변화를 조사한 결과 배양 1일 이후 가장 높은 유화활성을 보이다 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 HR391 균주의 대수생장기 시기와 일치하는 것으로 볼 수 있는데 생물계면활성제 생합성이 대부분 대수생장기 동안 발생되며 균주의 생장과 함께 동반되는 일차 대사산물이기 때문인 것으로 판단된다. 따라서 대표적인 생물계면활성제 중 글리코리피드 중 하나인 람노리피드를 정량한 결과 정량값이 비교논문에 비하여 낮게 조사되었으며 이는 람노리피드가 주된 생물계면활성제로는 작용하지 않지만 여러 항진균 물질들과 함께 작용하여 상승작용을 나타낼 수 있다고 예상할 수 있다. 생물계면활성을 나타내는 다른 물질인 리포펩티드의 경우 TLC와 HPLC 결과 이투린 A와 서팩틴을 생성하는 것으로 조사되었으며 해당 분획물의 항진균 활성도 존재하는 것으로 나타났다. 추가적으로 결과는 제시하지 않았지만 리포펩티드 조사를 위해 분리한 TLC 분획물을 동량으로 혼합하여 상승작용에 따른 항진균 활성 증가를 알아본 결과 오히려 항진균 활성이 감소하였으며 이는 표준물질에서도 같은 결과를 얻을 수 있었다(Maget-Dana et al., 1992). 지질막 파괴를 통한 병원성 진균의 생육저해뿐만 아니라 리포펩티드는 표면 장력을 낮추어 표면에서의 산포(spreading)가 쉬울뿐만 아니라 콜로니 형성(colonization)에도 효과적이며 이는 콜로니 형성을 빠르게 할 수 있어 급격한 공간 확장을 통해 병원성 진균에 대하여 높은 생장 억제활성을 보일 수 있다(Afsharmanesh et al., 2014).
항진균 물질 생성능을 조사한 이후에 최대 항진균 활성을 위해 최적의 배양, 활성 시점을 알아보기 위하여 HR391 균주의 생장곡선을 조사한 결과, 대부분의 방선균이 느린 생장을 보인다는 보고와 달리 HR391 균주는 GYM 배지에서 배양 24시간만에 흡광도값이 1.733으로 높은 생장을 보이는 것으로 조사되었다(Khopade et al., 2012). 이는 방선균인 Nocardiopsis sp. B4 균주가 6일 이상 배양한 경우 600 nm 파장에서 1.5 이상의 흡광도값을 얻은 것에 비하여 상대적으로 높은 생장을 보이는 것으로 볼 수 있다. 또한 베넷 배지에서도 비교적 생장이 빨라 다양한 배지 조성에서도 배양이 가능할 것으로 예상할 수 있다. 그러나 빠른 생장으로 인해 높은 세포벽 가수분해효소의 활성에도 불구하고 큰 단백질 정량값으로 인해 효소 활성이 단백질 정량 대비 낮은 수준으로 측정되었다.
또한, 균주의 항진균능은 배지 조성에도 큰 영향을 받는다는 일부 논문의 보고에 따라 다양한 탄소원과 질소원을 조합한 배지에서 균주를 배양하여 항진균능을 조사한 결과 탄소원으로는 글리세롤과 질소원으로는 효모 추출물를 사용하였을 때 높은 항진균능을 나타냈는데 이는 Streptomyces hygroscopicus 균주가 여러 탄소원과 질소원 조합 배지 중 탄소원과 질소원을 각각 글리세롤과 효모 추출물로 사용했을 때 가장 높은 항진균 활성을 나타냈다는 결과와 일치하였다(Grahovac et al., 2014).
HR391 균주는 항진균 물질을 생성할 뿐만 아니라 식물의 생장을 직접적으로 촉진할 수 있는 식물 호르몬인 IAA, 제아틴과 지베렐린을 분비하는 것으로 조사되었으며 IAA의 경우 2011년 보고된 항진균능이 있는 Streptomyces spp. CAI-24, CAI-127, KAI-32와 KAI-90 균주보다 2-3배 가량 높게 분비하였다(Gopalakrishnan et al., 2011). HR391 균주뿐만 아니라 식물 호르몬을 분비하는 Streptomyces sp.의 여러 균주들도 보고된 바 있다(Palaniyandi et al., 2011).
상기 실험 결과들을 보았을 때 HR391 균주는 다양한 항진균 기작을 가지고 있으며 빠른 생장을 통해 친환경적인 생물제어제로의 적용 가능성이 높은 균주라고 볼 수 있다.
Claims (5)
- 스트렙토마이세스 코스타리카누스 HR391(Streptomyces costaricanus HR391)(수탁번호 KACC92095P) 균주를 글리세롤 및 효모 추출물 포함 배지에서 배양한 배양액을 포함하는, 시들음병균, 덩굴쪼김병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병 방제용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식물이 오이, 고추, 가지, 감자, 무, 부추, 파, 파프리카, 참외, 메론, 포도, 딸기, 토마토, 벼, 밀, 보리, 호박, 잔디, 담배, 장미 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 제제화에 사용가능한 계면활성제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
- 제1항의 조성물을 식물에 접촉시키는 단계를 포함하는 시들음병, 덩굴쪼김병 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병의 방제 방법.
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