KR102650962B1 - 스트렙토마이세스 에스피 jck-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하였을 때 항균 활성 및 유도저항성이 월등히 우수하므로, 식물 병해충의 방제에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 식물 병해충 방제 방법에 관한 것이다.
식물 병해충은 식물의 형태, 기능 및 보전을 부분적 또는 전체적으로 손상시키며, 이러한 식물 병해충으로는 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest), 선충 (Nematode), 바이러스 및 기생식물 등이 포함된다.
식물 병원성 세균은 주로 농작업 기구 및 진딧물, 벌 등의 곤충에 의해 옮겨진다. 한 식물체 혹은 나무에서 세균병이 발생할 경우, 농과원 전체가 감염될 정도로 전염성이 매우 강하고, 방제가 어렵다. 현재 세균병의 방제 방법은 항생제와 구리 합성 화합물의 단제 또는 혼합제를 사용하는 방법, 또는 저항성 품종을 재배하는 방법이 있다. 하지만, 이러한 방법도 식물병원 세균의 발생 및 확산에 유리한 환경조건에서는 효과가 미비하며, 화학 살균제 사용에 따른 농업생태계 오염과 항생제 저항성 균주가 출현하는 등 여러 가지 문제점이 있다.
식물 병원성 진균은 식물 내부 또는 표면에 정착하여 식물의 영양분을 빼앗아 번식하며 전 세계적으로 다양한 작물에 있어서 심각한 피해를 야기하고 있다. 과거 식물병에 의한 심각한 피해 사례 33개 중에서 17개가 진균에 의한 것으로 나타날 정도로 진균에 의한 식물병은 다른 병원균에 비해 다양하고 피해 정도가 크다.
식물 병원성 난균은 옥수수, 대두, 감자, 밀, 전나무 및 많은 관상용 종을 포함한 수백가지 다양한 식물 숙주의 댐핑 오프 (Damping off), 뿌리 썩음병, 역병 또는 노균병을 유발한다.
식물에 피해를 주는 해충은 진딧물, 응애, 갈색 깍지벌레, 솜깍지벌레 등이 있으며, 이 중 진딧물은 식물에 자주 나타나는 해충으로 수작업으로 눈에 보이는 대로 잡아준 후에, 사오일 간격으로 약제를 살포하여 방제한다. 다만, 진딧물 중 조팝나무진딧물은 사과, 배, 감귤, 조팝나무 등에 심각한 영향을 끼쳐, 약제방제 후에도 다시 다발생 할 수 있다.
지난 수십년 동안 병해충을 방제하기 위하여 화학농약을 사용하여 왔으나, 이들의 반복적인 사용과 사용량 오남용으로 인하여 토양과 주변수를 포함한 환경의 오염, 유용 미생물의 감소, 잔류 독성 및 저항성 균주의 발생이라는 심각한 문제들을 유발하였다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하고자 화학농약을 대체할 수 있는 미생물 및 미생물 유래 천연 물질을 이용한 친환경 농약이 대안으로 제시되었고 관련 연구들이 현재까지 활발하게 진행되고 있다.
하지만, 개발된 생물제제의 효능 및 종류는 아직 화학 농약과 비교하였을 때 충분하지 않기 때문에 더욱 우수한 생물학적 제제의 개발이 시급한 실정이다.
스트렙토마이세스 (Streptomyces)속은 방선균의 가장 큰 속이며, 다른 방선균과 마찬가지로 연쇄상 구균으로 그람 양성이며 GC 함량이 높은 게놈을 가진 것으로 알려져 있다. 주로 토양과 괴사하는 식물에서 발견되는 대부분의 스트렙토마이세스는 포자를 생산하며 복잡한 이차 대사에 의해 특징지어지는데, 이들은 임상적으로 유용한 자연 발생 항생제인 네오마이신, 사이파마이신, 보토로마이신, 클로람페니콜 등을 생산한다고 알려져 있다. 스트렙토마이세스속 균주로부터 항생 물질뿐만 아니라 여러 가지 생리활성 물질들이 분리되면서 이 균주는 산업적으로나 의학적으로 매우 중요한 미생물로 다루어지고 있다. 이러한 항생물질의 연구는 세균이나 진균 감염증에 유효한 물질에서 바이러스 병에 유효한 물질 탐색까지 발전하고 있으나, 이러한 연구들은 의학에 그 중점을 두고 진행됐다.
기존에 스트렙토마이세스 속을 이용한 인 비트로 (in vitro)연구는 방선균이 다양한 식물 병원성 미생물의 생장을 저해한다고 보고하였으며, 스트렙토마이세스 속이 분비하는 키틴네이즈는 식물 병원성 진균세포벽에 작용하여 진균의 생장을 저해할 수 있다고 보고하였다. 이러한 특징들로 미루어 볼 때, 스트렙토마이세스 속은 항균 생물 방제제로서 우수한 잠재력을 가지고 있다.
따라서, 이러한 스트렙토마이세스 속을 이용한 생물 방제제의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 식물병 원인균 또는 해충에 처리하였을 때 방제 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토트리신 E산, 스트렙토트리신 D 및 12-카바모일스트렙토트리신 D로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조방법, 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물 병해충 방제용 조성물은 식물병 원인균에 처리하였을 때 항균 활성이 월등히 우수하며, 유도저항성 기작으로 식물에서 병해충을 효과적으로 방제하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 2021년08월18일자 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁되었다.
본 발명의 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 균주인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “배양액”은 미생물을 배양한 후 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다.
본 명세서상의 용어“배양여액”은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 균체를 여과하여 제거한 뒤에 남은 액체를 의미한다. 배양여액은 미생물이 자라는 과정에서 형성하여 배출한 물질들이 포함되어 있어서 그 물질을 정제하거나 추출할 수 있다.
본 명세서상의 용어 “배양 상층액”은 원심분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거한 후 획득한 상층액을 의미한다.
본 명세서상의 용어 “추출물”은 균주의 배양액에서 분리한 것을 의미하며, 추출물은 분획물을 포함한다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 병해충으로 인한 병 (disease)은 과수 화상병, 세균성 풋마름병, 덩굴쪼김병 및 조팝나무진딧물로 인한 병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 식물 병해충 방제용 조성물은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 E산은 분자량이 649이며, 분자식이 C25H48N10O10이다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 E산은 하기의 화학식 I을 갖는다.
[화학식 I]
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 D는 분자량이 759이며, 분자식이 C31H59N12O10이다.
본 발명에 있어서 스트렙토트리신 D는 하기의 화학식 II를 갖는다.
[화학식 II]
본 발명에 있어서 12-카바모일스트렙토트리신 D는 분자량이 759이며, 분자식이 C31H59N12O10이다.
본 발명에 있어서 12-카바모일스트렙토트리신 D는 하기의 화학식 III을 갖는다.
[화학식 III]
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물은 첨가제, 증량제, 영양제 또는 봉해제 등의 부가제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 첨가제는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증량제는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 영양제는 스킴 밀크 (skim milk, 배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트 (bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 병해충 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 병해충 방제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 활성 분획은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계의 배지는 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 호모 및 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 농축하는 농축 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 희석하는 희석 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 건조하는 건조 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 건조 단계는 동결로 건조하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 균체 내의 성분을 추출하는 추출 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
배양액으로부터 배양여액을 얻는 배양여액 수득 단계;
배양여액을 여과하여 여과액을 제조하는 여과 단계;
여과액을 침전시켜 침전물을 생성하는 침전 단계;
침전물을 순화 (purify)하여 활성 분획을 선별하는 분획 단계; 및
활성 분획을 정제하는 정제 단계.
본 발명에 있어서 배양여액 수득 단계는 배양액을 2000 내지 5000 rpm, 2500 내지 5000 rpm, 3000 내지 5000 rpm, 3500 내지 5000 rpm, 4000 내지 5000 rpm, 4500 내지 5000 rpm, 예를 들어, 4500 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 여과 단계는 배양여액의 pH를 pH 3.0 내지 5.0, pH 3.4 내지 5.0, pH 3.6 내지 5.0, pH 3.0 내지 4.5, pH 3.4 내지 4.5, pH 3.6 내지 4.5, pH 3.0 내지 4.0, pH 3.4 내지 4.0, pH 3.6 내지 4.0, 예를 들어, pH 3.6 인으로 조정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 침전 단계는 아세톤으로 침전 시켜 침전물을 생성하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 침전물을 세파덱스 LH20 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)을 사용하여 순화 (Purify) 하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정제 단계는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reverse-phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)로 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 순수물질 동정 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 활성 분획을 건조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 ZORBAX C18 컬럼이 정지상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 0.01 내지 8 % 아세토나이트릴 용액이 이동상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 아세토나이트릴 용액은 0.05 % 트리플루오로초산 (Trifluoroacetic acid)이 첨가된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 조성물 처리 단계는 살포, 토양관주, 표면살포, 근권 처리, 종자 처리, 침지, 독이 및 훈연시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 “살포”는 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말살포, 과립살포, 수명시용 및 상시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서상 용어 “관주”는 토양이나 나무에 구멍을 파서 약액을 주입하는 약제 살포의 한 방법이다.
본 명세서상 용어 “토양 관주”는 작물 재배토양에 약액을 주입 또는 살포하는 방법이다.
상기 식물 병해충 방제용 조성물의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법에 있어서, 상기 식물 병해충 방제용 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 병해충 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액 또는 이의 추출물은 항균 활성 및 유도저항성이 월등히 우수하므로, 식물 병해충의 방제에 이용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 나타낸 계통도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주와 관련 스트렙토마이세스 균주 간에 유사도를 OAT 소프트웨어로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램 (Total ion chromatogram; TIC)을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 Streptothricin E acid의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 streptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 12-carbamoylstreptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 및 배양여액의 처리구의 GUS 발현 유무에 따른 PR1 유전자 발현유무의 검정 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR1의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR3의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR5의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR12의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리하지 않은 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리한 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 사진이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주와 관련 스트렙토마이세스 균주 간에 유사도를 OAT 소프트웨어로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램 (Total ion chromatogram; TIC)을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 Streptothricin E acid의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 streptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 LC-ESI-MS의 총 이온 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획의 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항균 활성분획 중 12-carbamoylstreptothricin D의 구조 동정을 나타낸 결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 사과화상병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 토마토 풋마름병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 오이덩굴쪼김병 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 및 배양여액의 처리구의 GUS 발현 유무에 따른 PR1 유전자 발현유무의 검정 결과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR1의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR3의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR5의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 처리한 후 유도저항성 유전자인 PR12의 발현양을 비교 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리하지 않은 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리한 사과나무에서 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)의 예방 효과를 평가한 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액에서 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D의 항균 활성물질 3종이 부분 정제된 분획(partially purified extract, PPE)을 토양관주하여 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가한 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 분리
식물 병해충에 방제 활성이 있는 균주는 대전의 고추풋마름병 다발생지역에서 건전한 고추 근권 (생장하는 뿌리가 물질을 섭취하고 저장함으로써, 결과적으로 구성 생물의 비율이 달라지는 등 다양한 변화를 일으키는 토양 환경)에 존재하는 토양에서 분리하였다. 토양 100 g을 채취하여 인산 완충 생리식염수 (Phosphate Buffered Saline, pH 7.0)에 희석한 후, 트립신 소이 아가 (Tryptic Soy Agar, TSA) 플레이트에 도말하여, 30 ℃에서 3 내지 7일 이상 배양하여 균주를 분리하였다.
실시예 2. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 분자생물학적 분석 및 계통도 분석
토양으로부터 분리한 균주는 16s rDNA의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 동정하였다. 분리한 균주를 효모*맥아 추출 한천배지 (Yeast extract malt extract agar; IPS2)에 도말하여, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 (Shaking culture)을 하였다. 그리고 아이-제노믹 비와이에프 디엔에이 추출 미니 키트 (I-genomic BYF DNA Extraction Mini kit, 인트론바이오테크놀로지사(iNtRON), 대한민국)를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA (gDNA)를 추출하였다. 구체적으로, 균주의 추출된 gDNA와 PCR-프리믹스 (Polymerase chain reaction-premix, 인트론바이오테크놀로지사, 대한민국) 그리고 균주의 16s rDNA를 증폭할 수 있는 하기 표 1의 프라이머 세트 27F/1492R을 혼합한 후 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'---> 3') | bp |
| 1 | JCK-6131 16S rRNA 27F forward primer | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | 20 bp |
| 2 | JCK-6131 16S rRNA 1492R reverse primer | GGTTACCTTGTTACGACTT | 19 bp |
PCR은 95 ℃에서 5분을 시작으로 30초 동안 95 ℃, 30초 동안 55 ℃, 30초 동안 72 ℃를 30번 반복한 후, 72 ℃에서 7분, 12 ℃에서 증폭을 끝냈다.
증폭된 16s rRNA 유전자 PCR산물의 염기서열 분석을 제노텍 (대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다.
상기 분리 균주인 JCK-6131 균주의 16s rRNA 코딩 염기서열로 총 1386 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'---> 3') | bp |
| 3 | JCK-6131 16s rRNA | ATGCAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTACCGCTGACCGCATGGTCTGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACGCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCTCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTGTGGAGGA |
1386 |
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 등록된 정보 (Genebank database)를 대상으로 블라스트 프로그램(Blast program, http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과 JCK-6131 균주는 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131로 동정되었으며 부분적인 16S rRNA의 염기서열(서열번호 3)은 GenBank에 accession number MW911616번으로 등록되었다. JCK-6131 균주는 하기 표 3과 같이 스트렙토마이세스 균주와 유전적 유사성을 나타내었다 (도 1a 및 1b).
| 염기서열 분석을 수행한 JCK-6141 균주의 유전자 | NCBI BlastN 분석을 통한 동정결과 | accession number | 유사성 (%) |
| 16S rRNA | Streptomyces coelicolor NRRL B-2812 | NR115770 | 97.77 |
| Streptomyces griseoviridis NBRC12874 | NR112313 | 97.84 | |
| Streptomyces albidoflavus DH3 | MG597555 | 97.99 | |
| Streptomyces violascens EGI125 | MN704434 | 97.99 | |
| Streptomyces koyangensis VK-A60 | CP031742 | 98.13 | |
| Streptomyces rutgersensis NBRC12819 | NR112395 | 97.92 |
따라서, JCK-6131 균주는 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.)로 동정되었으며, 상기 균주를 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131로 명명하였고, 2021년 08월 18일자로 대한민국 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14658BP를 부여 받았다.
실시예 3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 생리학적 및 생화학적 특성
3-1. 균총 색깔 및 색소 생성유무 평가
스트렙토마이세스속의 세균은 생성된 색소에 의해 종(species) 특이성을 결정되기도 하며, 이 색소의 생합성과정이 항생제 생합성과 상관관계가 있다고 알려져 있다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 균총 색깔과 색소 생성 유무를 확인하기 위하여 ISP1 (1 L 당 yeast extract 3 g, tryptone 5 g, agar 18 g, pH 7.0-7.2), ISP2 (1 L 당 yeast extract 4 g, malt extract 10 g, dextrose 4 g, agar 18 g, pH 7.3), ISP3 (1 L 당 oatmeal 20 g, agar 18 g, pH 7.2), ISP4 (1 L 당 soluble starch 10 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 .7H2O 1 g, NaCl 1 g, (NH4)2SO4 2 g, CaCO3 2 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.0-7.4), ISP5 (1 L 당 peptic digest of animal tissue 15 g, proteose peptone 5 g, yeast extract 1 g, C12H22FeN3O14 0.5 g, K2HPO4 1 g, Na2S2O3, agar 18 g, pH 7.0-7.2), ISP7 (1 L 당 glycerol 15 g, L-tyrosine 0.5 g, L-asparagine 1 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4 .7H2O 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeSO4 .7H2O 0.01 g, trace salt solution 1 mL, agar 18 g, pH 7.2-7.4) 배지를 사용하여 28 ℃에서 7일간 배양한 후 관찰 한 후, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| 균총 기저부의 색깔 | 회색 | 회색 | 흰색 | 흰색 | 흰색 | 회색 |
| 색소생성 | 짙은갈색 | 짙은갈색 | 옅은갈색 | - | - | 검정색 |
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 배지에 따라 회색에서 흰색의 균총을 생성하였으며, 짙은 갈색, 옅은 갈색 또는 검정색의 색소를 생성한 것을 관찰하였다.
3-2. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 효소활성 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 단백질분해효소 (protease), 아밀라아제 (amylase), 리파아제 (lipase), 셀룰라아제 (cellulase), 키티나제 (chitinase)의 활성을 측정하였다.
단백질분해효소의 활성은 1% 스킴 밀크 (skim milk)와 1% agar 첨가된 배지에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 접종한 후 배양하여 성장 저지환(clear zone)의 유무를 측정하였다. 아밀라아제의 활성은 2% 전분 (starch)과 1% agar 첨가된 배지에서, 리파아제는 2% 트윈 (Tween) 80, 0.01 % 메틸 레드 (Methyl red)와 1% agar가 첨가된 배지에서, 셀룰라아제는 0.2% 카르복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose; CMC)와 1% agar가 첨가된 배지에서, 키티나제는 K2HPO4 0.7 g/L, KH2PO4 0.3 g/L, MgSO4.5H2O 0.5 g/L, FeSO4.7H20, 0.01 g/L, ZnSO4, 0.001 g/L, MnCl2 0.001 g/L 혼합용액에 2.0 % moist colloidal chitin과 2 % agar를 첨가한 배지에서 각각 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 접종한 후 배양한 후 성장 저지환 (clear zone)의 유무를 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
| 효소활성/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| 단백질분해효소 | + | |||||
| 아밀라아제 | + | |||||
| 리파아제 | + | |||||
| 셀룰라아제 | + | |||||
| 키티나제 | - | |||||
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 키티나제를 제외한 단백질분해효소, 아밀라아제, 리파아제 및 셀룰라아제 활성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
3-3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 탄소원 및 질소원 활용능력 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 다양한 탄소원 및 질소원의 활용 능력을 평가하기 위해, 기본배지로 ISP4 배지(1 L 당 가용성 녹말 (soluble starch) 10 g, K2HPO4 1 g, MgSO4 .7H2O 1 g, NaCl 1 g, (NH4)2SO4 2 g, CaCO3 2 g, 미량의 염분 용액 (trace salt solution) 1 mL, agar 18 g, pH 7.0 내지 7.4)를 사용하였다.
탄소원은 가용성 녹말 10 g을 제거하고, 다양한 1 % 탄소원을 사용하였으며, 질소원은 (NH4)2SO4 2 g을 제거하고 다양한 0.1% 질소원을 최종농도로 첨가하여 활용농도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
| 탄소원/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| D-Fructose | + | |||||
| D-Galactose | + | |||||
| D-Mannose | + | |||||
| D-Xylose | + | |||||
| Lactose | + | |||||
| L-Arabinose | + | |||||
| Maltose | + | |||||
| Mannitol | + | |||||
| Raffinose | + | |||||
| Rhamnose | + | |||||
| Sacarose | + | |||||
| Starch | + | |||||
| Trehalose | + | |||||
| 질소원/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| Arginine | + | |||||
| Cysteine | + | |||||
| Phenylalanine | + | |||||
| Histidine | + | |||||
| L-Methionine | + | |||||
| Lysine | + | |||||
| Proline | + | |||||
| Serine | + | |||||
| Threonine | + | |||||
| Valine | + | |||||
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주는 실험에 사용한 모든 탄소원 (D-fructose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, lactose, L-arabinose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, sacarose, starch, trehalose)과 질소원 (arginine, cysteine, phenylalanine, histidine, L-methionine, lysine, proline, serine, threonine, valine)을 활용하여 생장할 수 있음을 확인하였다.
3-4. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 최적 생육온도, pH 및 염내성
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 최적 생육온도, pH 및 염내성을 분석하기 위하여 기본배지로 Bennet agar 배지(glucose 10 g/L, yeast extract 1 g/L, peptone 2 g/L, beef extract 1 g/L, agar 20 g/L)를 이용하였다.
pH 및 염내성 분석은 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 접종 후, 28 ℃에서 7일간 배양한 후 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
| NaCl (%)/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| 0 | +++ | |||||
| 2 | +++ | |||||
| 4 | ++ | |||||
| 6 | + | |||||
| 8 | + | |||||
| 온도 (℃)/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| 15 | + | |||||
| 20 | ++ | |||||
| 30 | +++ | |||||
| 40 | ++ | |||||
| 45 | + | |||||
| pH/배지 | ISP1 | ISP2 | ISP3 | ISP4 | ISP5 | ISP7 |
| 5 | ++ | |||||
| 7 | +++ | |||||
| 8 | +++ | |||||
| 10 | ++ | |||||
- : 음성, + : 양성
실시예 4. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 다양한 식물병원성 세균 및 진균의 균사 생장 저해농도 평가
4-1. 균주의 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 3일간 180 rpm으로 진탕배양을 하였다. 배양액을 10,000 rpm로 20분간 원심분리한 다음 0.2 μm 무균필터로 여과하여 배양여액을 수확하여 0.08, 0.16, 0.33, 0.63, 1.25, 2.5, 5 및 10%의 농도로 식물병원균 진균의 균사 및 세균에 처리하였다.
4-2. 균주의 식물 병원성 세균의 생장 최소 저해 농도 평가
16종의 식물 병원성 세균인 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)은 20 %(v/v) 글리세롤 용액에 현탁하여 -80 ℃에 저장되어 있던 상기 식물 병원성 세균을 TSA (Tripsin soy agar) 배지에 접종하여 30±2 ℃에서 1 내지 2일간 배양하여 접종원으로 이용하였다.
정치배양한 상기 16종의 식물 병원성 세균의 균사 생장 저해농도를 평가하기 위하여, 시험관에 5 mL의 TSB 액체 배지를 넣어 입구를 면전으로 막고 멸균한 후, 각각의 식물 병원성 세균의 콜로니를 하나씩 스트리퍼로 긁어 멸균한 TSB 액체 배지에 넣었다. 그 다음, 150 rpm으로 30±2 ℃에서 2일간 180 rpm으로 진탕배양하였다.
진탕배양한 식물 병원성 세균은 UV 스펙트로포토메타를 사용하여 OD600값을 0.1로 조절한 후, 멸균수로 희석하여 106 CFU/ml로 맞추어 96-웰 플레이트에 접종하였다. 항세균 활성 검정을 위한 병원균 접종 농도는 OD 값을 0.1로 맞춘 후 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 농도 105 CFU/ml로 맞추어 진행하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 병원균 현탁액 180μL을 가한 다음 여기에 20μL의 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양여액을 분주하여 시료를 10 %의 농도로 처리하였다. 그 다음, 10 %의 농도로 처리한 웰에서 100μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 100μL의 105 CFU/ml 세균 현탁액과 섞어 5%의 농도로 제조하였다. 2.5 % 내지 0.08 %도 상기 동일한 방법으로 희석하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 수행하였으며, 1 내지 3일 후에 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 번호 | 식물병원성세균 | 생장 최소저해농도 (MIC) | |
| 배양여액 (%) | 대조구 Streptomycin sulfate (μg/mL) |
||
| 1 | Acidovorax avenae subsp. cattleyae | 0.31 ± 0.00e | 500 ± 0.00b |
| 2 | Acidovorax konjaci | 0.42 ± 0.18e | 7.81± 0.00e |
| 3 | Agrobacterium tumefaciens | 10.00 ± 0.00a | 166.67 ± 72.17c |
| 4 | Burkholderia glumae | 10.00 ± 0.00a | 20.84 ± 9.02e |
| 5 | Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis | 10.00 ± 0.00a | 20.84 ± 9.02e |
| 6 | Erwinia amylovora TS3128 | 2.50 ± 0.00bcd | 5.21 ± 2.25e |
| 7 | Erwinia pyrifoliae | 3.33 ± 1.44bc | 5.21 ± 2.25e |
| 8 | Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum | 3.33 ± 1.44bc | 15.63 ± 0.00a |
| 9 | Pectobacterium chrysanthemi | 4.17 ± 1.44b | 500 ± 0.00b |
| 10 | Pseudomonas syringae pv. actinidiae | 3.33 ± 1.44bc | 15.63 ± 0.00e |
| 11 | Pseudomonas syringae pv. lachrymans | 3.33 ± 1.44bc | 15.63 ± 0.00e |
| 12 | Ralstonia solanacearum | 1.25 ± 0.00de | 10.42 ± 4.52e |
| 13 | Xanthomonas euvesicatoria | 2.50 ± 0.00bcd | 20.83 ± 9.02e |
| 14 | Xanthomonas arboricola pv. pruni | 2.50 ± 0.00bcd | 62.5 ± 0.00d |
| 15 | Xanthomonas campestris pv. citri | 3.33 ± 1.44bc | 31.25 ± 0.00e |
| 16 | Xanthomonas oryzae pv. oryzae | 1.25 ± 0.00de | 10.42 ± 4.52e |
Ducan의 다중검정에 따라 상기 표의 숫자 옆에 다른 문자를 보유한 경우, 통계적으로 유의성을 나타냄 (p<0.05)
상기 표 8에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 다양한 식물 병원성 세균의 증식을 저해하는 강력한 항세균 활성을 보였으며, 100 % 생장억제농도는 식물 병원성 세균에 따라 다소 차이를 보이기는 했지만 0.31 내지 10 % 범위의 MIC값을 나타내며, 우수한 항균활성을 나타내었다. 특히, 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 대조구로 사용된 스트렙토마이신 보다 모든 병원성 세균에서 우수한 항균 활성을 나타내었다.
4-3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 식물 병원성 진균의 생장 최소 저해 농도 평가
7종의 식물 병원성 진균인 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)과 1종의 식물 병원성 난균인 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 PDA (Potato Dextrose agar)에 접종하여 25 ℃에서 3 내지 5일간 배양하여 활성화 시켰다. 그 다음, 상기 7종의 식물 병원성 진균 및 1종의 식물 병원성 난균을 25 ℃에서 7일간 정치배양하였다.
균사체를 500 μg/mL (w/v) 농도로 조정한 뒤 블렌더 (DAIHAN, HG-15D)를 이용하여 마쇄하여 준비하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 균사 현탁액 180 μL을 가한 다음 여기에 20 μL의 시료를 분주하여 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액을 10 %의 농도로 처리하였다. 그 다음, 10 %의 농도로 처리한 웰에서 100 μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 100 μL의 마쇄된 균사를 섞어 5 %의 농도로 제조하였다. 2.5 % 내지 0.08 %도 상기 동일한 방법으로 희석하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 수행하였으며, 1 내지 3일 후에 결과를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
| 번호 | 식물병원성 진균 및 난균 | 배양여액 (%) |
| 1 | Botrytis cinerea | 0.42 ± 0.18d |
| 2 | Colletotrichum coccodes | 1.67 ± 0.72a |
| 3 | Fusarium graminearum | 0.63 ± 0.00cd |
| 4 | Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum | 1.25 ± 0.00ab |
| 5 | Raffaelea quercus-mongolicae | 1.04 ± 0.63bc |
| 6 | Rhizoctonia solani | 0.63 ± 0.00cd |
| 7 | Sclerotinia homoeocarpa | 1.25 ± 0.00ab |
| 8 | Pythium ultimum | 1.04 ± 0.36bc |
Ducan의 다중검정에 따라 상기 표의 숫자 옆에 다른 문자를 보유한 경우, 통계적으로 유의성을 나타냄 (p<0.05)
상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 다양한 식물 병원성 진균의 균사생장을 저해하는 강력한 항균 활성을 보였으며, 100 % 균사생장억제농도는 식물 병원성 진균에 따라 다소 차이를 보이기는 했지만, 0.42 내지 1.67 % 범위의 MIC 값의 우수한 항진균 활성을 보였다.
또한, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양여액은 난균인 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)에도 우수한 항균활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 항균 활성물질의 분리 및 구조 동정
5-1. 항균활성 물질의 분리
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주가 생산하는 항균 활성물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 배양 후, 배양액 (총 1L)를 4500 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 배양 상층액을 얻었다. 상기 배양 상층액을 pH=3.6으로 조정한 후, Amberlite XAD-16N resin (50 g)을 첨가하여 8시간 이상 방치 후 여과지로 여과하였다. 그 다음, 여과액을 차가운 아세톤으로 침전시킨 후, 10,000 rpm으로 원심분리를 하여 침전을 얻었다.
그 다음, 침전을 PBS (50 mM, pH 7.0)로 용해하였다. 용해된 침전물은 세파덱스 LH200 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)으로 순화되었으며, 분리된 분획 중 항균활성을 갖는 분획을 선발하였고, 선발된 항균 활성분획을 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (Reverse phase high-performance liquid chromatography; RP-HPLC)로 정제하였다.
5-2. 항균활성 물질의 질량분석
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주로부터 정제한 항균 활성물질은 ZORBAX C18 column (4.6 × 250 mm)을 장착한 양이온 모드의 액체 크로마토그래피-전자분무이온화-질량분석법 (LC-ESI-MS, Shimadzu 6AD HPLC; API2000)을 통해 질량분석을 실시하였다. 용출용매는 증류수와 0.05 % 트리플루오르초산 (TFA)이 첨가된 아세토나이트릴을 이용하였으며, 0 %부터 8 %의 0.05% 트리플루오르초산(TFA)이 첨가된 아세토나이트릴을 유속 1 ml/min으로 용출하고, 그 결과를 도 2a 내지 4c에 나타내었다.
도 2a 내지 4c에서 확인할 수 있듯이, 기존 문헌의 분자량 및 질량 스펙트럼을 비교하여 활성물질을 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)으로 동정하였다.
실시예 6. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 사과 화상병에 대한 인 비보 (
in vivo
) 방제효과 평가
6-1. 식물체 준비
3년생의 사과 유묘 품종인 '홍로'의 새로 나온 가지의 첨단에 달린 어린잎을 떼어내어 1분간 1 % 소독액 (Bleach 용액)에서 표면 살균을 한 후, 증류수로 3번 세척하였다. 그 다음, 크린벤치에서 바람에 건조하여 사과 화상병에 대한 인 비보 (in vivo) 방제효과 평가에 사용될 식물체를 준비하였다.
6-2. 시료 처리 및 접종
준비된 식물체에 핀셋으로 상처를 낸 후, 상처부위에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 멸균수로 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold) 및 20배 (FB_20 Fold) 희석한 후 각각 10 μL씩 처리하였다. 그 다음, 107 CFU/ml농도로 준비된 사과화상병 병원균 (Erwinia amylovora, 10 μL)을 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액이 선처리된 위치에 접종하였다. 대조약제로는 부라마이신수화제 (streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농; Bu)를 1000배 희석하여 사용하였다. 각각의 처리구는 병원균 접종 후 습도 75 %, 30 ℃에서 발병도를 조사하였다. 각 처리당 3 반복이며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였다. 병의 발병지수는 하기와 같이 4가지로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음,
지수 1 = 상처주변 괴사
지수 2 = 상처에서 먼 거리도 괴사
지수 3 = 전체식물 괴사
병 방제가는 하기 기술된 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 10 및 도 5a, 5b에 나타내었다.
[계산식 1]
방제가 (%) = (무처리구 발병도-처리구 발병도)/ 무처리구 발병도 × 100 %
| FB_5 Fold | FB_10 Fold | FB_20 Fold | Bu | |
| 평균 | 77.78 | 51.85 | 40.74 | 70.37 |
| 표준편차 | 6.41 | 6.41 | 6.41 | 11.11 |
상기 표 10 및 도 5a, 5b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 농도 의존적으로 사과화상병을 방제하였다. 특히, 균주 배양액을 5 배 희석하여 처리하였을 때, 대조약제인 부라마이신수화제과 유사한 방제 활성인 77.78 %의 사과 화상병 방제효과를 나타내었다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 인 비트로 (in vitro) 병원성 세균 생육저하효과와 마찬가지로 인 비보 (in vivo)에서도 사과 화상병 병원균 (Erwinia amylovora)에 의해 발병되는 병의 방제에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과 및 유도저항성 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 평가하였다. 식물체로는 서광 품종의 토마토를 원예용 상토에서 4엽까지 키운 후 사용하였다.
방제 효능을 평가하기 위해, 준비된 식물체에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 멸균수로 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold), 20배(FB_20 Fold) 및 100배 (FB_100 Fold) 희석한 후, 각각 20 mL씩 토양 관주 처리한 다음, 1일 후에 토마토 풋마름병의 원인균 (Ralstonia solanacearum)을 108 cfu/mL 농도로 20 mL을 토양 관주로 접종하였다. 이때, 대조약제로는 부라마이신수화제(streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농)를 1000배 희석하여 접종 1일 전에 처리하였다.
또한, 유도 저항성을 평가하기 위해, 준비된 식물체에 병원균 접종 3일 전에 100배 희석한 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액 (FB_100 Fold)을 엽면살포(F)하여 토양관주(S)로 접종한 방제 효능 평가 실험의 결과와 비교하였다. 이때, 대조 약제로는 부라마이신수화제(streptomycin sulfate 20% WP; 팜한농; Bu)를 1000 배 희석하여 사용하였다.
각 처리당 3회씩 반복하였으며, 매회 반복 시 3개의 포트로 구성하였다. 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였으며, 각각의 처리구는 토양 관주에 의한 병원균 접종 후 습도 75 %, 온도 30 ℃에서 10일 후의 발병도를 평가하였다. 병의 발병지수는 하기와 같이 4가지로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 잎 하나 시들음
지수 2 = 잎 2 내지 3장 시들음
지수 3 = 잎 4장 이상 시들음
지수 4 = 식물고사
병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 11, 12 및 도 6a, 6b에 나타내었다.
| FB_5 Fold | FB_10 Fold | FB_20 Fold | FB_100 Fold | Bu | |
| 평균 | 86.11 | 66.67 | 47.22 | 52.78 | 72.26 |
| 표준편차 | 4.82 | 8.34 | 4.81 | 4.81 | 4.75 |
| FB_100 Fold, F | FB_100 Fold, S | |
| 평균 | 52.78 | 55.55 |
| 표준편차 | 9.62 | 4.81 |
상기 표 11 및 도 6a에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 토마토 풋마름병을 효과적으로 방제하였으며, 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 5 배 및 10 배로 희석하여 처리하였을 때, 대조약제인 부라마이신수화제와 유사거나 더 우수한 방제 활성을 나타내었다.
또한, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액을 병원균 접종 3일 전에 100 배 희석하여 엽면살포하여 유도저항성을 평가한 결과, 엽면살포한 경우 (FB_100 Fold, F (Foliar spray))는 52.78%의 방제가를, 토양 관주로 방제한 경우 (FB_100 Fold, S (soil drenching)는 55.55 %의 방제가를 나타내었다 (도 6b).
이를 통해, 토마토 풋마름병 방제에 있어서, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 토양 관주나 엽면살포 시 모두 우수한 방제활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 오이덩굴쪼김병 방제효과 평가
8-1. 식물체 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 오이덩굴쪼김병에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 평가하였다. 8 x 16 연결포트 (15 mL/pot, 범농상, 대한민국)에 원예용상토 5호 (부농상토사, 대한민국)를 넣고 포트당 감수성 품종의 오이 종인 아시아청장 (아시아종묘, 대한민국)을 1립씩 파종하여 온실에서 7일간 재배하여 방제효과 평가에 사용될 식물체를 준비하였다.
8-2. 시료 처리
오이덩굴쪼갬병의 원인균인 푸자리움 옥시스포름 에프 에스피 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxyspoirum f.sp. cucumerinum, 이하, Foc)을 PDA 배지에 접종하고, 25 ℃에서 7일간 배양한 균총으로부터 균사 조각을 떼어내어 브이8-주스 브로스 (V8 broth, V-8 주스 200 mL, CaCO3 3g, 증류수 1L)배지에 접종하고, 7일 동안 25 ℃의 암상태로 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 진탕배양 후, 병원균 배양액을 수확하여 4겹의 거즈로 걸러 균사를 제거하고 원심 분리하여 (5,000 rpm, 10분, 4 ℃) 배양여액을 제거하였으며, 포자 침전물에 멸균수를 넣고 잘 현탁한 후에 혈구 계산기 (Hemacytometer)를 이용하여 광학현미경하에서 포자 (소형분생포자)의 농도를 1.0 x 106 conidia/mL이 되도록 멸균수로 희석하여 Foc 포자현택액을 접종원으로 사용하였다.
8-3. 인 비보 (
in vivo
) 생물검정
최아 (pregerminated seed)된 오이 종자를 포트당 1 개씩 이식한 후 25 ℃에서 7일 동안 오이유묘로 키웠다. 그 다음, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액를 5배 (FB_5 Fold), 10배 (FB_10 Fold), 20배 (FB_20 Fold) 및 100배 (FB_100 Fold) 희석 배양하여 각각 20 mL씩 발아 7일된 오이유묘에 토양 관주로 처리하였다. 그 다음, 시료처리 1일 후, Foc 균주의 포자 현탁액 20 mL을 토양관주로 접종하였다.
무처리구는 트윈 20 (Tween 20)이 250 ug/mL 수준으로 첨가된 용액을 처리하였으며, 대조약제로는 잘록엔 (Janrokend; Ja) 분산성액제 (활성성분 하이멕사졸 30%, 펜티오피라드 5%, 한국삼공, 대한민국)을 1000 배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 당 20 mL씩 토양 관주 처리하였다.
접종한 오이유묘는 25 ℃ 습실상에서 24시간 동안 암배양한 후에, 25 ℃ 항온실로 옮기고 하루에 12시간 동안 광을 조사하면서 4주 동안 재배하고, 오이덩굴쪼김병 발생을 조사하였다. 각 처리당 3회씩 반복하였으며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였다. 또한, 발병도는 다음과 같은 지수로 환산하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 25 % 이하 잎이 황변하거나 괴사
지수 2 = 전체잎의 26 내지 50 % 황변하거나 괴사
지수 3 = 전체잎의 51 내지 75 % 황변하거나 괴사
지수 4 = 전체잎의 76 내지 100 % 황변하거나 괴사
그리고 병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 13 및 7a, 7b에 나타내었다.
| FB_5 Fold | FB_10 Fold | FB_20 Fold | FB_100 Fold | Ja | |
| 평균 | 83.33 | 58.41 | 41.66 | 55.56 | 91.66 |
| 표준편차 | 4.81 | 9.75 | 4.81 | 4.81 | 4.81 |
상기 표 13 및 도 7a, 7b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액은 5 배, 10 배, 20 배 및 100 배 희석액 처리구에서 Foc 균주가 야기하는 오일덩굴쪼김병의 발생을 감소시켰으며, 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 시료의 5 배 희석액 처리구는 약 83.33 %의 방제가를 보여, 대조약제인 잔록엔과 유사한 방제활성을 나타내었다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액은 오이덩굴쪼김병의 원인균인 Foc 균주에 대해 우수한 항진균 활성을 갖는다는 것을 인 비보 (in vivo)로 확인할 수 있었다.
실시예 9. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 저항성유도 활성 평가
식물의 저항성은 살리실산 신호 전달계를 통하여 유도되고, 그 결과로 PR1 단백질이 발현된다. PR1 유전자의 발현은 식물에서 저항성의 유도여부를 검정하는 마커유전자로 사용되고 있다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액의 저항성유도 활성을 PR1 유전자 발현시스템으로 검정하였다.
PR1 프로모터 (Promoter)에 GUS가 표지 된 vector가 형질 전환된 애기장대를 이용하여, GUS의 발현유무에 따른 PR1 유전자 발현유무를 확인하고, 유도활성을 검정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 배양액 (FB) 및 배양여액 (FF)의 처리구는 양성대조구인 살리실산 (SA) 처리구와 동일하게 GUS가 발현되어, PR1 유전자가 발현되었음을 확인하였다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주가 식물의 살리실산과 유사한 기작으로 저항성을 유도하여 병원성 세균이나 진균을 방제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 10. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주의 유도저항성에 의한 토마토 풋마름병 방제 기작
토마토 풋마름병을 앓고 있는 토마토 잎에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 처리한 후, 토마토 풋마름병 방제 유도저항성 관련 유전자의 발현도를 평가하였다.
10-1. 식물체 준비
토마토 풋마름병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum)에 대한 방제효과를 조사하기 위해 서광 토마토 씨앗 (팜한농, 서울, 대한민국)을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 소주컵 (직경 36 mm)에 파종하였다. 10일 후 자란 새싹 들 중에서 상대적으로 더 잘 자란 토마토 새싹을 남겨두었다. 26일 후, 4엽기의 토마토 모종을 음료수 컵 (직경 7 cm)으로 이식하였다.
10-2. 유도저항성 유전자 발현 확인을 위한 시료 준비
4엽기의 토마토 모종에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액 100배 희석하여 20 mL씩 토양 관주로 처리한 후, 토마토 풋마름병의 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸을 108 cfu/mL 농도로 20 mL 토양 관주로 접종하였다.
유도저항성을 확인을 위해, 랄스토니아 솔라나세아룸을 접종하기 3일 전에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액을 엽면살포 하였으며, 유도 저항성 유전자 발현의 확인을 위한 시료로 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 배양액 처리 후 1일 (1dpt), 2일 (2dpt) 및 3일 (3dpt)과 랄스토니아 솔라나세아룸 접종 후 1일 (1dpi), 2일 (2dpi) 및 3일 (3dpi)에 각각 토마토 잎을 수확하였다.
10-3. 유도저항성 유전자의 발현 확인
각각의 수확한 토마토 잎을 RNA로 추출한 후 cDNA를 합성하였고, qRT-PCR을 통해서 특이적으로 증가되는 유도저항성 유전자의 발현을 확인하였다. qRT-PCR에 사용한 유도저항성 관련 유전자는 하기 표 14와 같다.
| 서열번호 | 명칭 | 서열 (5'---> 3') | bp |
| 4 | PR1 Forward | GCCAAGCTATAACTACGCTACCAAC | 25 |
| 5 | PR1 Reverse | GCAAGAAATGAACCACCATCC | 21 |
| 6 | PR3 Forward | ATGGCGGAAACTGTCCTAGTGGAA | 24 |
| 7 | PR3 Reverse | ACATGGTCTACCATCAGCTTGCCA | 24 |
| 8 | PR5 Forward | GAGGTTCATGCCAAACTGGTC | 21 |
| 9 | PR5 Reverse | CCGTCAACCAAAGAAATGTCC | 21 |
| 10 | PR12 Forward | TCACCAAACTATTGGATTTCAA | 22 |
| 11 | PR12 Reverse | GACTCAATTTTTGACTTCTTAATCC | 25 |
| 12 | UBI Forward | GGACGGACGTACTCTAGCTGAT | 22 |
| 13 | UBI Reverse | AGCTTTCGACCTCAAGGGTA | 20 |
구체적으로, IQeasy plus Plant RNA Extraction Mini Kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 식물체의 잎 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 분광 광도계 (NanoDrop ND-1000 spectrophotometer, 미국)를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하였다. 정량화한 총 RNA 1 ug으로부터 SuperScript Ⅳ First-strand Synthesis System (invitrogen, 미국)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA는 iQ TM SYBR Green Supermix (Bio-Rad, USA) 및 유도저항성 관련 서열번호 4 내지 13의 프라이머와 함께 CFX96 Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 증폭시켰다.
qRT-PCR은 95 ℃에서 3분을 시작으로, 15초 동안 95 ℃, 60초 동안 57 ℃를 40번 반복하였다. 그 다음, 증폭된 생성물의 특이성 확인을 위해, 멜팅 곡선 단계를 수행하였다. qRT-PCR은 동일한 조건으로 3회 반복하여 수행하였다.
각 유전자의 상대적 발현양은 상대 정량법인 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 타겟 유전자 발현의 정확한 측정을 위해 세포유지 유전자 (Housekeeping gene, ubiquitin (UBI))를 정규화에 이용하였다. 상기 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 최종적으로 분석된 실리실산 신호전달계와 자스모닉산 신호전달계에 관련된 PR1, PR3, PR5, PR12 유전자의 발현 양상을 하기 표 15 및 도 9a 내지 9d에 나타내었다.
| PR1 | 0 | 1 dpt | 2 dpt | 3 dpt | 1 dpi | 2 dpi | 3 dpi | |
| FB_100 fold | 평균 | 0.412 | 1.148 | 0.906 | 0.530 | 1.420 | 5.596 | 1.859 |
| 표준편차 | 0.135 | 0.536 | 0.075 | 0.066 | 0.161 | 1.495 | 0.170 | |
| 무처리구 | 평균 | 0.406 | 0.383 | 0.479 | 0.445 | 0.552 | 1.107 | 1.489 |
| 표준편차 | 0.087 | 0.091 | 0.016 | 0.044 | 0.031 | 0.136 | 0.192 | |
| PR3 | 0 | 1 dpt | 2 dpt | 3 dpt | 1 dpi | 2 dpi | 3 dpi | |
| FB_100 fold | 평균 | 0.480 | 0.950 | 0.720 | 0.343 | 2.132 | 0.526 | 0.458 |
| 표준편차 | 0.260 | 0.292 | 0.135 | 0.081 | 0.166 | 0.040 | 0.085 | |
| 무처리구 | 평균 | 0.482 | 0.505 | 0.494 | 0.486 | 1.119 | 0.611 | 0.617 |
| 표준편차 | 0.145 | 0.079 | 0.081 | 0.104 | 0.257 | 0.129 | 0.056 | |
| PR5 | 0 | 1 dpt | 2 dpt | 3 dpt | 1 dpi | 2 dpi | 3 dpi | |
| FB_100 fold | 평균 | 0.412 | 1.125 | 0.691 | 0.338 | 0.846 | 6.946 | 1.812 |
| 표준편차 | 0.135 | 0.262 | 0.336 | 0.045 | 0.560 | 1.402 | 0.352 | |
| 무처리구 | 평균 | 0.406 | 0.401 | 0.462 | 0.266 | 0.444 | 0.767 | 1.537 |
| 표준편차 | 0.087 | 0.174 | 0.192 | 0.045 | 0.064 | 0.282 | 0.134 | |
| PR12 | 0 | 1 dpt | 2 dpt | 3 dpt | 1 dpi | 2 dpi | 3 dpi | |
| FB_100 fold | 평균 | 0.487 | 0.632 | 0.421 | 0.320 | 2.940 | 0.399 | 1.053 |
| 표준편차 | 0.286 | 0.212 | 0.092 | 0.073 | 0.655 | 0.364 | 0.563 | |
| 무처리구 | 평균 | 0.462 | 0.467 | 0.447 | 0.320 | 0.552 | 1.202 | 0.592 |
| 표준편차 | 0.241 | 0.131 | 0.192 | 0.229 | 0.031 | 0.297 | 0.449 | |
상기 표 15 및 도 9a 내지 9d에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 배양액 처리 1일 (1dpt) 후 PR1, PR3, PR5, PR12 유전자의 발현량이 증가하였으며, 특히, PR1 및 PR5 유전자 발현량은 무처리구 대비 각각 약 2.99 배 및 약 2.80 배 상승하였으며, PR3 및 PR12 유전자 발현량은 무처리구 대비 각각 약 1.88 배 및 약 1.35 배 증가하였다.
또한, 토마토 풋마름병 병원균 접종 1일 (1dpi) 후 PR3와 PR12 유전자의 발현양은 무처리구 대비 각각 약 1.9배 및 약 5.3배 상승하였으며, 토마토 풋마름병 병원균 접종 2일 (2dpi) 후 PR1 및 PR5 유전자의 발현량은 무처리구 대비 각각 약 5.05 배 및 약 5.32배 상승하였다.
이를 통해, 식물의 저항성 유도에 관여하는 살리실산 신호전달계에 관련된 PR1 및 PR5 유전자와, 자스모닉산 신호전달계와 관련된 PR3 및 PR12 유전자 모두 토마토 풋마름병의 방제활성 증가에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제의 조팝나무진딧물 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 제조하여, 사과에 주요한 피해를 입히는 해충인 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)에 대한 방제효과를 평가하였다.
11-1. 분말수화제의 제조
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 배지에 접종한 다음, 28 
에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 그 다음, 균주 배양액 100 mL을 동결 건조하여 약 6 g의 동결건조물을 제조하였다. 동결건조물 2 g에 화이트 카본 (White carbon) 0.5 g, 소듐 도데실설페이트 (Sodium dodecylsufate; CR-SDS) 습윤제 0.5 g, 소듐 폴리 (나프탈렌 포름알데히드) 설포네이트 (Sodium poly (naphthalene formaldehyde) sulfonate; CR-100) 분산제 0.5 g 및 카올린 (Kaoline 증량제) 5.5 g을 혼합하여 총 10 g의 분말수화제를 제조하였다. 그 다음, 블렌더 (Blender)로 아주 미세하게 마쇄한 후, 상온에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
11-2. 분말수화제의 조팝나무진딧물 방제효과
제조한 분말수화제를 물로 500배 희석한 후, 3년생의 사과 유묘 품종인 '홍로'에 조팝나무진딧물이 발생하는 초기인 6월 16일과 6월 23일 7일 간격으로 2회 약제를 엽면분무처리 한 후, 그 결과를 도 10a 및 10b에 나타내었다.
도 10a에서 확인할 수 있듯이, 무처리구의 사과 유묘 잎 및 줄기에는 조팝나무진딧물이 윤안으로 관찰하기 매우 쉬울 정도로 다량 발생하였다. 반면, 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제를 처리한 사화 유묘의 잎 및 줄기에는 조팝나무진딧물이 전혀 관찰되지 않았다.
이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 포함하는 분말수화제는 조팝나무진딧물의 방제에 우수한 효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 12. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 유래 항세균 활성 분획의 토마토 풋마름병 방제효과 평가
12-1. 항세균 활성 분획물 및 식물체 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주를 지에스에스(Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 3일간 180 rpm으로 진탕배양을 하였다. 상기 배양액 1 L를 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 배양 상층액을 수득하였다. 상기 배양 상층액을 pH=3.6으로 조정한 후, Amberlite XAD-16N resin (50 g)을 첨가하여 8시간 이상 방치 후 여과지로 여과하였다. 그 다음, 여과액을 차가운 아세톤으로 침전시킨 후, 5,000 rpm에서 15분 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 그 다음, 침전물을 PBS (50 mM, pH 7.0)로 용해하였다. 용해된 침전물은 세파덱스 LH20 오픈 컬럼 (Sephadex LH20 open column)으로 순화되었으며, 분리된 분획을 선택하였으며, 도 11a 내지 11c에 나타낸 항균활성을 갖는 3종의 물질인 Streptothricin E acid, streptothricin D, 12-carbamoylstreptothricin D이 부분 정제된 분획 (partially purified extract, PPE)으로 사용하였다.
식물체로는 서광 품종의 토마토를 원예용 상토에서 4엽까지 키운 후 사용하였다.
12-2. 항세균 활성 분획물의 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL, 100 μg/mL, 10 μg/mL 농도)의 부분 정제된 분획 (PPE) 20 mL을 각각 준비한 식물체에 토양 관주로 처리하였다. 대조약제로는 부라마이신수화제 (Streptomycin sulfate 20 % WP, 팜한농; Bu)를 1000배 희석하여 사용하였다. 각 처리당 3회 반복하였으며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효과를 평가하였다.
각각의 처리구는 토마토 풋마름병 병원균의 원인균 (Ralstonia solanacearum)을 접종 후 습도 75 %, 30 ℃에서 10일 후 발병도를 평가하였다. 병발병 지수는 하기와 같이 4로 나누어 검사하였다.
지수 0 = 병징 없음
지수 1 = 잎 하나 시들음
지수 2 = 잎 2 내지 3장 시들음
지수 3 = 잎 4장 이상 시들음
지수 4 = 식물고사
그리고 병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 16 및 도 11a, 11b에 나타내었다.
| PPE_1000 μg/mL | PPE_100 μg/mL | PPE_10 μg/mL | Bu | |
| 평균 | 88.89 | 63.89 | 288.33 | 72.26 |
| 표준편차 | 4.82 | 12.73 | 412.81 | 4.75 |
표 16 및 도 11a, 11b에서 확인할 수 있듯이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL, 100 μg/mL, 10 μg/mL 농도)의 부분 정제된 분획은 토마토 풋마름병을 농도의존적으로 방제하였다. 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6131 균주 (1000 μg/mL)의 부분 정제된 분획을 처리하였을 때 약 88.89 %의 방제가를 나타내었으며, 이는 대조구로 사용한 부라마이신의 약 72.22 %의 방제가보다 약 16.67 % 더 우수한 방제효과를 나타내었다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Composition for controlling plant diseases and pests comprising
culture solution of Streptomyces sp. JCK-6131 Strain or extract
thereof, manufacturing methods thereof and controlling method for
plant diseases and pests
<130> PN210341
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JCK-6131 16S rRNA 27F forward primer
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JCK-6131 16S rRNA 1492R reverse primer
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1386
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JCK-6131 16s rRNA
<400> 3
atgcagtcga acgatgaagc ccttcggggt ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt 60
gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatacta 120
ccgctgaccg catggtctgg tggtggaaag ctccggcggt gcaggatgag cccgcggcct 180
atcagcttgt tggtgaggta gtggctcacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg 240
gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattgcac aatgggcgga agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc 360
gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa gcgcaagtga cggtacctgc agaagaagcg 420
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt gtccggaatt 480
attgggcgta aagagctcgt aggcggcttg tcgcgtcggt tgtgaaagcc cggggcttaa 540
ccccgggtct gcagtcgata cgggcaggct agagttcggt aggggagatc ggaattcctg 600
gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg 660
gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 720
gtccacgccg taaacggtgg gcactaggtg tgggcgacat tccacgtcgt ccgtgccgca 780
gctaacgcat taagtgcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat 840
tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc 900
ttaccaaggc ttgacatacg ccggaaagct ctggagacag agcccccctt gtggtcggtg 960
tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020
cgagcgcaac ccttgtcccg tgttgccagc aggcccttgt ggtgctgggg actcacggga 1080
gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg 1140
tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgatgcc gtgaggtgga 1200
gcgaatctct aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt 1260
cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta 1320
cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caacccctgt 1380
ggagga 1386
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR1 Forward
<400> 4
gccaagctat aactacgcta ccaac 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR1 Reverse
<400> 5
gcaagaaatg aaccaccatc c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR3 Forward
<400> 6
atggcggaaa ctgtcctagt ggaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR3 Reverse
<400> 7
acatggtcta ccatcagctt gcca 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR5 Forward
<400> 8
gaggttcatg ccaaactggt c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR5 Reverse
<400> 9
ccgtcaacca aagaaatgtc c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR12 Forward
<400> 10
tcaccaaact attggatttc aa 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PR12 Reverse
<400> 11
gactcaattt ttgacttctt aatcc 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UBI Forward
<400> 12
ggacggacgt actctagctg at 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UBI Reverse
<400> 13
agctttcgac ctcaagggta 20
Claims (24)
- 항균 활성 및 유도저항성을 갖는 균주로서, 상기 유도저항성은 식물의 살리실산 신호전달계 및 자스모닉산 신호전달계로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상을 통하여 유도되는 것인, 수탁번호 KCTC 14658BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주.
- 제1항에 따른, 상기 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 병해충 방제용 조성물은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른, 상기 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제15항에 있어서, 상기 병해충은 세균 (Bacteria), 진균 (Fungus), 난균 (Oomycetes), 해충 (Pest) 및 선충 (Nematode)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 세균은 아시도보락 아베나이 서브에스피 카틀레야 (Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아시도보락 코냐시 (Acidovorax konjaci), 아그로박테리움 투머페시언스 (Agrobacterium tumefaciens), 버콜데리아 글루메 (Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스 서브에스피 미시가넨시스 (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 어위니아 피리폴리에 (Erwinia pyrifoliae), 에르위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 펙토박테리움 카로토보룸 서브에스피 카로토보롬 (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi), 슈도모나스 시린게 패소바 라크리만스 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 슈도모나스 시린게 패소바 액티니디애 (Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 랄스토니아 솔라나시아룸 (Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 유베지카토리아 (Xanthomonas euvesicatoria), 잔토모나스 악소노포디스 패소바 사이트리 (Xanthomonas axonopodis pv. citri), 잔토모나스 아크리콜라 패소바 프루니 (Xanthomonas arboricola pv. pruni) 및 잔토모나스 오리재 패소바 오리재 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 진균은 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 콜레토크리쿰 코코데스 (Colletotrichum coccodes), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포룸 에프 에스피 쿠쿠메리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum), 라파엘라 쿼르쿠스-몽고리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 난균은 피디움 울티뭄 (Pythium ultimum)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제16항에 있어서, 상기 해충은 조팝나무진딧물 (Aphis citricola)을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제15항에 있어서, 상기 방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제21항에 있어서, 상기 활성 분획은 스트렙토트리신 E산 (Streptothricin E acid), 스트렙토트리신 D (streptothricin D) 및 12-카바모일스트렙토트리신 D (12-carbamoylstreptothricin D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식물 병해충 방제용 조성물의 제조방법.
- 제1항에 따른, 상기 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 병해충 방제 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물 처리 단계는 살포, 토양관주, 표면살포, 근권 처리, 종자 처리, 침지, 독이 및 훈연시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것인, 식물 병해충 방제 방법.
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| KR1020210115010A KR102650962B1 (ko) | 2021-08-30 | 2021-08-30 | 스트렙토마이세스 에스피 jck-6131 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 병해충 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물 병해충 방제 방법 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100812649B1 (ko) * | 2006-07-20 | 2008-03-13 | 한국생명공학연구원 | 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 속ｖｓｖ-12 ｋｃｔｃ１０９３６ｂｐ 및 이를 이용한 식물병원균 방제제 |
| KR101101783B1 (ko) * | 2010-02-08 | 2012-01-05 | 주식회사 해강바이오 | 항균활성과 살충력이 우수한 신규한 스트렙토마이세스속 균주 및 이의 배양방법과 배양물을 이용한 제제 |
Family Cites Families (3)
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
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| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |