KR20220066845A - 스트렙토마이세스 에스피 jck-6141 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법 - Google Patents

스트렙토마이세스 에스피 jck-6141 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법 Download PDF

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티 투 항 응웬
박애란
유난희
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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액, 이의 추출물을 식물병 원인균에 처리하였을 때, 항균 활성이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 식물병의 방제에 이용할 수 있다.

Description

스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법 {Composition for controlling plant disease comprising culture solution of Streptomyces sp. Strain or extract thereof, and controlling method for plant disease}
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양액, 균주의 배양액의 추출물에서 확인된 식물병 원인균에 대한 방제 효과에 관한 것이다.
식물 병원성 진균은 식물 내부 또는 표면에 정착하여 식물의 영양분을 빼앗아 번식하며 전 세계적으로 다양한 작물에 있어서 심각한 피해를 야기하고 있다. 과거 식물병에 의한 심각한 피해 사례 33개 중에서 17개가 진균에 의한 것으로 나타날 정도로 진균에 의한 식물병은 다른 병원균에 비해 다양하고 피해 정도가 크다. 또한, 과학적 및 경제학적으로 전 세계적으로 중요한 10가지 식물 병원성 진균으로 마그나포르테 오라이제 (Magnaporthe oryzae), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 폭시니아 에스피피 (Puccinia spp.), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 (Fusarium oxysporum), 브루메리아 그라미니스 (Blumeria graminis), 마이코스패렐라 그라미니콜라 (Mycospaerella graminicola), 코레토트리쿰 에스피피. (Colletotrichum spp.), 우스틸라고 메이디스 (Ustilago maydis), 멜람프소라 리니 (Melampsora lini) 등이 보고되었다.
식물 병원성 진균에 의한 식물병은 다음과 같은 이유로 인하여 방제가 매우 어렵다. 첫째로, 많은 식물 병원성 진균이 과도할 정도로 많은 수의 포자를 효율적으로, 지속해서 만들어 건강한 다른 식물체를 감염시키며, 둘째로, 감염 후 기주에서 포자 생산에 걸리는 시간이 짧고 포자의 이동성 또한 좋아 전염성이 높으며, 셋째로, 기주의 영양분을 탈취하는 능력이 좋고 기주에 해로운 독성 물질이나 효소를 분비하기도 한다. 이러한 특징으로 인하여 지속적인 방제 노력에도 불구하고 식물 병원성 진균은 기주 식물에 기생하여 막대한 경제적 피해를 유발하고 있다.
지난 수십년 동안 식물 병원성 진균병을 방제하기 위하여 화학적 살균제를 사용하여 왔으나, 이들의 반복적인 사용과 사용량 오남용으로 인하여 토양과 주변수를 포함한 환경의 오염, 유용 미생물의 감소, 잔류 독성 및 저항성 균주의 발생이라는 심각한 문제들을 유발하였다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하고자 화학농약을 대체할 수 있는 미생물 및 미생물 유래 천연 물질을 이용한 친환경 살균제가 대안으로 제시되었고 관련 연구들이 현재까지 활발하게 진행되고 있다.
하지만, 개발된 생물제제의 효능 및 종류는 아직 화학 살균제와 비교하였을 때 충분하지 않기 때문에 더욱 우수한 생물학적 제제의 개발이 시급한 실정이다.
스트렙토마이세스 (Streptomyces)속은 방선균의 가장 큰 속이며, 다른 방선균과 마찬가지로 연쇄상 구균으로 그람 양성이며 GC 함량이 높은 게놈을 가진 것으로 알려져 있다. 주로 토양과 괴사하는 식물에서 발견되는 대부분의 스트렙토마이세스는 포자를 생산하며 복잡한 이차 대사에 의해 특징지어지는데, 이들은 임상적으로 유용한 자연 발생 항생제인 네오마이신, 사이파마이신, 그리메마이시니, 보토로마이신, 클로람페니콜 등을 생산한다고 알려져 있다. 스트렙토마이세스속 균주로부터 항생 물질뿐만 아니라 여러 가지 생리활성 물질들이 분리되면서 이 균주는 산업적으로나 의학적으로 매우 중요한 미생물로 다루어지고 있다. 이러한 항생물질의 연구는 세균이나 진균 감염증에 유효한 물질에서 바이러스 병에 유효한 물질 탐색까지 발전하고 있으나, 이러한 연구들은 의학에 그 중점을 두고 진행됐다.
기존에 스트렙토마이세스 속을 이용한 인 비트로 (in vitro)연구는 방선균이 다양한 식물 병원성 미생물의 생장을 저해한다고 보고하였으며, 스트렙토마이세스 속이 분비하는 키틴네이즈는 식물 병원성 진균세포벽에 작용하여 진균의 생장을 저해할 수 있다고 보고하였다. 이러한 특정들로 미루어 볼 때, 스트렙토마이세스 속은 항균 생물 방제제로서 우수한 잠재력을 가지고 있다.
따라서, 이러한 스트렙토마이세스 속을 이용한 항균 생물 방제제의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 식물병 원인균에 처리하였을 때 항균 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항균활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기탁번호 KCTC 14333BPBP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 처리 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 식물병 원인균에 처리하였을 때 우수한 항균 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 식물병 원인균에 처리하였을 때 항균 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 항균 활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주이다.
본 발명의 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물이다.
본 명세서상의 용어 “배양액”은 미생물을 배양한 후 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다. “배양 상층액”은 원심분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거한 후 획득한 상층의 액을 의미하며, “상징액”이라고도 한다. “배양여액”은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 세균을 완전히 제거한 것을 의미한다.
본 명세서상 용어 “추출물”은 균주 배양액을 분리한 것을 의미하며, 추출물은 분획물을 포함한다.
본 발명에 있어서 식물병은 진균류 및 난균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryosphaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코레토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루나타 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포롬 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocercospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라포스퍼마 (Valsa cerasperma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)는 절대활물기생진균으로 살아있는 식물체에만 기생한다.
본 발명에 있어서 난균류는 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 균주의 배양액의 추출물은 리베로마이신 E (Reveromycin E), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (Reveromycin E 1-methyl ester) 및 리베로마이신 E 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법이다.
본 발명에 있어서 식물병은 진균류 및 난균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryosphaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코레토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루나타 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포롬 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocercospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라포스퍼마 (Valsa cerasperma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)는 절대활물기생진균으로 살아있는 식물체에만 기생한다.
본 발명에 있어서 난균류는 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 다음과 같은 분획 단계를 포함하는 것일 수 있다:
배양액으로부터 제1 활성분획을 획득하는 제1 분획 단계;
상기 제1 활성분획을 컬럼크로마토그래피 (Column Chromatography) 및 얇은층 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)를 이용하여 제2 활성분획을 획득하는 제2 분획 단계;
상기 제2 활성분획을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피 (High Pressure Liquid Chromatography)를 이용하여 제3 활성분획을 획득하는 제3 분획 단계;
상기 제3 활성분획을 분취용 얇은층 크로마토그래피를 이용하여 제4 활성분획을 분리하는 제4 분획 단계; 및
상기 제4 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 동정하는 순수물질 동정 단계.
본 발명에 있어서 제1 분획 단계는 배양액을 에틸아세테이트, 에틸에테르, 에탄올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 분획한 것 일 수 있으며, 예를 들어, 에틸아세테이트로 분획한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2 분획 단계는 다음과 같은 과정을 포함하는 것일 수 있다:
제1 활성분획을 농축하는 농축물 준비 단계;
상기 농축물을 용출하는 용출물 준비 단계; 및
상기 용출물을 분획하는 분획물 준비 단계.
본 발명에 있어서 농축물 준비 단계는 감압 농축기로 농축하는 과정을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용출물 준비 단계는 실리카 겔 컬럼 (Silica gel column)이 정지상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용출물 준비 단계는 클로로포름, 메탄올, 물 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 이동상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획물 준비 단계는 용출물을 실리카 겔 TLC (Thin Layer Chromatography)로 점적하여 분획하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획물 준비 단계는 클로로포름, 메탄올, 물 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 이동상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2 분획 단계에서 용출된 분획물은 단독으로 사용할 수 있고, 각각의 분획물을 합하여 사용할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제3 분획 단계는 0.1% 트리플루오로 아세틱산을 포함하는 증류수:아세토나이트릴을 20:80 내지 50:50, 30:70 내지 50:50 비율로 혼합하여 용출하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 Xbridge 컬럼이 정지상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 순수물질 동정 단계는 50 내지 100% 아세토나이트릴 용액이 이동상 역할을 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 순수물질은 리베로마이신 E (Reveromycin E), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (Reveromycin E 1-methyl ester) 및 리베로마이신 E 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 리베로마이신 E는 분자량이 688이며 분자식은 C38H56O11이다.
본 발명에 있어서 리베로마이신 E는 하기의 화학식 (I)을 갖는다.
[화학식 (I)]
Figure pat00001
본 발명에 있어서 리베로마이신 E 1-메틸 에스터는 분자량이 702이며, 분자식이 C39H58O11이다.
본 발명에 있어서 리베로마이신 E 1-메틸 에스터는 하기의 화학식 (II)을 갖는다.
[화학식 (II)]
Figure pat00002
본 발명에 있어서 리베로마이신 E 유도체는 분자량이 716이며, 분자식이 C40H60O11이다.
본 발명의 또 다른 양태는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물병 방제 방법이다.
본 발명에 있어서 식물병은 진균류 및 난균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 원인균으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryosphaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코레토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루나타 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포롬 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocercospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라포스퍼마 (Valsa cerasperma)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 진균류는 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)는 절대활물기생진균으로 살아있는 식물체에만 기생한다.
본 발명에 있어서 난균류는 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 균주의 배양액의 추출물은 리베로마이신 E (Reveromycin E), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (Reveromycin E 1-methyl ester) 및 리베로마이신 E 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 조성물 처리 단계는 토양관주, 토양관수, 엽면분무, 수간주사, 경엽 처리, 근권 처리 및 종자 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상 용어 “관주”는 토양이나 나무에 구멍을 파서 약액을 주입하는 약제 살포의 한 방법이다.
본 명세서상 용어 “토양관주”는 작물 재배토양에 약액을 주입 또는 살포하는 방법이다.
상기 식물병 방제용 조성물의 제조 방법 및 식물병 방제 방법에 있어서, 상기 식물병 방제용 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액, 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법에 관한 것으로서, 상기 균주의 배양액, 균주의 배양액의 추출물을 식물병 원인균에 처리하였을 때 항균 활성이 월등히 우수하므로, 이를 효과적으로 식물병의 방제에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주가 식물병원균의 생장을 억제한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 리베로마이신 E (F61), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (F71) 및 리베로마이신 E 유도체 (F81)의 분리 동정 과정을 나타낸 도식도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리한 F61 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리한 F71 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리한 F81 분획의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E (F61)의 음이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E (F61)의 양이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (F71)의 음이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (F71)의 양이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리한 리베로마이신 E 유도체 (F81)의 음이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리한 리베로마이신 E 유도체 (F81)의 양이온 모드 ESI-MS분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E (F61)의 화학구조를 나타낸 구조식이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액으로부터 분리 동정한 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (F71)의 화학구조를 나타낸 구조식이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 에틸아세테이트 분획물의 21개의 식물 병원성 진균 및 난균에 대한 생장 억제 활성을 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 DBI의 오이모잘록병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 DBI의 오이모잘록병에 대한 방제 효과를 나타낸 사진이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 HAI의 오이모잘록병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 HAI의 오이모잘록병에 대한 방제 효과를 나타낸 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 DBI의 오이덩굴쪼김병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 DBI의 오이덩굴쪼김병에 대한 방제 효과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 HAI의 오이덩굴쪼김병에 대한 방제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액 및 에틸아세테이트 분획물로 방제된 1 HAI의 오이덩굴쪼김병에 대한 방제 효과를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 처리하였을 때 벼 잎집무늬마름병에 감염된 낙동벼의 방제 정도를 나타낸 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 처리하였을 때 밀 붉은녹병에 감염된 은파밀의 방제 정도를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 처리하였을 때 맥류 붉은곰팡이병에 감염된 은파밀 이삭의 방제된 정도를 나타낸 사진이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 처리하였을 때 잔디 동전마름병에 감염된 크리핑 벤트 그라스의 방제된 정도를 나타내는 그래프이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 처리하였을 때 크리핑 벤트 그라스의 잔디 동전마름병의 방제된 정도를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 분리
식물병 방제 활성이 있는 균주는 전남 곡성에 존재하는 잡초 근권 (생장하는 뿌리가 물질을 섭취하고 저장함으로써, 결과적으로 구성 생물의 비율이 달라지는 등 다양한 변화를 일으키는 토양 환경)토양에서 분리하였다. 토양 1 g을 채취하여 인산 완충 생리식염수 (Phosphate Buffered Saline, pH 7.0)에 희석한 후, 트립신 소이 아가 (Tryptic Soy Agar, TSA) 플레이트에 도말하여, 30 ℃에서 3 내지 7일 이상 배양하여 균주를 분리하였다.
실시예 2. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 분자생물학적 분석 및 계통도 분석
본 발명을 통해 토양으로부터 분리한 균주는 16s rDNA의 염기서열 분석을 통해 분자 생물학적으로 동정하였다. 균주를 ISP2 배지에 접종한 다음 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 (Shaking culture)하였다. 그리고 아이-제노믹 비와이에프 디엔에이 추출 미니 키트 (I-genomic BYF DNA Extraction Mini kit, 인트론바이오테크놀로지사(iNtRON), 대한민국)를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA (gDNA)를 추출하였다. 구체적으로, 균주의 추출된 gDNA와 PCR-프리믹스 (Polymerase chain reaction-premix, 인트론바이오테크놀로지사, 대한민국) 그리고 균주의 16s rDNA를 증폭할 수 있는 하기 표 1의 프라이머 세트 9F/1512R을 혼합한 후 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
1 JCK-6141 16S rRNA 9F forward primer GAGTTTGATCCTGGCTCA 18 bp
2 JCK-6141 16S rRNA 1512R reverse primer ACGGCTACCTTGTTACGACTT 21 bp
PCR은 95 ℃에서 5분을 시작으로 30초 동안 95 ℃, 30초 동안 55 ℃, 30초 동안 72 ℃를 30번 반복한 후, 72 ℃에서 7분, 12 ℃에서 증폭을 끝냈다.
증폭된 16s rRNA 유전자 PCR산물의 염기서열 분석을 제노텍 (대전, 대한민국)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다.
상기 분리 균주인 JCK-6141 균주의 16S rRNA 코딩 염기서열로 총 1338 bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
3 JCK-6141 16S rRNA GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTTCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATATGA GCCTGGGAGG CATCTCCCGG GTTGTAAAGC TCCGGCGGTG AAGGATGAGC CCGCGGCCTA TCAGCTTGTT GGTGAGGTAA TGGCTCACCA AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGAAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC CTCTTTCAGC AGGGAAGAAG CGAAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCGC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGC GCAAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGCTTGT CACGTCGATT GTGAAAGCCC GAGGCTTAAC CTCGGGTCTG CAGTCGATAC GGGCTAGCTA GAGTGTGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG CCATTACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGGTGGG AACTAGGTGT TGGCGACATT CCACGTCGTC GGTGCCGCAG CTAACGCATT AAGTTCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT TACCAAGGCT TGACATACAC CGGAAAGCAT TAGAGATAGT GCCCCCCTTG TGGTCGGTGT ACAGGTGGTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGTTCTGT GTTGCCAGCA TGCCCTTCGG GGTGATGGGG ACTCACAGGA GACCGCCGGG GTCAACTCGG AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT GCCCCTTATG TCTTGGGCTG CACACGTGCT ACAATGGCCG GTACAATGAG CTGCGATACC GTGAGGTGGA GCGAATCTCA AAAAGCCGGT CTCAGTTCGG ATTGGGGTCT GCAACTCGAC CCCATGAAGT CGGAGTCGCT AGTAATCGCA GATCAGCATT GCTGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACGTCAC GAAAGTCGGT AACACCCGAA GCCGGTGG 1338 bp
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 등록된 정보 (Genebank database)를 대상으로 블라스트 프로그램(Blast program, http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과 표 3에 나타낸 바와 같이, JCK-6141 균주는 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.)로 동정되었으며, 상기 균주를 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141로 명명하였고, 대한민국 KCTC 14333BP에 기탁하였다.
염기서열 분석을 수행한 JCK-6141 균주의 유전자 NCBI BlastN 분석을 통한 동정결과 유사성 (%)
16S rRNA Streptomyces sp. HPF1204 (LC515800) 99.85
Streptomyces sp.Z2 (AF068055) 99.85
Streptomyces sp. MR602 (LC381941) 99.48
실시예 3. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 처리에 따른 식물병원균의 균사 생장 저해 활성 및 효소활성 측정
분리 선별한 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 식물병원균의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해, 3종의 식물병원균인 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)를 대상으로 생장 저해 활성을 측정하였다. 높은 성장 속도로 성장하고 있는 배양체로부터 얻은 식물병원균의 균사조각을 PDA (Potato Dextrose Agar)배지 한쪽 부분에 접종하고, 식물병원균을 접종한 부위로부터 약 2.5 cm 정도 떨어진 부위에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 직선으로 접종한 다음 28 ℃에서 배양하였다. 배양의 진행을 관찰하다가 식물병원균이 가장자리까지 생장할 때 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주에 의한 식물병원균의 균사 생장 저해 정도를 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이에스 에스피 JCK-6141 균주는 식물병원균인 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.쿠쿠머리눔, 피티움 울티멈, 라이족토니아 솔라니의 생장을 강하게 저해하는 것으로 나타났다.
실시예 4. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 처리에 따른 식물병원균의 균사 생장 최소 저해농도 측정
분리 선별한 스트렙토마이세스 에스피 (Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 식물병원균의 균사 생장 최소 저해농도를 측정하였다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양을 하였다. 배양액을 4500 rpm으로 20분간 원심분리한 다음 상층액을 0.2 μm 무균필터로 여과하여 배양여액 (이하, 시료라함)을 수확하여 0.16, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5 및 10 %의 농도로 식물병원균 균사에 처리하였다. 그리고 식물병원균인 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea) 및 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum)의 균사는 PDB 배지에서 25 ℃로 7일간 정치 배양한 후, 균사체를 500 μg/ml (w/v) 농도로 조정한 뒤 블렌더 (DBIHAN, HG-15D)를 이용하여 마쇄하여 마쇄된 균사를 준비하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰에 180 μL의 마쇄된 균사를 가한 다음 여기에 20 μL의 시료를 분주하여 시료를 10 %의 농도로 처리하였다. 그리고 10 %의 농도로 처리한 웰에서 100 μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 100 μL의 마쇄된 균사를 섞어 5 %의 농도로 제조하였다. 이와 같은 방법으로 계속 희석을 반복하여 0.16, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5 및 10 %의 농도로 제조하였다. 25 ℃에서 24시간 후에 균사의 생장 정도를 측정하였으며, 각 처리구는 3회 반복으로 실험을 수행하였다.
균주 MIC values (%)
푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.라이코퍼시시 피티움 울티멈 라이족토니아 솔라니 보트리티스 시네레아 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.쿠쿠머리눔
JCK-6141 0.63 0.31 0.63 0.31 0.31
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양여액은 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.라이코퍼시시, 피티움 울티멈, 라이족토니아 솔라니, 보트리티스 시네레아 및 푸사리움 옥시스포룸 에프.에스피.쿠쿠머리눔과 같은 다양한 식물병원균의 균사 생장을 저해하는 강력한 항균활성을 보였으며, 100 % 균수 생장 억제농도는 식물병원균에 따라 다소 차이를 보이기는 했지만 0.31 내지 0.63 % 범위의 MIC values (%)을 나타내며 우수한 항균활성을 보였다.
실시예 5. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 항균활성 물질의 분리 및 구조 동정
5-1. 항균활성 물질의 분리
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주가 생산하는 항균활성 물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 지에스에스 (Glucose-Soybean meal-Sodium chloride; GSS) 액체배지에 접종한 다음, 28 ℃에서 7일간 180 rpm으로 진탕배양 하였다. 배양 후, 도 2와 같이 배양액 (총 3L)을 400 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 배양 상층액을 분리하였다. 배양 상층액을 pH를 2로 조정한 후, 에틸아세트 (3L)로 2회 분획하여 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물 (제1 활성분획)을 제조하였다.
제조한 에틸아세테이트 분획물 (제1 활성분획)은 감압 농축기를 이용하여 농축하였고, 항균활성 물질을 더욱 순수하게 분리하기 위하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel Column Chromatography)를 수행하였다. 실리카 겔 컬럼 (500g, 200-400 mesh)에 로딩한 후, 클로로포름:메탄올 (8:2, 1L), 클로로포름:메탄올 (7:3, 1L) 및 클로로포름:메탄올:물:아세트산 (30:9:1:0.25, 2L)로 용출하였다. 용출한 분획들은 실리카 겔 얇은층 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)(0.25 mm film thickness)에 점적 한 후, 클로로포름:메탄올:물:아세트산 (30:9:1:0.25)로 전개한 후, 흡광도 254 nm에서 관찰하였다. 그리고 파라-아니스알데하이드 (p-anisaldehyde) 시약을 분무한 후, 발색되는 양상이 비슷한 분획들을 모아 감압 농축하였다.
감압 농축한 분획들 중 라이족토니아 솔라니에 대하여 항진균 활성을 보이는 한 개의 분획 (제2 활성분획)을 선택하여 Atlantisⓡ T3f prep OBDTM(5 μm, 19 x 250 mm) 컬럼이 장착된 분취용 고성능 액체 크로마토그래피 (High pressure Liquid Chromatography, Waters사, 일본)를 사용하여 물질 분리를 실시하였다. 용출 용매는 0.1% 트리플루오로 아세틱산 (Tifluoroacetic acid, TFA)이 첨가된 증류수 및 아세토나이트릴 (Acetonitrile)을 이용하였다. 0.1% 트루플루오르 아세틱산을 포함하는 증류수를 아세토나이트릴에 첨가하여 50% 부터 70%의 아세토나이트릴 용액을 제조하였다. 그리고 50% 부터 70% 아세토나이트릴 용액을 50분 동안 유속 15 ml/min으로 용출하였다. 용출 결과, 총 14개의 분획 (F1 내지 F14, 제3 활성분획)을 획득하였다.
이들 중 항진균 활성을 보이는 F6, F7 및 F8의 3개의 분획은 다시 분취용 얇은층 크로마토그래피 (실리카겔 Thin Layer Chromatography, 0.5 mm film thickness)로 물질분리를 하였다. 전개 용매로는 클로로포름:메탄올:물:아세트산 (30:9:1:0.25)를 이용하였고, 그 결과 활성을 보이는 F61 (35.2 mg), F71 (15.3 mg) 및 F81 (9.2 mg) (제4 활성분획)을 획득하였다.
이렇게 획득한 F61, F71 및 F81에 대하여 활성 순수물질 동정을 수행하였다. 고성능 액체 크로마토그래피로 Xbridge C18(4.6 x 250 mm, 5 um) 컬럼에 50% 아세토나이트릴 용액부터 시작하여 35분에 100 % 아세토나이트릴 용액으로 유기용매 양을 올려서 분석하였다. 활성 물질은 PDA (photodiode array) 디텍터로 검출하였으며, 검출 파장은 240 nm에서 확인하여 그 결과를 도 3a 내지 3c에 나타내었다. 특히, F71은 두 개의 이성질체 또는 거의 유사한 물질이 1:1의 비율로 혼재하고 있음을 확인할 수 있었다.
5-2. 항균활성 물질의 분자량 동정
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주로부터 분리된 3개의 물질은 동결 건조하여 음이온 모드와 양이온 모드의 액체 크로마토그래피 전기분무 질량법 (LC-ESI-MS, API2000, ABSCIEX사, 미국)을 통해 F61, F71 및 F81 분자량을 확인하여 그 결과를 도 4a 내지 도 6b에 나타내었다.
실험 결과, 도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이 F61은 음이온 모드에서 [M-1]- 이온이 687.3749, [M+Na]+ 이온이 711.3725에서 나타남으로서 분자량이 688임과 동시에 분자식이 C38H56O11임을 알 수 있었다. 도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이 F71은 도 음이온 모드에서 [M-1]- 이온이 701.3885, [M+Na]+ 이온이 725.3878에서 나타남으로서 분자량이 702이며, 분자식이 C39H58O11임을 확인할 수 있었다. 그리고 도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이 F81은 음이온 모드에서 [M-1]- 이온이 715.4095, [M+Na]+ 이온이 739.4048에서 나타남으로서 분자량이 716이며, 분자식이 C40H60O11임을 확인할 수 있었다. F71의 분자량과 F81의 분자량은 F61의 분자량과 비교할 때 각각 분자량이 14와 28의 차이를 보임에 따라 리베로마이신 E의 유도체로 추정되었다.
5-3. 항균활성 물질의 화학구조 동정
F61 및 F71의 화학구조를 동정하기 위하여 다양한 모드의 NMR분석을 실시하였다. 그중 F61의 NMR 데이터를 정리한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
position H C COSY HMBC
1 168.87 2, 3, 1-ME
2 5.82 (dt) 121.25 3, 4 1, 4, 5, 1-ME
3 6.98 (dd) 151.27 2, 4 1, 2, 4, 5, 4-Me
4 2.53 (q) 42.89 3, 5 2, 3, 5, 4-Me
5 4.07 (q) 75.68 4, 6, 7, 4-Me 4, 6, 7, 4-Me
6 5.52 (m) 126.52 4, 5, 7 5, 7, 8
7 6.25 (dd) 136.3 5, 6 5, 6, 8, 8-Me
8 140.36 9, 10, 8-Me
9 5.55 (d) 126.41 7, 10a 8, 10, 8-Me
10a 2.38 (dt) 31.57 9, 11 8, 9, 11, 8-Me
10b 1.83 (d)
11 3.46 (dt) 74.87 10a, 12 9, 10
12 1.42 (dd) 33.38 11, 13,12-Me 10a, 11, 13
13a 1.48 (m) 27.37 14a 11, 12, 14, 15
13b 1.53 (dd)
14a 1.74 (d) 35.5 13a
14b 1.45 (d) 13, 15, 16
15 95.66 14, 16, 17
16a 1.83 (d) 31.36 17 14,15,17,18
16b 1.60 (d) 17 15, 17, 18
17a 2.02 (m) 24.04 16ab, 17b 15
17b 2.34 (t) 16ab, 19 18, 19, 20
18 82.85 16, 17b, 25
19 4.61 (d) 78.37 17b, 20 15, 17, 18, 20, 21
20 6.44 (s) 132.69 19 19, 21
21 6.46 (s) 137.86 22
22 150.95 21, 23
23 5.88 (d) 120.41 22-Me 21, 22, 24, 22-Me
24 168.77 22-Me,23
25a 1.87 (d) 34.17 26 18, 26
25b 1.61 (d) 26
26 1.24 (m) 29.02 25, 27, 28 25, 27
27a 1.23 (m) 22.16 26, 28 26, 28, 29, 30
27b 1.27 (m) 26, 28 26, 28, 29, 30
28a 1.24 (m) 31.2 27, 29 30
28b 1.22 (m) 27, 29, 30
29a 1.27 (m) 21.31 27, 28, 30
29b 1.23 (m) 27, 28, 30
30 0.86 (t) 13.00 29a 27, 28, 29
4-me 1.09 (dd) 13.99 4 3, 4, 5
8-me 1.76 (s) 11.61 6 7, 8, 9
12-me 0.79 (t) 16.69 12 11, 12, 13
22-me 2.27 (s) 13.27 21, 23 20, 21, 22, 23, 24
1' 171.97 2', 3'
2' 2.61 (m) 29.76 1', 3', 4'
3' 2.58 (t) 28.51 2', 3', 4'
4' 174.54 2', 3'
1-ME 2.27 (s) 51.05 2 1, 2
상기 표 5 및 도 7a에서 확인할 수 있듯이, F61의 화학구조는 리베로마이신 E (Reveromycin E, F61)으로 동정되었다.
F71의 NMR 데이터를 정리한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
position H C COSY HMBC
1 168.87 2, 3, 1-ME
2 5.82 (dt) 121.25 3, 4 1, 4, 5, 1-ME
3 6.98 (dd) 151.27 2, 4 1, 2, 4, 5, 4-Me
4 2.53 (q) 42.89 3, 5 2, 3, 5, 4-Me
5 4.07 (q) 75.68 4, 6, 7, 4-Me 4, 6, 7, 4-Me
6 5.52 (m) 126.52 4, 5, 7 5, 7, 8
7 6.25 (dd) 136.3 5, 6 5, 6, 8, 8-Me
8 140.36 9, 10, 8-Me
9 5.55 (d) 126.41 7, 10a 8, 10, 8-Me
10a 2.38 (dt) 31.57 9, 11 8, 9, 11, 8-Me
10b 1.83 (d)
11 3.46 (dt) 74.87 10a, 12 9, 10
12 1.42 (dd) 33.38 11, 13,12-Me 10a, 11, 13
13a 1.48 (m) 27.37 14a 11, 12, 14, 15
13b 1.53 (dd)
14a 1.74 (d) 35.5 13a
14b 1.45 (d) 13, 15, 16
15 95.66 14, 16, 17
16a 1.83 (d) 31.36 17 14,15,17,18
16b 1.60 (d) 17 15, 17, 18
17a 2.02 (m) 24.04 16ab, 17b 15
17b 2.34 (t) 16ab, 19 18, 19, 20
18 82.85 16, 17b, 25
19 4.61 (d) 78.37 17b, 20 15, 17, 18, 20, 21
20 6.44 (s) 132.69 19 19, 21
21 6.46 (s) 137.86 22
22 150.95 21, 23
23 5.88 (d) 120.41 22-Me 21, 22, 24, 22-Me
24 168.77 22-Me,23
25a 1.87 (d) 34.17 26 18, 26
25b 1.61 (d) 26
26 1.24 (m) 29.02 25, 27, 28 25, 27
27a 1.23 (m) 22.16 26, 28 26, 28, 29, 30
27b 1.27 (m) 26, 28 26, 28, 29, 30
28a 1.24 (m) 31.2 27, 29 30
28b 1.22 (m) 27, 29, 30
29a 1.27 (m) 21.31 27, 28, 30
29b 1.23 (m) 27, 28, 30
30 0.86 (t) 13.00 29a 27, 28, 29
4-me 1.09 (dd) 13.99 4 3, 4, 5
8-me 1.76 (s) 11.61 6 7, 8, 9
12-me 0.79 (t) 16.69 12 11, 12, 13
22-me 2.27 (s) 13.27 21, 23 20, 21, 22, 23, 24
1' 171.97 2', 3'
2' 2.61 (m) 29.76 1', 3', 4'
3' 2.58 (t) 28.51 2', 3', 4'
4' 174.54 2', 3'
1-ME 2.27 (s) 51.05 2 1, 2
상기 표 6 및 도 7b에서 확인할 수 있듯이, F71의 분자량 및 분자식은 기존에 알려진 리베로마이신 E 4'-메틸에스터 (Reveromycin E 4'-methyl ester)와 동일 하였으나, 다양한 모드의 NMR 데이터를 정리한 결과 1-COOH기에 메틸기가 붙은 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (Reveromycin E 1-methyl ester)로 동정되었다. 이 물질은 처음으로 보고되는 물질이다.
실시예 6. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 에틸아세테이트 분획물의 다양한 식물병원균에 대한 인 비트로 ( in vitro )로 항균활성의 검정
6-1. 포아플레이팅 (pour-plating) 방법
항균활성 물질인 리베로마이신 E (Reveromycin E)를 포함하는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물의 21종의 식물 병원성 진균 (16종) 및 난균 (5종)에 대한 균사 생장 저해를 관찰하기 위하여 포아플레이팅 (pour-plating)방법을 이용하였다. 구체적으로, PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물을 각각 농도별로 (0 μg/ml , 1 μg/ml , 5 μg/ml) 처리한 PDA 배지를 제조하였다. 그리고 배지의 중앙에 하기 표 7와 같이 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryoshpaeria dothidea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코르토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코르토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루타나 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fugikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocerocospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라토스퍼마 (Valsa ceratosperma), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Phythium graminicola) 및 피티움 울티멈 (Phythium ultimum)으로 기재된 병원성 진균 및 난균을 접종하여 25 ℃에서 배양하여 균사의 생장 정도를 관찰하였다.
순서 종류 균주명
1 진균 아텔리아 롤프시(Athelida rolfsii)
2 진균 보트리오스패리아 도티데아(Botryoshpaeria dothidea)
3 진균 코레토트리쿰 카우다튬(Colletotrichum caudatum)
4 진균 코르토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes)
5 진균 코르토트리쿰 호리(Colletotrichum horii)
6 진균 쿠불라리아 루타나(Curvularia lunata)
7 진균 엔토치아 파라지티카(Endothia parasitica)
8 진균 푸자리움 푸지쿠로이(Fusarium fugikuroi)
9 진균 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)
10 진균 개우마노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)
11 진균 슈도서커스포라 서컴시사(Pseudocerocospora circumcissa)
12 진균 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케(Raffaelea quercus-mongolicae)
13 진균 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)
14 진균 라이족토니아 세레아리스(Rhizoctonia cerealis)
15 진균 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa)
16 진균 발사 세라토스퍼마(Valsa ceratosperma)
17 난균 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici)
18 난균 파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora)
19 난균 파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi)
20 난균 피티움 그라미니콜라(Phythium graminicola)
21 난균 피티움 울티멈(Phythium ultimum)
도 8에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물은 표 7에 기재된 식물 병원성 진균 및 난균의 균사의 생장을 저해하는 효과를 나타내었다. 특히, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 아세테이트 분획물은 5 μg/ml 처리구의 경우 모든 식물병원성 진균 및 난균의 균사 생장을 저해하였다. 이를 통하여, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물은 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
6-2. 96-웰 마이크로플레이트 방법
실시예 5와 같이 분리 동정한 항균활성 물질인 (C38H56O11) 리베로마이신 E (Reveromycin E, F61)의 식물 병원성 균의 균사 생장 최소 저해농도를 측정하였다. 우선, 0.0244 내지 3.125 μg/ml 의 농도로 표 8로 기재된 보트리오스패리아 도티데아 (Botryoshpaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botryritis cinerea), 코르토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루타나 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라파닌 (Fusarium oxysporum f.sp.raphanin), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 피티움 울티멈 (Phythium ultimum), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라토스퍼마 (Valsa ceratosperma), 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프토라 캄비보라 (Phytophthora cambivora) 및 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi)의 식물병원균 균사에 리베로마이신 E (F61)를 처리하였다.
순서 종류 균주명
1 진균 보트리오스패리아 도티데아(Botryoshpaeria dothidea)
2 진균 보트리티스 시네레아(Botryritis cinerea)
3 진균 코르토트리쿰 호리(Colletotrichum horii)
4 진균 쿠불라리아 루타나(Curvularia lunata)
5 진균 엔토치아 파라지티카(Endothia parasitica)
6 진균 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)
7 진균 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라파닌(Fusarium oxysporum f.sp.raphanin)
8 진균 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)
9 진균 개우마노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)
10 진균 마그나포르티옵시스 포에(Magnaporthiopsis poae)
11 진균 마그나포르테 오라이제(Magnapothe oryzae)
12 진균 피티움 울티멈(Phythium ultimum)
13 진균 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)
14 진균 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa)
15 진균 발사 세라토스퍼마(Valsa ceratosperma)
16 난균 파이토프토라 칵토룸(Phytophthora cactorum)
17 난균 파이토프토라 캄비보라(Phytophthora cambivora)
18 난균 파이토프토라 시나모미(Phytophthora cinnamomi)
상기 표 8에 기재된 균주의 균사를 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에서 25 ℃에서 7일간 정치 배양된 균사체를 500 μg/ml (w/v) 농도로 조정한 뒤 블렌더 (DBIHAN, HG-15D)를 이용하여 마쇄하여 균사를 준비하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰에 마쇄한 균사를 180 μL씩 분주한 다음, 리베로마이신 E (F61) 용액을 20 μL분주하여 웰의 농도를 3.125 μg/ml 의 농도로 맞추었다.그리고 3.125 μg/ml로 농도가 맞추어진 웰에서 100 μL를 취하여 다음 웰에 분주하고 다시 100 μL의 마쇄된 균사를 섞어 1.56 μg/ml의 농도로 제조하였다. 이와 같은 과정을 계속 반복하여 0.78 내지 0.0224 μg/ml의 농도로 희석하여 제조하였다. 제조한 후, 25 ℃ 24시간 후에 균사의 생장 정도를 측정하였으며, 각 처리구는 3회 반복으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
순서 종류 균주명 F61 (μg/ml)
1 진균 보트리오스패리아 도티데아 (Botryoshpaeria dothidea) 0.098
2 진균 보트리티스 시네레아 (Botryritis cinerea) 1.56
3 진균 코르토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii) 0.049
4 진균 쿠불라리아 루타나 (Curvularia lunata) 0.78
5 진균 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica) 1.56
6 진균 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum) 0.195
7 진균 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f.sp.raphani) 1.56
8 진균 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum) 1.56
9 진균 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis) 3.125
10 진균 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae) 0.0244
11 진균 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae) 0.78
12 진균 피티움 울티멈 (Phythium ultimum) 1.56
13 진균 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 1.56
14 진균 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa) 0.195
15 진균 발사 세라토스퍼마 (Valsa ceratosperma) 0.78
16 난균 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum) 0.195
17 난균 파이토프토라 캄비보라 (Phytophthora cambivora) 0.195
18 난균 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi) 0.39
상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 리베로마이신 E (F61)는 다양한 식물병원균의 균사 생장을 저해하는 강력한 항균활성을 나타내었다. 각 식물병원균에 따라서 100% 균사생장 억제농도는 다소 차이가 있었지만, 항균활성은 0.0224 내지 3.125 μg/ml 범위의 MIC 값을 나타내며 우수한 효과를 나타내었다. 특히, 난균류에 속하는 파이토프토라 칵토룸, 파이토프토라 캄비보라 및 파이토프토라 시나모미는 0.195 내지 0.39 μg/ml 범위의 MIC값을 나타내며 매우 높은 항균활성을 나타내었다.
보통 푸자리움 균종은 다른 균들에 비하여 화학물질에 내성을 보인다. 하지만 푸자리움 그라미네아룸 및 푸자리움 그라미네아름과 같은 곰팡이는 리베로마이신 E (F61)를 처리하였을 때 각각 1.56 및 0.195 μg/ml 범위의 MIC값을 나타내며 매우 높은 항균활성을 나타내었다.
실시예 7. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 용해효소 활성 검정
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 용해효소 (Lytic enzyme) 활성을 검정하기 위하여 용해효소인 프로티에이스 (Protease), 키틴네이즈 (Chitinase) 및 셀룰레이즈 (Cellulase)의 활성을 측정하였다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 용해효소 활성을 검정할 수 있는 균주들은 키틴네이즈 활성이 높은 균주가 많이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특성으로 진균에 대한 항균활성을 확인할 수 있다.
프로티에이스 활성은 1 % 스킴밀크 (Skim milk)에 한천 (Agar)을 첨가하여 배지를 만든 후 배지 표면에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 접종하였다. 접종 후 배지는 30 ℃에서 정치배양 (stationary culture)하였으며, 배양 2일 후에 프로티에이스 활성에 따른 클리어존을 관찰하였다. 키틴네이즈 활성은 1.5 % 콜로이달 키틴 (Colloidal chitin)이 첨가된 PDA (Potato Dextrose Agar)배지 표면에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 접종한 후 28 ℃에서 일주일 간 정치 배양하여 플레이트의 클리어 존을 확인하였다. 그리고 셀룰레이즈 효소 활성은 카복시메틸셀룰로우스 (Carboxylmethyl cellulose, CMC)를 유일한 탄소원으로 하는 멘델-리즈배지 (Mendel-Leeds agar)에 배양하여 측정하였다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 0.4 g/L KH2PO4, 0.02 g/L CaCl2, 0.02 g/L NaCl, 0.02 g/L FeSO47H2O, 2.5 g/L CMC, 15.0 g/L 한천이 포함된 배지에 배양하고 pH를 1 M NaOH를 이용하여 7.2로 조정하였다. 접종한 배지는 28 ℃에서 일주일간 정치 배양하여 셀룰레이즈의 분비 정도를 관찰하였다. 그리고 각각의 프로티에이스, 키티네이즈 및 셀룰레이즈의 활성도를 측정하여 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
시료 프로티에이스 활성도 키티네이즈 활성도 셀룰레이즈 활성도
JCK-6141 - + +++
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주는 키틴네이즈 활성을 가질 뿐만 아니라, 특히, 우수한 셀룰레이즈 활성을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다. 난균류의 세포벽에는 셀룰로오즈가 함유되어 있고 그 밖의 진균류에는 키틴이 세포벽 성분으로 함유되어 있어서 셀룰레이즈 및 키티네이즈의 활성의 측정을 통해 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주가 난균류와 진균류 중 어느것에 항균활성도가 높은 지 확인할 수 있다. 앞서, 실시예 6-2의 결과는 리베로마이신 E (F61)를 처리 후 식물 병원성 진균의 균사 생장 억제 활성를 측정하였을 때 균사 생장 억제가 난균류에서 특히 높게 억제되는 것으로 확인된 바 있다. 이와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액은 저분자 항균 활성물질인 리베로마이신 E (F61)뿐만 아니라, 키티네이즈 및 셀룰레이즈 활성을 가지고 있어서 다양한 식물 병원성 진균류 및 난균류에 대하여 우수한 항균활성을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 오이모잘록병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
8-1. 식물체 준비
오이의 감수성 (sensitive) 품종인 '네 박자'오이 종자 (신젠타, 대한민국)를 멸균수가 포함된 여과지 (지름 9 cm의 페트리디쉬)에서 25 ℃로 이틀간 발아시킨 후, 5일간 성장시켜 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 오이모잘록병에 대한 인 비보 (in vivo) 방제효과 평가에 사용될 식물체 (발아 5일 된 오이 유묘)를 준비하였다.
8-2. 시료 처리 및 접종
식물체에 토양 관주로 처리할 시료는 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 증류수를 이용하여 100배, 10배 희석하였고, 에틸아세테이트로 최종 농도 최종농도 0 μg/ml, 200 μg/ml로 분획하여 총 4종으로 제조하였다.
식물체에 접종할 접종원은 오이모잘록병을 유발하는 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani; 이하, Rs)으로 제조하였다. Rs 균사가 왕성하게 자라서 덮힌 한천을 잘라 100 mL의 PDB (Potato dextrose broth)를 포함하고 있는 250 mL 삼각 플라스크에 접종하였다. 그리고 플라스크를 28 ℃, 150 rpm으로 4일간 진탕배양 한 후, 배양된 균사체를 4겹의 거즈로 걸러내고 멸균수를 이용하여 세척였다. 원예용 상토 1kg 당 Rs 균사체를 0.75g씩 혼합하여 Rs 균사체 접종을 위한 토양을 제조하였다.
발아 5일 된 오이 유묘에 4종의 시료를 각각 10 ml씩 토양 관주처리 하였다. 처리 1일 이후, Rs 균사체 접종을 위한 토양을 포트당 150g씩 분지하여 오이 유묘를 접종하여 1 DBI를 제조하였다. 1 DBI는 시료를 접종 전에 미리 처리하였기 때문에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141의 오이모잘록병 예방 효과를 확인할 수 있다.
Rs 균사체 접종을 위한 토양을 포트당 150 g씩 분지하였다. 발아 5일 된 오이 유묘를 이식한 다음, 1시간 후에 4종의 시료를 각각 10 ml씩 유묘에 관주처리하여 1 HAI를 제조하였다. 1 HAI는 Rs 균사체를 혼합한 상토에 유묘를 이식한 후, 시료를 관주 처리하였기 때문에 치료 효과를 확인할 수 있다.
무처리구는 트윈 20 (농도 250 μg/ml)로 첨가된 용액을 처리한 후, 대조약제로는 잘록엔 (Janrokend) 분산성액제 (활성성분 하이멕사졸 30%, 펜티오피라드 5%, 한국삼공사, 대한민국)을 1000 배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 당 10 ml씩 토양 관주 처리하였다.
8-3. 인 비보(In vivo) 생물검정
Rs 균사체가 접종된 포트로 이식된 오이 유묘 포트는 25 ℃에서 7일간 키운 후, 오이 유묘를 수확하여 병든 식물들 수를 측정하였다. 각 처리당 3번씩 반복하였으며, 각 반복은 10개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 2회 반복하여 효능을 평가하였다. 병 방제가는 하기 계산식 1을 사용하여 계산하였고, 1 DBI 및 1 HAI의 결과를 하기 표 11 및 12에 나타내었다.
[계산식 1]
방제가 (%) =
Figure pat00003
)ⅹ100
처리구 (1 DBI) 농도 (배, μg/ml) 방제가 (%)
CB (증류수 희석) 100배 96.2 ± 8.3
10배 92.0 ± 16.6
EtOAc ext 50 μg/ml 0.0 ± 0.0
200 μg/ml 50.3 ± 57.7
Janrokend 1000배 100 ± 0.0
처리구 (1 HAI) 농도 (배, μg/ml) 방제가 (%)
CB (증류수 희석) 100배 75.0 ± 50.0
10배 100 ± 0.0
EtOAc Ext 50 μg/ml 75.0 ± 50.0
200 μg/ml 100 ± 0.0
Janrokend 1000배 100 ± 0.0
상기 표 11, 12 및 도 9a 내지 10b에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액은 Rs가 야기하는 오이모잘록병 발생을 감소시켰으며, 100배 및 10배 희석 배양액서는 시료처리 시기와 상관없이 대조약제인 잔록엔드와 비슷한 방제효과를 나타내었다. 특히, 희석배양액을 10배 희석하여 처리하였을 때, 1 HAI의 방제가가 100 %로 대조약제를 사용한 방제가와 유사한 측정치를 나타내었다. 에틸아세테이트 분획물은 농도 의존적인 방제 활성을 나타내었다. 특히, 1 HAI에서 에틸아세테이트 분획물을 50 μg/ml 및 200 μg/ml 으로 처리하였을 때, 각각 방제가가 약 75.0% 및 100%를 나타내었다. 이를 통하여, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 배양 희석액 및 에틸아세테이트 분획물은 오이모잘록병 원인균인 라이족토니아 솔라니에 대해 우수한 항진균 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 오이덩굴쪼김병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
9-1. 식물체 준비
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 오이덩굴쪼김병 (Fusarium wilt)에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 평가하였다. 8 x 8 연결포트 (15 ml/pot, 범농사, 대한민국)에 원예용 상토 5호 (부농상토사, 대한민국)를 넣고 포트당 오이 종인 중복삼척 (신젠타, 대한민국)을 1립씩 파종하여 온실에서 7일간 재배하여 방제효과 평가에 사용될 식물체로 준비하였다.
9-2. 시료 처리
푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxyspoirum f.sp. cucumerinum, Foc)를 PDA 배지에 접종하고, 25 ℃에서 7일간 배양한 균총으로부터 균사 조각을 떼어내어 브이8-주스 브로스 (V8 broth, V-8 주스 200 mL, CaCO3 3g, 증류수 1L)배지에 접종하고, 7일 동안 25 ℃의 암상태로 150 rpm에서 진탕배양 하였다. 진탕배양한 후, 병원균 배양액을 수확하여 4겹의 거즈로 걸러 균사를 제거하고 원심 분리하여 (5000 rpm, 10 분, 4 ℃) 배양여액을 제거하였으며, 포자 침전물에 멸균수를 넣고 잘 현탁한 후에 혈구 계산기 (Hemacytometer)를 이용하여 광학현미경하에서 포자 (소형분생포자)의 농도를 1.0 x 107 conidia/mL이 되도록 멸균수로 희석하여 Foc 포자현택액을 접종원으로 사용하였다.
9-3. 인 비보( in vivo ) 생물검정
최아 (pregerminated seed)된 오이 종자를 포트당 1개씩 이식한 후 25 ℃에서 오이유묘로 키운 후, 5일 뒤 3가지 방식으로 시료를 처리하였다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 증류수를 이용하여 100배, 및 10배 희석하였고, 에틸아세테이트로 최종농도 0 μg/ml , 200 μg/ml으로 분획하여 총 4종의 시료를 제조하였다.
제조한 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 시료를 발아 5일 된 오이 유묘에 10 ml씩 토양 관주 처리하였다. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 시료 의 토양 관주 처리 1일 후 처리구에 Foc 균주의 포자 현탁액 10 ml 토양 관주로 접종하여 1 DBI를 제조하였다. 또한, 발아 5일 된 오이 유묘에 Foc 균주의 포자 현탁액 10 ml 토양 관주로 접종하고, 접종 1시간 후 10 ml의 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 시료를 토양 관주 처리하여 1 HAI를 제조하였다.
무처리구는 트윈 20 (농도 250 μg/ml)로 첨가된 용액을 처리한 후, 대조약제로는 잘록엔 (Janrokend) 분산성액제 (활성성분 하이멕사졸 30%, 펜티오피라드 5%, 한국삼공사, 대한민국)을 1000 배 희석하여 처리하였다. 모든 처리구는 포트 당 10 ml씩 토양 관주 처리하였다.
접종한 오이 유묘는 25 ℃ 습실 상에서 24 시간동안 배양한 후에 25 ℃ 항온실로 옮기고 하루에 12시간 동안 광을 조사하면서 3주 동안 재배하고, 오이덩굴쪼김병 발생을 조사하였다. 각 처리당 3회씩 반복하였으며, 각 반복은 10개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 2회 반복하여 효능을 평가하였다. 병 방제가는 계산식 1을 사용하여 계산하였고, 그 결과를 하기 표 13 및 14에 나타내었다.
처리구 (1 DBI) 농도 (배, μg/ml) 방제가(%)
CB 100배 40.8 ± 13.2
10배 67.1 ± 13.2
EtOAc Ext 50 μg/ml 100.0 ± 0.0
200 μg/ml 28.6 ± 35.0
Janrokend 1000배 100.0 ± 0.0
처리구 (1 HAI) 농도 (배, μg/ml) 방제가(%)
CB 100배 19.7 ± 19.9
10배 35.5 ± 46.0
EtOAc Ext 50 μg/ml 40.8 ± 13.2
200 μg/ml 23.7 ± 27.3
Janrokend 1000배 42.1 ± 43.2
표 13, 14 및 도 11a 내지 12b에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 시료는 Foc균주가 야기하는 오이덩굴쪼김병 발생을 감소시켰으며, 시료처리 시기와 관계없이 대조약제인 잔록엔드와 비슷하거나 더 우수한 방제효과를 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물 50 μg/ml 처리하였을 때, 1 DBI는 방제가가 100%로 가장 우수한 방제가를 나타내었다. 또한, 1 DBI와 1 HAI에서 에틸아세테이트 분획물을 처리한 결과는 저농도 (50 μg/ml)에서 방제활성이 200 μg/ml 에틸아세테이트 분획물 처리시보다 높게 나타났다. 이는 리베로마이신 물질의 직접적인 항균활성과 더불어 이들 물질 또는 다른 물질들의 유도저항성 기작에 의하여 오이덩굴쪼김병이 효과적으로 방제 될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 10. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 벼 잎집무늬마름병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 벼 잎집무늬마름병 (Rice sheath blight; RSB)에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 조사하였다. 식물체로는 낙동벼 (Oryza sativa L.)를 사용하였다.
병원균 접종 하루전에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 증류수로 3배 (3-fold) 및 9배 (9-fold) 희석한 희석액 10 ml을 낙동강 벼에 토양 관주 처리하였다. 희석액을 처리한 낙동강 벼의 밀기울 (wheat bran)을 1L 배양병에 적당양 넣은 후, 멸균한 후 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 배양된 균사 덩어리를 적당히 잘게 마쇄하여 벼가 자란 포트에 고르게 접종하였다. 접종 후, 습실 상 (25 ℃)에서 3일간 배양한 후 상대습도 80 %인 항온 항습실에서 4일간 둔 뒤에 발병 여부를 조사하였다. 대조군으로는 합성 화학살균제인 플루토아닐 (Flutolanil) 20 μg/ml 및 50 μg/ml을 사용하였다. 발병 조사 시 발병도는 벼의 잎집에 발생된 병반 면적율을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
처리구 농도 (배, μg/ml) RSB 방제가 (%)
JCK-6164 배양액 (CB) 3 배 (3-fold) 35.0 ± 5.0 b
9 배 (9-fold) 15.0 ± 5.0 c
화학 살균제 (Flutolanil) 50 μg/ml 100.0 ± 0.0 a
20 μg/ml 100.0 ± 0.0 a
표 15 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 3배 희석액의 경우, 벼잎집무늬마름병에 대하여 35.0 %의 방제활성을 보였고, 배양액의 9배 희석액의 경우, 3배 희석액보다 방제가는 낮지만 15.0%의 방제활성을 나타내었다. 이를 통해, 합성 화학살균제인 플루토아닐보다는 방제 효과가 낮게 나타났지만, 35.0 %의 방제효과를 나타냄에 따라 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액이 벼 잎집무늬마름병 방제에 효과적임을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 밀 붉은녹병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 밀 붉은녹병에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 조사하였다. 식물체로는 은파밀을 사용하였다.
병원균 접종 하루전에 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 증류수로 3배 (3-fold) 및 9배 (9-fold) 희석한 희석액 10 ml을 은파밀에 토양 관주로 처리하였다. 병원균인 푸시니아 레콘디타 (puccinia recondite)는 활물기생균이므로 실험실에서 식물체에 직접 계대 배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 하포자로 포자 현탁액 (포자 0.67 g/L)을 제조한 후, 밀 유묘에 분무 접종하였고, 접종 후 유묘는 20 ℃의 습실 상에서 1일간 습실 처리한 후에 상대 습도가 70 %인 20 ℃인 항온 항습실로 옮겨서 발명을 유도하였다. 대조군으로는 합성 화학살균제인 플루토아닐 (Flutolanil) 20 μg/ml 및 50 μg/ml을 사용하였다.발병도는 접종 7일 후에 병반 면적율을 조사하였고, 그 결과를 하기 표 16에 나타내었다.
처리구 농도 (배, μg/ml) RSB 방제가 (%)
JCK-6164 배양액 (CB) 3 배 (3-fold) 80.0 ± 0.0 b
9 배 (9-fold) 13.3 ± 6.7 c
화학 살균제 (Flutolanil) 50 μg/ml 100.0 ± 0.0 a
20 μg/ml 73.3 ± 6.7 b
표 16 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 3배 희석액의 경우, 밀 붉은 녹병에 대하여 80.0% 의 방제활성을 보였고, 배양액의 9배 희석액의 경우, 3배 희석액보다 방제가는 낮지만 13.3%의 방제활성을 나타내었다. 이를 통해, 합성 화학살균제인 플루실라졸 보다는 방제효과가 낮게 나타났지만, 80.0%의 방제효과를 나타냄에 따라 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액이 밀 붉은녹병 방제에 효과적임을 확인할 수 있었다.
실시예 12. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 맥류 붉은곰팡이병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 맥류 붉은곰팡이병에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 조사하였다. 식물체로는 밀 (은파밀)의 이삭을 사용하였다.
우선, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주를 멸균한 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30 ℃에서 3일간 150 rpm으로 진탕배양하여 배양액을 제조하였다. 배양액을 증류수로 5배 및 20배로 희석한 희석액을 밀의 이삭에 분무 처리하고 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 그리고 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum)의 포자 현탁액을 접종한 후 비닐을 포트 전체에 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 양성 대조군으로서 합성 농약인 알무리 (2000배 희석, 신젠타사, 스위스)을 처리하였고, 음성 대조군으로는 트윈-20 (500 μg/ml)을 처리하였으며, 10개의 밀 이삭을 기본으로 3 반복으로 처리하였으며, 접종 2주 후 발병률을 조사하여 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다.
억제제 농도 발병도 (%) 발병율 (%) FHB 지수 (%) 대조군 (%)
알무리 (Almuri) 2000 배 17.0 75.1 12.8 86.3
JCK-6141 배양액 5 배 49.2 100.0 49.2 47.2
20 배 67.1 100.0 67.1 28.0
억제제 미사용 컨트롤 - 93.2 100.0 93.2 0.0
표 17 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액의 5배 희석액의 경우, 맥류 붉은곰팡이병에 대하여 47.2 %의 방제활성을 보였고, 배양액의 20 배 희석액의 경우 5배 희석액보다 방제가는 낮지만, 28.0%의 방제활성을 나타내었다. 이를 통해, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액은 합성 항진균 약제인 알무리 보다는 방제효과가 낮게 나타났지만, 47.2 %의 방제효과를 나타냄에 따라 맥류 붉은곰팡이병 방제에 효과적임을 확인할 수 있었다.
실시예 13. 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 잔디 동전마름병에 대한 인 비보 ( in vivo ) 방제효과 평가
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주의 잔디 동전마름병에 대한 인 비보 (in vivo)에서의 방제 효과를 조사하였다.
13-1. 식물체 준비
식물체로는 한지형 잔디인 크리핑 벤트 그라스 (Creeping bentgrass, Agrostis palustris)의 종자를 사용하였다. 지름 7 cm, 높이 6 cm인 포트에 멸균한 모래와 원예용 상토의 비율이 3:1이 되도록 배합한 후 파종하여 30일 동안 키운 뒤 실험에 사용하였다.
13-2. 시료 처리
스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액을 증류수로 3배 및 9배 희석한 후, 트윈-20 (Tween 20, 250 μg/ml)를 첨가하여 포트 당 10 ml씩 병원균 접종 1일 전 토양 관주 처리를 하였다. 무처리구는 트윈-20 (250 μg/ml) 용액을 처리하였으며, 대조약제로는 잔디 곰팡이병 예방용으로 시판되고 있는 호리쿠어 (활성성분 tebuconazole, 25중량%) 유제를 2000배 희석하여 접종 1일 전 포트 당 10ml씩 토양 관주 처리를 하였다. 병원균인 스트렐로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa)는 PDA (potato Dextrose agar) 배지에 5일간 배양한 후 균총을 가로, 세로 1 cm의 크기로 잘라 5개씩 밀기울-왕겨배지 (밀기울 36 g, 왕겨 6 g, 증류수 40 ml, 1L Erlenmeyer Flask)에 접종한 후 이를 25 ℃ 항온기에서 7일간 배양하여 접종원으로 사용하였다. 배양 후 400 ml의 멸균수 (Streptomycin sulfate 200 μg/ml 포함)을 가한 뒤 블렌더로 마쇄한 다음 포트 당 4 ml씩 토양 관주 접종하였다. 처리한 잔디를 25 ℃, 상대습도 95%에 두고 7일간 발병시킨 후 발병도 (disease severity)를 조사하여 그 결과를 표 18에 나타내었다.
처리구 농도 (배) 방제가 (%)
CB (증류수 희석액) 3배 76.3 ± 16.5
9배 51.5 ± 11.0
Horikuo 2000배 89.3 ± 5.3
표 18 및 도 16a, 16b에 나타낸 바와 같이, JCK-6141 균주 배양액의 3배 희석액의 경우, 잔디 동전마름병에 대하여 76%의 방제활성을 보였고, 배양액의 9배 희석액의 경우, 잔디 동전마름병에 대하여 76%의 방제활성을 나타내었다. 이를 통해, 합성 항진균 약제인 호리쿠어 보다는 방제효과가 다소 낮게 나타났지만, 76%의 방제효과를 나타냄에 따라, 스트렙토마이세스 에스피 JCK-6141 균주 배양액이 잔디 동전마름병 방제에 효과적임을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC14333BP 20201014
<110> University Cooperation Foundation Chonnam University <120> Composition for controlling plant disease comprising culture solution of Streptomyces sp. Strain or extract thereof, and controlling method for plant disease <130> PN200306P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JCK-6141 16S rRNA 9F forward primer <400> 1 gagtttgatc ctggctca 18 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JCK-6141 16S rRNA 1512R reverse primer <400> 2 acggctacct tgttacgact t 21 <210> 3 <211> 1338 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 3 ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg cccttcactc tgggacaagc 60 cctggaaacg gggtctaata ccggatatga gcctgggagg catctcccgg gttgtaaagc 120 tccggcggtg aaggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtgaggtaa tggctcacca 180 aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc 240 ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca 300 gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag 360 cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 420 tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt 480 cacgtcgatt gtgaaagccc gaggcttaac ctcgggtctg cagtcgatac gggctagcta 540 gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag 600 gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg 660 gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg aactaggtgt 720 tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt 780 acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg 840 tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatacac cggaaagcat 900 tagagatagt gccccccttg tggtcggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 960 gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca 1020 tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg 1080 ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg 1140 gtacaatgag ctgcgatacc gtgaggtgga gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg 1200 attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt 1260 gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt 1320 aacacccgaa gccggtgg 1338

Claims (16)

  1. 항균 활성을 갖는 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주.
  2. 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 식물병은 진균류 및 난균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 원인균으로 하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 진균류는 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryosphaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코레토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루나타 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포롬 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocercospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라포스퍼마 (Valsa cerasperma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 진균류는 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)인 것인, 식물병 방제용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 난균류는 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 균주의 배양액의 추출물은 리베로마이신 E (reveromycin E), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (reveromycin E 1-methyl ester) 및 및 리베로마이신 E 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
  8. 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 배양 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물병은 진균류 및 난균류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 원인균으로 하는 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 진균류는 아텔리아 롤프시 (Athelida rolfsii), 보트리오스패리아 도티데아 (Botryosphaeria dothidea), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 카우다튬 (Colletotrichum caudatum), 코레토트리쿰 코코데스 (Colletotrichum cocodes), 코레토트리쿰 호리 (Colletotrichum horii), 쿠불라리아 루나타 (Curvularia lunata), 엔토치아 파라지티카 (Endothia parasitica), 푸자리움 푸지쿠로이 (Fusarium fujikuroi), 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포롬 에프. 에스피. 라파니 (Fusarium oxysporum f. sp. raphani), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 라이코퍼시시 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum), 개우마노마이세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis), 마그나포르티옵시스 포에 (Magnaporthiopsis poae), 마그나포르테 오라이제 (Magnapothe oryzae), 슈도서커스포라 서컴시사 (Pseudocercospora circumcissa), 라파엘라 퀘어쿠스-몽골리케 (Raffaelea quercus-mongolicae), 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 라이족토니아 세레아리스 (Rhizoctonia cerealis), 스크레로티니아 호모에오카파 (Sclerotinia homoeocarpa), 발사 세라포스퍼마 (Valsa cerasperma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 진균류는 푹시니아 레콘디타 (Puccinia recondita)인 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 난균류는 파이토프토라 칵토룸 (Phytophthora cactorum), 파이토프라 캄비보라 (Phytophthora cambivora), 파이토프토라 캡시시 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 시나모미 (Phytophthora cinnamomi), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 울티멈 (Pythium ultimum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 배양 단계는 다음과 같은 분획 단계를 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조 방법:
    배양액으로부터 제1 활성분획을 획득하는 제1 분획 단계;
    상기 제1 활성분획을 컬럼크로마토그래피 (Column Chromatography) 및 얇은층 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)를 이용하여 제2 활성분획을 획득하는 제2 분획 단계;
    상기 제2 활성분획을 분취용 고성능 액체 크로마토그래피 (High Pressure Liquid Chromatography)를 이용하여 제3 활성분획을 획득하는 제3 분획 단계;
    상기 제3 활성분획을 분취용 얇은층 크로마토그래피를 이용하여 제4 활성분획을 분리하는 제4 분획 단계; 및
    상기 제4 활성분획을 고성능 액체 크로마토그래피로 동정하는 순수물질 동정 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 순수물질은 리베로마이신 E (Reveromycin E), 리베로마이신 E 1-메틸 에스터 (Reveromycin E 1-methyl ester) 및 리베로마이신 E 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물병 방제용 조성물의 제조방법.
  15. 기탁번호 KCTC 14333BP로 기탁된 스트렙토마이세스 에스피(Streptomyces sp.) JCK-6141 균주의 배양액 또는 균주의 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 식물체에 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물 처리 단계는 토양관주, 토양관수, 엽면분무, 수간주사, 경엽 처리, 근권 처리 및 종자 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것인, 식물병 방제 방법.
KR1020210153374A 2020-11-16 2021-11-09 스트렙토마이세스 에스피 jck-6141 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 이의 제조 방법 및 식물병 방제 방법 KR20220066845A (ko)

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