KR20180035433A - 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카 el 000614 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카 EL 000614 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 선충 방제용 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주는 대한민국 지리산 암석과 나무에서 자생하는 지의류(송라과 Usnea sp.)에서 분리한 균주이다. 자연에서 채취하여 환경오염에 대한 우려가 낮으며, 뿌리혹선충(M. incognita)에 대해 높은 살선충활성 및 알 부화 억제활성을 나타내어, 본 발명의 균주는 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카 EL 000614 균주 및 이의 용도{Xylaria grammica EL 000614 strain having nematocidal activity against root knot nematode and uses thereof}
본 발명은 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카 EL 000614 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 뿌리에 침투하여 영양분을 빼앗는 식물기생선충은 작물에 해로운 병원체로 알려져 있다. 대표적인 40개 작물의 선충감염으로 인한 생산량 손실은 전체 작물 생산량의 10% 감소에 해당하며, 피해금액은 매해 늘고 있는 추세이다. 전 세계적으로 작물에 피해를 주는 식물기생선충류는 대표적으로 뿌리혹선충(Root-knot nematode)이 있다. 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 약 2,000 여종의 식물에 감염하는 넓은 기주범위를 갖고 있으며, 식물 뿌리 내에서 기생하면서 식물체에서 영양분을 탈취하여 생활사를 완성시킨다. 시설재배지의 증가와 함께, 뿌리혹선충의 수도 급격히 증가했으며, 이에 따른 작물 피해 또한 급증하였다. 농업에서 중요한 선충은 4종으로 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica) 및 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 등이 있으며, 그 중 특히 국내 시설재배지에서 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita)가 문제가 되고 있다.
한편 선충 감염에 따른 작물의 피해를 줄이거나 방제하기 위한 전통적인 방법으로 토양 훈증, 토양 과습화, 온실내 인위적 온도 상승, 윤작 등이 있으나, 이러한 방법들은 식물체에 영향을 주며, 선충을 완전히 방제할 수 없어 좋은 방법이라 할 수 없다. 그 외 화학농약을 이용한 방법이 개발되어 왔으나, 인체 및 환경 유해로 인한 문제점을 갖고 있다. 이를 대신하기 위하여 현재 수많은 연구가 진행되고 있는 실정이다. 대표적인 선충 방제를 위한 연구들로는 크게 다음과 같다: 1) 식물유래 저항성 유전자를 이용한 선충 방제 연구, 2) 선충에 독성을 나타내는 단백질 및 펩타이드를 이용한 연구, 3) 천연물이나 식물대사산물을 이용한 선충 방제 연구, 4) 선충 기피 물질 및 식물을 이용한 연구, 5) 친환경적 방제 방법, 6) 선충의 유전정보 및 단백질 정보를 이용한 선충방제 연구 등이 있다. 따라서 다양한 미생물 배양액에 대해 살선충활성 스크리닝을 통해 활성을 갖는 균주를 선발하고 이를 이용하여 식물기생선충병을 방제하는 균주를 개발하는 연구가 계속 진행 중이다.
한편, 한국등록특허 제0574348호에서는 '그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 AH001 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0116562호에서는 '바실러스 벨레젠시스 G341 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법'이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 뿌리혹선충에 대한 살선충활성을 갖는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 친환경적으로 식물기생선충을 방제하는 방법을 연구하기 위해 다양한 미생물을 이용하여 뿌리혹선충에 대한 살선충활성을 갖는 균주를 스크리닝하였다. 그 결과, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양여액이 강력한 살선충활성을 보인다는 사실을 발견하였다. 또한, 4종의 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 중, 특히 EL 000614 균주의 살선충활성이 가장 우수하였다.
따라서, 본 발명은 우리나라뿐만 아니라 해외의 다양한 자연환경으로부터 분리한 다양한 미생물을 대상으로 뿌리혹선충병의 주 원인인 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)과 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla)에 대하여 살선충활성을 조사한 후 우수한 살선충활성을 보이는 미생물을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 선충 방제용 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주는 대한민국 지리산 암석과 나무에서 자생하는 지의류(송라과 Usnea sp.)에서 분리한 균주이다. 자연에서 채취하여 환경오염에 대한 우려가 낮으며, 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대해 높은 살선충활성 및 알 부화 억제활성을 나타내며, 또한 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 대해 높은 살선충활성을 나타내어 본 발명의 균주는 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 PDA 배지에 7일간 배양 후, 육안으로 관찰한 결과이다.
도 2는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 감자덱스트로스액체배지에서 14일간 정치 배양한 후, 획득한 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 3은 자일라리아 그람미카( Xylaria grammica) EL 000614 균주를 감자덱스트로스액체배지에서 14일간 정치 배양한 후, 획득한 배양여액의 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 4는 자일라리아(Xylaria) 속 4개의 균주 ITS의 염기서열의 분석을 통해 계통발생분석을 실시한 결과, 4개 균주 모두 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 종으로 분류됨을 나타낸 계통도이다.
도 5는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 4종 균주를 감자덱스트로스 액체배지에서 7일, 10일, 14일 및 21일 배양 후, 획득한 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita)의 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다. A, 7일; B, 10일; C, 14일; D, 21일.
도 6은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 감자덱스트로스액체배지에서 14일간 정치 배양한 후, 획득한 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 알 부화 억제활성을 나타낸 것이다.
도 7은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 감자덱스트로스액체배지에서 14일간 진탕배양 및 정치배양 후, 획득한 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita)의 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 제공한다.
본 발명에서는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주 배양여액이 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대해 살선충활성 및 알 부화 억제 효과가 가장 높은 점을 확인하였다. 상기 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주는 한국생명공학연구원에 2016년 9월 28일자로 기탁하였다.(기탁번호: KCTC 13121BP)
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 뿌리혹선충은 멜로이도기네 속(Meloidogyne sp.) 균주일 수 있고, 바람직하게는 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 또는 멜로이도기네 하플라(Meloidogyne hapla)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 미생물제제는 액상수화제(SC), 액상현탁제(SM), 흡착식입제(흡착식 GR), 조립식입제(조립식 GR) 또는 분말수화제(WP)일 수 있고, 가장 바람직하게는 분말수화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물제제는 본 발명의 균주를 배양하여 제조된 배양액을 포함하는 것으로서 항균 미생물농약, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제에서, 상기 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주 또는 이의 배양액을 액상 및 분말화의 형태로서 당 업계에서 사용되는 공지의 방법에 의해 다양하게 변형하여 사용이 가능하나, 바람직하게 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주의 배양액 또는 농축액을 전분, 조단백질 또는 암석분과 같은 담체에 흡착 건조시키는 것이 좋다. 본 발명의 균주의 배양액 또는 농축액과 혼합하여 사용될 수 있는 담체는 당 업계에서 사용되는 어떠한 담체도 될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 담체로서 사용될 수 있는 것들에는 쌀, 밀, 옥수수, 보리, 콩, 조, 수수, 기장, 메밀 등 곡류, 감자 등의 괴경류, 고구마, 카사바 등의 괴근류, 또는 이들의 가공물(예컨대, 분말), 이들로부터 유래된 전분과 그 유도체 등이 포함된다. 그밖에 한천, 젤라틴, 팩테이트(폴리갈락투로닌산염), 키토산, 카복시메틸 셀룰로즈 및 그의 유도체, 겔라이트, 천연왁스, 천연 검, 카올린, 벤토나이트 등의 점토 광물, 또는 지오라이트 등과 같은 규조토 물질이 사용될 수 있다. 이러한 각종 담체들은 개별적으로 사용될 수 있으며, 혹은 2 이상의 담체들을 적당비율로 혼합하여 개선된 물성의 담체를 얻을 수도 있다. 상기와 같은 담체들을 사용할 경우 미생물에 의하여 대사되어 영양원이 될 수 있고, 이들 담체들은 점성이 매우 높아 식물의 표면에 대한 점착성이 증가되어 좋다.
본 발명은 균주 또는 균주 배양액을 건조법으로 얻어진 건조 산물 및 이를 포함하는 생물농약도 포함할 수 있다. 상기 건조 산물은 수화제(WP), 고상제(GM), 입상수화제(WG), 입제(GR), 분제(DP) 및 종자처리수화제(WS)로 이루어진 군에서 선택된 제형으로 생물 농약을 제조할 수 있다. 이러한 생물농약 제제는 기존 액상 제형에 비해 안정성 및 이화학성이 우수하며, 식물병 방제 처리로 사용할 수 있다.
생물 농약에서 수화제는 분상으로서 물에 희석하였을 때 수화되는 농약의 제형을, 고상제는 미생물 배양액을 고상의 물질에 혼합하거나 흡착시킨 제제로 분제, 입제 및 수화제에 해당되지 않는 제형을 의미한다. 또한, 입상 수화제는 과립상으로서 물에 희석하여 사용되는 농약의 제형을, 상기 입제는 입상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 상기 분제는 분상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 종자처리수화제는 분상으로서 종자에 처리하기 전에 수화시켜 현탁액으로 사용되는 농약의 제형을 의미한다.
본 발명의 미생물제제를 이용하여 뿌리혹선충을 방제하기 위해서는 미생물제제를 물을 이용하여 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 살포할 수 있다. 본 발명의 제제를 물에 희석하는 경우 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 103 내지 105 cfu/ml, 바람직하게는 104 cfu/ml 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)을 방제하는 방법으로는 본 발명의 균주를 배양한 배양액 또는 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 상기 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주의 배양 방법 및 미생물 제제의 제조 방법은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 균주의 배양은 MEB(Malt extract broth) 배지, PDB(Potato dextrose broth) 배지, CDB(Czapek Dox broth) 배지 또는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 상기 균주를 배양한 후 96-웰 마이크로플레이트 생물검정법을 이용하여 토마토뿌리혹선충 유충 현탁액에 10% 농도로 배양액을 처리하여 3일 후 살선충활성을 조사한 결과, PDB 배지에서 94%의 방제활성을 보여 가장 높은 살선충활성을 보였으며, 따라서 PDB를 최적 배지로 선정하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 자일라리아 그람미카 ( Xylaria grammica ) EL 000614 균주의 배양
1) PDA 배지를 이용한 정치배양
대한민국 지리산의 암석과 나무에서 분리한 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 1종, 대만 대설산 지의류에서 분리한 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000590, EL 000603 및 EL 000682 균주 등 3종을 순천대학교 한국지의류생물자원소재은행(Korean Lichen and Allied Bioresources Center)으로부터 분양받았다. 분양받은 균주를 감자덱스트로아가(PDA) 배지에 25℃ 조건에 7일 동안 정치배양하였다. PDA 배지에서 배양된 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주는 흰색의 균사를 가지며, 시간이 지남에 따라, 검은색으로 변하였고, 배지 뒷면의 색은 주황색으로 변하였다. 균주는 생장하면 할수록 배지의 표면에 완전히 달라붙어 생장하는 모습을 보였다(도 1).
2) PDB 배지를 이용한 진탕배양
왕성하게 자라고 있는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주의 균사 가장자리를 메스를 이용해 약 0.5 mm 크기로 잘랐다. 자른 균사를 10 조각을 떼어내, 감자덱스트로스액체배지(PDB) 배지(500 ml 삼각플라스크, 100 ml PDB 배지)에 접종한 후 25℃, 150 rpm 조건에서 14일간 진탕 배양하였다. 시간이 지남에 따라, 균사체는 지속적으로 늘어났으며, 배지의 색은 흰색으로 변하였다. 14일 후, 4겹 거즈를 이용해 균체를 제거한 후 배양여액만 획득하였다. 획득한 자일라리아 속 균주 EL 000614 배양여액은 추후 살선충활성 검정을 위해 4℃ 냉장고에 보관하였다.
실시예 2. 자일라리아 ( Xylaria ) 속 EL 000614 균주배양여액의 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충활성 조사
획득한 자일라리아(Xylaria) 속 EL 000614 균주 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita)과 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 대한 살선충활성 검정은 다음과 같이 수행하였다.
고구마뿌리혹선충(M. incognita)은 광주광역시 전남대학교 친환경농업센터 온실에서 인위적으로 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 감염된 토마토 뿌리로부터 알을 획득하였다. 구체적으로, 식물의 뿌리를 수돗물로 씻어내 이물질을 제거하였다. 뿌리를 1 cm 크기로 잘라 0.5% 차아염소산나트륨( sodium hypochlorite) 용액을 넣은 후 1분 동안 분쇄하였다. 분쇄 후 45μm 체와 25μm 체를 이중으로 끼운 체를 사용하여 알을 분리하였으며 분리된 알은 깔대기법(Baermann funnel)을 이용하여 부화된 유충을 분리하여 실험에 사용하였다(Hwang et al. Kor J Hort Sci Technol. 2014; 32: 217-226).
당근뿌리혹선충(M. hapla)은 전라북도 진안에서 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 감염된 인삼으로부터 알을 획득하였다. 이를 4주 동안 생육한 토마토뿌리에 접종하고, 감염시켜 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 감염된 토마토 뿌리로부터 위와 같은 방법으로 당근뿌리혹선충(M. hapla) 알을 획득하였다. 분리한 알은 깔대기법(Baermann funnel)을 이용하여 부화된 유충을 분리하여 실험에 사용하였다(Hwang et al. Kor J Hort Sci Technol. 2014; 32: 217-226).
뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충활성을 조사하기 위해 2령 유충 현탁액을 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 각각 넣은 다음 배양여액을 0.08% - 20% 농도가 되도록 처리하여 웰의 최종 부피가 100 ㎕ 되도록 하였다. 시료 처리 후 96-웰 플레이트를 30초간 교반한 후 상대습도 100% 플라스틱 통에 넣어 실온 보관하였다. 시료 처리 72시간 후 광학 도립현미경하에서 아래와 같은 식을 이용하여 살선충율을 조사하였다. 살선충율은 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 유연한 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 아래와 같은 식을 이용하여 살선충율을 조사하였다(Abbott, 1925. J Am Mosq Comtrol Assoc. 1987; 3:302-303. PMID:3333059). 모든 실험은 3 반복하였다.
살선충율(%) = [(처리구의 치사율-대조구의 치사율)/(100-대조구의 치사율)] × 100
그 결과, 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 살선충활성은 도 2와 같이 농도 의존적인 모습을 보였다. 20%, 10% 배양여액 처리구에서는 95%이상의 살선충활성을 보였으며, 5%에서는 85.4%, 2.5%에서는 62.7%, 1.25%에서는 55.2%, 0.65%에서는 38.8%의 농도의존적인 살선충활성을 보였다.
당근뿌리혹선충(M. hapla)에 대한 살선충활성 또한 도 3에 표기한 것과 같이 20%에서는 98.8%의 살선충활성을 보였으며, 10%에서는 89.8%, 5%에서는 77.6%, 2.5%에서는 59.8%, 1.25에서는 53.2%, 0.65에서는 49.5%의 살선충활성을 보였다.
따라서, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 배양여액은 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 뿐만 아니라, 당근뿌리혹선충(M. hapla)에 대해서도 살선충활성이 매우 높은 것으로 나타났다.
실시예 3. 자일라리아 ( Xylaria ) 속 4개 균주의 분자생물학적 동정 및 계통발생분석
자일라리아(Xylaria) 속 4 개의 균주 EL 000590, L 000603, EL 000614 및 EL 000682를 종(species) 수준으로 동정하기 위하여 분자생물학적 동정 및 계통발생학적 분석을 실시하였다. 4 개의 균주를 PDA 배지에서 정치배양한 후, 각 균주의 균체를 회수하여 MACHEREY-NAGEL GMbH & CO. KG의 NucleoSpin Plant II kit를 이용해서 프로토콜에 따라서 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 균주의 추출된 gDNA와 iNtRON Biotechnology의 PCR-프리믹스(Polymerase chain reaction-premix), 그리고 균주의 ITSTS(internal transcribed space) 부위를 증폭할 수 있는 하기 표 1에 개시된 프라이머 세트, 3차 증류수를 혼합하여 PCR을 통해 4 개의 균주의 ITS 부위를 증폭하였다. PCR은 95℃ 5분을 시작으로 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분을 30번 반복한 후, 72℃ 7분, 12℃에서 증폭을 끝냈다. 증폭된 PCR 산물은 제노텍(대전, 대한민국)에 염기서열 분석을 의뢰하여 EL 000590 균주 ITS(서열번호 1), EL 000603 균주 ITS(서열번호 2), EL 000614 균주 ITS(서열번호 3) 및 EL 000682 균주 ITS(서열번호 4) 염기서열을 얻었다. 4개 균주의 ITS 염기서열은 NCBI의 BlastN 검색을 이용하여 GenBank 데이터베이스의 염기서열과 비교하였다(표 2). 또한 자일라리아(Xylaria) 속 균주의 ITS 염기서열에 기초하여 BioEdit Sequence Alignment Editor로 염기서열을 정렬하고, Mega 프로그램 버젼 6.0을 사용하여 boot-strap trials set 1,000 조건에서 neighbour-joining(NJ) 알고리즘을 바탕으로 계통발생분석을 실시하였다.
그 결과, 4 개의 균주는 모두 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 종으로 동정되었으며, 본 발명에서 수득된 균주 중에서 EL 000614 균주를 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614로 명명하고(도 4), 2016년 09월 28일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 KCTC 13121BP라는 기탁번호를 부여받았다.
본 발명에 사용된 프라이머
염기서열 분석을 수행한 유전자 프라이머 이름 서열번호 염기서열
ITS ITS1F 5 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'
ITS4 6 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'
자일라리아(Xylaria) 속 4 개 균주 ITS 염기서열의 NCBI BlastN 분석 결과
염기서열 분석을 수행한 유전자 균주 번호 NCBI BlastN 분석을 통한 동정결과
(Genbank accession no.)		 유사성 (%)
ITS EL 000590 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) (AB524025) 99
EL 000603 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)(JQ341088) 99
EL 000614 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) (AB524025) 99
EL 000682 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)(JQ341088) 99
실시예 4. 자일라리아 그람미카 ( Xylaria grammica ) EL 000614 균주의 배양기간에 따른 배양여액의 고구마뿌리혹선충( M. incognita )에 대한 살선충활성 검정 및 최적 균주 선발
4종의 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주들의 배양시간에 따른 살선충활성을 조사하기 위해, 위에서 설명한 조건으로 7일, 10일, 14일 및 21일 동안 배양하였으며, 배양액을 네겹 거즈로 여과한 후 배양여액을 획득하였다. 실시예 2와 같은 방법으로 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대하여 살선충활성을 검정하였으며, 모든 실험은 3 반복을 수행하였다.
그 결과, 도 5에서와 같이, 배양 7일 후 4 균주 중 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614의 경우 10% 처리구에서 88.1, 5% 처리구에서 58.6%, 2.5% 처리구에서 31.9%의 가장 높은 살선충활성을 나타내었다. 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000603 균주의 경우 10% 처리구에서 65.5%, 5% 처리구에서 50.5%, 2.5% 처리구에서 14.1%의 살선충활성을 나타내었으며, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000590과 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000682는 전혀 활성을 나타내지 않았다. 배양 10일 후에도 7일 후와 거의 비슷한 결과를 보여, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614의 살선충활성이 가장 우수하였으며, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000590과 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000682는 살선충활성을 나타내지 않았다. 배양 14일 후와 21일 후에는 모든 균주에서 살선충활성이 관찰되었으나, 가장 짧은 기간에 우수한 살선충활성을 보인 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주가 최적 균주로 선발되었다.
실시예 5. 자일라리아 그람미카 ( Xylaria grammica ) EL 000614 균주 배양여액 의 고구마뿌리혹선충 ( M. incognita ) 알 부화 억제활성
선발한 균주 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주 배양여액의 고구마뿌리혹선충에 대한 알 부화 억제 활성을 조사하였다. 처리농도는 배양여액 최저 0.8%부터 최고 20% 수준으로 하였다. 무처리구로는 균주를 배양하지 않은 PDB를 사용하였으며, 대조구로는 아바멕틴(abamectin) 0.5 μg/ml 및 1 μg/ml을 사용하였다. 실험은 3 반복을 수행하였으며, 14일 후 알 부화 억제율을 조사하였다. 알 부화 억제율은 다음과 같은 식으로 산출하였다.
알 부화 억제율(%) = [(C-T)/C] × 100,
C= 대조구의 알부화율*, T= 처리구의 알 부화율
*알 부화율(%) = 유충의 수/[알의 수 + 유충의 수] × 100
그 결과, 도 6에 나타낸 것처럼, 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 알 부화 억제율은 배양여액의 처리 농도가 높아짐에 따라 알 부화 억제활성이 증가하는 것으로 나타났다. 배양여액 20% 처리구에서 92.1% 알 부화 억제활성을, 10%에서는 89.5%, 5%에서는 76.3%, 2.5%에서는 72.5%, 1.25%에서는 64.8% 0.62%에서는 42.6%, 0.32%에서는 14.8%의 알 부화 억제활성을 보였다. 선발한 균주 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주의 배양여액은 고구마뿌리혹선충(M. incognita)의 2령 유충뿐만 아니라, 알에서 또한 부화 억제활성이 높은 것으로 나타났다.
실시예 6. 선발한 균주 자일라리아 그람미카 ( Xylaria grammica ) EL 000614 균주의 배양방법에 따른 살선충활성 검정
선발한 균주 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주의 살선충활성을 높이기 위하여 배양조건을 기존의 진탕배양에서 정치배양으로 바꾸어 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 배양하였다. 균주를 위한 정치배양의 경우 PDB 배지에서 25℃ 조건으로 14일 동안 정치 배양하였으며, 진탕배양은 PDB 배지에서 25℃, 150 rpm 조건하에 14일 동안 진탕 배양하였다.
그 결과, 도 7에서 나타낸 것처럼, 진탕배양 후, 획득한 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주 배양여액의 살선충활성보다, 정치배양 후, 획득한 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 EL 000614 배양여액의 살선충활성능이 더 높았다.
더 상세하게는, 진탕배양 후, 획득한 배양여액의 살선충활성은 20% 처리구에서 95.2%, 10%에서는 89.8%, 5%에서는 68.8%, 2.5%에서는 40.3%이였다. 그러나 정치배양 후 획득한 배양여액의 살선충활성은 20% 처리구에서 95.2%, 10%에서는 90.0, 5%에서는 72.3%, 2.5%에서는 52.9%를 보임으로써, 배양여액 5%와, 2.5%의 처리구에서 약 10% 살선충활성의 차이를 보였다.
한국생명공학연구원 KCTC13121BP 20160928
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY National Institute of Biological Resources <120> Xylaria grammica EL 000614 strain having nematocidal activity against root knot nematode and uses thereof <130> PN16368 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> Xylaria grammica EL 000590 ITS region sequence <400> 1 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt aaagagttat tacaactccc 60 aaacccatgt gaacttacct tctgttgcct cggcaggtcg cgacctaccc tgtgaggccc 120 taccctgtag ggccctacct ggtagtcgcg ggttacgcct gccggtggcc catgaaactc 180 tgtttattct tgttattctg aatctataac taaataagtt aaaactttca acaacggatc 240 tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 300 attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc attagtattc tagtgggcat 360 gcctgttcga gcgtcatttc aacccttaag cccctgttgc ttagcgttgg gagcctacag 420 ccttctgtag ctccccaaag ttagtggcgg agtcggttta cactctagac gtagtaaatt 480 ttatctcgtc tgcagttagg ccggtccctc gccgtaaaac cccccaattt ttaaaggttg 540 acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tc 582 <210> 2 <211> 581 <212> DNA <213> Xylaria grammica EL 000603 ITS region sequence <400> 2 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt aaagagttat tacaactccc 60 aaacccatgt gaacttacct tctgttgcct cggcaggtcg cgacctaccc tgtgaggccc 120 taccctgtag ggccctacct ggtagtcgcg ggtacgcctg ccggtggccc atgaaactct 180 gtttattctt gttattctga atctataact aaataagtta aaactttcaa caacggatct 240 cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 300 ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgccca ttagtattct agtgggcatg 360 cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc ctctgttgct tagcgttggg agcctacagc 420 cttctgtagc tccccaaagt tagtggcgga gtcggtttac actctagacg tagtaaattt 480 tatctcgtct gcagttaggc cggtccctcg ccgtaaaacc ccctaatttt taaaggttga 540 cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat c 581 <210> 3 <211> 581 <212> DNA <213> Xylaria grammica EL 000614 ITS region sequence <400> 3 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt aaagagttat tacaactccc 60 aaacccatgt gaacttacct tctgttgcct cggcaggtcg cgacctaccc tgtgaggccc 120 taccctgtag ggccctacct ggtagtcgcg ggtacgcctg ccggtggccc atgaaactct 180 gtttattctt gttattctga atctataact aaataagtta aaactttcaa caacggatct 240 cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 300 ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgccca ttagtattct agtgggcatg 360 cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc ctctgttgct tagcgttggg agcctacagc 420 cttctgtagc tccccaaagt tagtggcgga gtcggtttac actctagacg tagtaaattt 480 tatctcgtct gcagttaggc cggtccctcg ccgtaaaacc ccccaatttt taaaggttga 540 cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat c 581 <210> 4 <211> 582 <212> DNA <213> Xylaria grammica EL 000682 ITS region sequence <400> 4 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt aaagagttat tacaactccc 60 aaacccatgt gaacttacct tctgttgcct cggcaggtcg cgacctaccc tgtgaggccc 120 taccctgtag ggccctacct ggtagtcgcg ggttacgcct gccggtggcc catgaaactc 180 tgtttattct tgttattctg aatctataac taaataagtt aaaactttca acaacggatc 240 tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 300 attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc attagtattc tagtgggcat 360 gcctgttcga gcgtcatttc aacccttaag cccctgttgc ttagcgttgg gagcctacag 420 ccttctgtag ctccccaaag ttagtggcgg agtcggttta cactctagac gtagtaaatt 480 ttatctcgtc tgcagttagg ccggtccctc gccgtaaaac cccccaattt ttaaaggttg 540 acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tc 582 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (6)

  1. 뿌리혹선충에 대해 살선충활성을 가지는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주는 기탁번호가 KCTC 13121BP인 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 멜로이도기네 속(Meloidogyne sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 뿌리혹선충은 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita) 또는 멜로이도기네 하플라(Meloidogyne hapla)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주, 포자, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제.
  6. 제5항의 뿌리혹선충에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 뿌리혹선충을 방제하는 방법.
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