KR20110087918A - 로즈마리 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 살충제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 살충제에 관한 것으로, 상기 살충제는 해충, 구체적으로는 배추좀나방의 유충의 살충에 사용될 수 있다.

Description

로즈마리 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 살충제{An insecticide comprising rosemary extracts or a compound isolated therefrom}

본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 살충제 및 그를 이용하여 해충을 살충하는 방법에 관한 것이다.

농작물과 산림보호 차원에서 해충에 대한 살충제의 살포는 증가하는 추세이다. 초기에는 살충제로서 1939년 스위스에서 DDT가 발명되었고, 이어서 영국에서는 BHC가 제조되었다. DDT는 미국에서 처음 살충제로 실용화된 후, 싼 가격에 대량생산할 수 있고 특히 티푸스나 말라리아를 퇴치하는 데 효과적이었기 때문에 1940년대부터는 살충제로 널리 사용되었다. 그러나 1957년부터 DDT의 유해성에 대한 의문이 제기되기 시작하였고, 1962년에 유해성이 확인되었으며, 특히 조류에 대한 유해성이 지적되면서 결국 1970년대에 대부분의 국가에서 DDT를 농약으로 사용하는 것을 금지하였다. DDT의 반감기는 2년에서 15년으로 잘 분해되지 않으며 체내의 지방 성분에 주로 쌓이고, 땅이나 물에 남아 있던 DDT는 식물에 흡수된 후 인간에게까지 영향을 미친다. 1970년대 미국에서 실시한 연구에 의하면 인간의 몸에서도 DDT가 검출되었으며 이물질이 밝혀졌다. 인간과 같은 생물에 있어서 피부로 접촉할 경우에는 특별한 문제를 일으키지 않지만 음식을 통해 섭취할 경우에는 암이 유발될 수 있다는 경고 때문에 현재는 대부분의 나라에서 농약으로 사용하는 것은 금지되었다.

BHC의 경우, 그 원료가 염소 또는 벤젠 등인데, 원료가 풍부하고 값이 저렴하고 살충력이 강하며, 인축에는 해가 적기 때문에 전 세계의 관심을 끌어 미국에서 드린제를 개발하는 등, 잇따라 합성되면서 관심을 끌었다. 그러나 BHC 또한 인축에 대한 급성 독성은 없으나 잔류효과가 길기 때문에 사용량의 증가와 함께 최근에는 환경 오염 문제가 대두되어 서양 각국과 오스트레일리아 등 여러 나라에서는 엄격하게 농약사용을 제한하고 있다.

이와 같이 그동안 해충을 방제하기 위하여 유기 화학적 합성 살충제가 널리 사용되고 있으나 수십년에 걸친 연용과 남용으로 인하여, 해충군의 이상격발 또는 저항성 해충의 출현, 인간을 비롯한 비목적충에 대한 독성발현 및 환경 계의 오염 등의 많은 부작용을 야기하고 있다. 전 세계적으로 농약의 잔류 독성과 환경오염으로 인하여 여러 가지 문제점이 나타나자 더 이상 방치하지 않고 전 세계 국가는 인류의 건강을 지키기 위하여 우선 독성이 강한 유기합성 농약의 사용을 자제하기로 국제적으로 합의하였다. 국제적인 협의 중에서 특히 인축에 영향을 많이 미치는 유기 합성된 농약의 생산과 사용을 점차 제한하자고 합의하였으며, 국제적인 협약에 의하여 전 세계는 2004년에 지난 10년 전에 사용하던 화학합성 유기인계, 유기염소계 살충제의 50%까지 생산이 감축되었고, 2010년까지 다시 유기인계, 유기염소계 살충제의 생산을 50% 감소시키기로 한 국제적 협의에 동의하여 실행단계에 있다. 그러나 독성농약 감축생산 협의 이후, 현재 전 세계적으로 많은 연구진이 환경 친화적 살충제를 개발하려고 많은 노력을 했음에도 불구하고, 이제까지 사용하였던 유기인계, 유기염소계 농약을 대체할 새로운 기작의 안전한 살충제를 개발하지 못하였기 때문에 전 세계적인 농약감축회의 의결내용이 지켜지기 어려운 상황이며, 조만간에 안전한 살충제가 개발되어 생산되지 않으면 해충방제용 살충제뿐만 아니라 식량생산에 관련된 농업용 살충제의 부족으로 국내외적으로 아주 큰 문제가 대두될 것으로 예상된다.

최근 전 세계의 농약관련 시장동향을 분석해 보면 2004년 통계에 의하면 전세계 농약시장은 280억$이고, 그 중에서 제초제가 46.6%, 살충제 27.7%, 살균제 20.8% 및 기타농약이 4.9% 차지하고 있다. 그리고 2006년 통계에 의하면 국내의 농약시장은 총 1조 600억원이고, 제초제가 23.9%이고, 살충제 37.0%, 살균제 35.5%로 높은 편이며 기타농약이 3.6%를 점유하고 있다. 국내 농약 중에서 살충제시장의 총 규모는 3760억원 시장이며 매년 점차적으로 증가 추세에 있다. 그동안 우수한 유기합성 살충제의 실용화로 식물성 살충제의 사용량이 한동안 감소하였으나 최근에 독성, 환경오염 등과 같은 심각한 사회문제가 부각됨에 따라 식물성 살충제의 사용에 관심을 갖게 되었고 친환경적인 살충제를 개발하기 위한 연구 및 개발이 증가하고 있다.

현재 사용되는 살충제들은 기계유화제를 사용하여 충체 표면을 덮어 질식사시키는 물리적 치사작용을 일으키는 종래의 살충제와는 달리, 생명유지에 기본적 역할을 하는 신경계나 에너지 생성계의 효소에 작용하는 것들이 주종을 이루고 있다. 이러한 살충제는 작용 기작 면에서 신경전달 저해제, 생장조절제, 성 페로몬 유인제 등으로 분류할 수 있다.

신경 전달 저해제는 곤충의 신경계를 이상자극, 흥분 또는 이상 억제하여 곤충을 살충시키며, 아세틸 콜린 에스터의 저해작용을 나타내는 살충제는 유기인계와 카바메이트(carbamate)계 화합물들이 신경화학전달물질인 아세틸콜린을 분해하는 효소인 아세틸 콜린 에스터의 활성작용을 저해하게 되면 아세틸콜린은 시냅스에 축척되어 신경전달 기능에 이상을 일으키고 경련과 마비를 일으키게 되어 곤충이 죽게 된다. 생장조절제는 곤충 표피의 구성과 키틴 생합성 저해작용을 나타내어 살충효과를 나타내는 것으로, 유약호르몬 저해제와 키틴 생합성 저해제가 있다. 성 페로몬 유인제는 곤충의 암컷에서 분비되는 수컷 유인페로몬을 이용하여 수컷을 유도하여 포획하여 죽이는 것이다. 그러나 현재 성 페르몬 유인제는 아직 야외포장시험에서는 그다지 효력을 나타내지 못하고 있다.

이러한 살충기작 중에서 최근에는 표피층을 형성하는 키틴의 생합성을 저해하는 곤충 특유의 기능에 작용하는 살충제가 주목받고 있다. 곤충의 체벽인 피부는 외골격이라 하여, 척추동물의 피부와는 달리 체형유지와 근육지지 등 구조기능 및 화학적 조성이 여러 가지 점에서 다르다. 곤충은 점진적 성장을 위하여 탈피를 하므로 곤충의 생리기능상 표피의 생합성을 아주 중요한 부분이므로, 곤충은 탈피를 못하면 죽게 된다.

근래 많은 연구자에 의하여 곤충의 생리 관련연구가 분자생물학적 방법을 이용하여 대사관련 효소나 수용체에 대한 연구가 부분적으로 밝혀지고 있으나, 호르몬의 이송이나 스테롤의 저장에 관련된 연구결과를 그다지 되어 있지 않다. 곤충이 생육하는 과정에서 세포막의 생성, 표피층의 왁스성분 및 혈림프에서의 지방수송 등에 스테롤이 필요하다고 알려졌으며, 실제로 대부분의 곤충들은 이 스테롤을 이용하는 과정에서 콜레스테롤 대신에 22-데히드로콜레스테롤(22-dehydrochoesterol)이나 7-데히드로에르고스테롤(7-dehydroergosterol)로 대체가 가능하고 또한 이러한 화합물을 곤충학적으로는 대체화합물이라 한다. 그러나 탈피호르몬 합성에 관여하는 스테롤은 콜레스테롤만 이용가능하고 대체화합물은 이용할 수 없다고 알려졌다.

그러나, 대부분의 곤충들은 스테롤 합성능력이 없으므로 스테롤을 외부로부터 섭취하여야 하는 필수 영양분으로 요구되며, 곤충들은 식물성 스테롤을 먹어 체내에서 콜레스테롤로 전환시켜 이용하고, 일부 육식성 곤충들은 타 곤충을 잡아먹어 스테롤을 충당하기도 한다. 이러한 콜레스테롤은 탈피호르몬을 합성하는 데 필수적이며, 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase)는 콜레스테롤의 아실화에 관여한다.

따라서, 본 발명자들은 이러한 스테롤 대사에서 필수적인 효소를 차단하여 곤충의 탈피를 방해하는 기작을 이용한 환경친화적 살충제를 고안하게 되었고, 새로운 개념의 살충제를 개발하기 위한 목표지향적인 탐색계로서 유충의 스테롤 대사에서 저장형 스테롤 또는 각종 호르몬 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 스테롤 아실화 효소 저해활성물질을 사용하여, 이를 식물체 추출물들로부터 탐색하였다.

이러한 과정에서, 본 발명자들은 로즈마리 추출물에서 아실코에이: 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 물질을 분리 정제하고 그 활성을 규명하였으며, 이러한 로즈마리 추출물 또는 그로부터 유래한 활성화합물을 곤충의 유충에 처리한 결과 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제를 저해하여 살충효과를 가져옴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물 포함하는 살충제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물로부터 분리한 화합물을 포함하는 살충제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 살충제를 이용하여 해충을 살충하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태에서 본 발명은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물을 포함하는 살충제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 로즈마리(Rosemarinus officinalis L.)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하며, 주요 성분으로는 α-피넨(α-pinene), 아피제닌(apigenin), β-카로틴(β-carotene), β-시토스테롤(β-sitosterol), 베툴린산(betulinic acid), 보르네올(borneol), 카페인산(caffeic acid), 캠퍼(camphor), 카르노솔(carnosol), 카르바크롤(carvacrol), 카본(carvone), 카리오필렌(caryophyllene), 클로로겐산(chlorogenic acid), 디오스민(diosmin), 게라니올(geraniol), 헤스피리딘(hesperidin), 리모넨(limonene), 리날로올(linalool), 올레아놀릭산(oleanolic acid), 1,8-시네올(1,8-cineol), 피토스테롤(phytosterol), 로스마놀(rosmanol), 로즈마린산(rosmarinic acid), 살리실산(salicylic acid), 스쿠알렌(squalene), 탄닌(tannin), 티몰(thymol), 우르솔릭산(ursolic acid), 칼슘, 철, 마그네슘, 망간, 인, 칼륨, 아연, 비타민 B1, B3, C 등이 있다. 로즈마리는 차나 와인으로 만들어져 오랫동안 이용되어 왔는데, 차는 두통, 감기를 고칠 뿐 아니라 항균 작용, 혈액순환 촉진 등에 도움이 되며, 침출액은 두통에 약효가 있어 흡입법으로 이용하면 뛰어난 효과를 볼 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 로즈마리의 에센셜 오일은 피부의 노화를 방지하는 효과가 있어 미용, 화장수로서 인기가 높고 비듬을 억제하여 주는 효과가 있어 삼푸나 린스의 원료로도 사용되고 있다(Duke JA. 1997. The green pharmacy. Rodale Press, New York. p 6-23). 한편, 로즈마리의 꽃수는 눈의 세정에 사용하고 잎은 향수의 원료로도 쓰인다. 이외에도, 로즈마리는 강력한 항산화 효과(Uchiyama M et al., J Pharm Soc Jpn 88(6): 678-683, 1968)가 있으며, 골다공증 예방 효과(Muhlbauer RC et al., Bone 32(4): 372-380, 2003), 항암효과(Offord EA et al., Cancer Letters 114(1-2):275-281, 1997) 뿐만 아니라, 그람 양성균에 대한 항균 활성을 가지며 농도 의존적으로 혈중 알콜 농도를 감소시키는 효과(Chung DO et al., Korean J Food Cookery SCi 17(3): 218-223, 2001) 등의 여러 기능성이 보고되고 있다. 그러나, 로즈마리의 살충효과, 특히 배추좀나방에 대한 살충효과는 보고된 바가 없다.

본 발명의 살충제에 포함되는 로즈마리 추출물은 공지의 추출 방법에 의해 추출될 수 있으며 그 방법에 제한이 있는 것은 아니다.

바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 로즈마리 추출물은 i) 로즈마리를 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화 하는 단계; ii) 분말화된 로즈마리에 용매를 가하여 추출하는 단계; 및 iii) 추출물을 여과 및 농축하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다. 상기 ii) 단계에서 추출에 사용되는 용매는 유기용매인 것이 바람직하다. 상기 유기용매는 1 내지 4의 탄소 수를 갖는 알코올로 구성된 군에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 추출에 사용되는 용매는 건조된 로즈마리 중량에 대해 3배의 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 7일 동안 실온에서 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 살충제에 포함되는 로즈마리 추출물은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 나타내며, 이와 같이 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 물질은 해충의 유충들 또는 유해 선충류에 대한 방제 효력을 나타낼 수 있다.

구체적으로, 곤충들이 생육하는데에는 스테롤이 필수적으로 요구되며, 이들의 대사 기작 중에 관련된 스테롤의 저장, 이동 및 호르몬 활성이나 소멸에 스테롤 아실화 효소를 필수적으로 이용하게 된다. 따라서, 상기 로즈마리 추출물을 포함한 살충제를 해충의 유충에 처리한 경우, 이들 물질이 유충의 스테롤 대사에서 저장형이나 이동에 관여하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제를 저해하여 살충활성을 나타내게 되며, 본 발명자들은 이러한 살충 효과를 하기 실시예를 통하여 확인하였다.

또한, 본 발명의 살충제에 포함되는 하기 화학식 1의 화합물은 로즈마리로부터 분리한 것이며, 곤충에서 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제를 저해하는 활성을 가지며, 본 발명자들은 상기 화합물의 이화학적 특성을 분석하고 실시예를 통해 살충효과를 확인하였다. 상기 화학식 1의 화합물은 그 자체 또는 농화학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 상기 염은 염산 및 황산과 같은 무기산, 또는 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산과의 농화학적으로 허용가능한 염이면 된다. 본 발명에 따른 로즈마리로부터 하기 화학식 1의 추출, 분리 및 정제는 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 그 방법에 제한이 있는 것은 아니다.

바람직한 실시양태에서, 상기 로즈마리 알콜 추출물에 노르말헥산을 초기 용매로 사용하고, 에틸아세테이트의 양을 증가시켜 헥산:에틸아세테이트 혼합액을 3:1까지 극성을 올리면서 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 분획물을 분리한다. 상기 분리된 활성분획의 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 농축하여 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 분획물을 분리하고, 메탄올을 용출용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 화합물을 분리할 수 있다.

본 발명의 살충제의 유효성분으로서 사용할 경우, 로즈마리 추출물을 임의의 기타 성분들의 첨가 없이, 그 자체로서 사용할 수 있으며, 또는 로즈마리로부터 분리한 화학식 1의 화합물 또는 그의 염의 형태를 사용할 수 있다. 그러나 본 발명의 살충제는 상기 로즈마리 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 통상 고체 담체, 액체 담체, 기체 담체 또는 유인물(bait)과 혼합하거나, 염기성 물질, 예컨대 다공질 세라믹 플레이트 또는 부직포에 흡수시킨 후, 계면활성제 및 필요한 경우, 기타 보조제들을 첨가하여, 이를 각종 형태들, 예컨대 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제(예 : 포깅), 증기화 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기 방지용 시이트 또는 수지 제형물로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 살충제는 통상 유효 성분으로서 로즈마리 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 0.01 내지 95 중량% 함유할 수 있다.

본 발명의 살충제에 사용될 수 있는 고체 담체에는, 카올린 점토, 규조토, 합성 수화된 산화규소, 벤토나이트, 푸바사미 점토 및 산점토 등의 점토 물질의 미세 분말 또는 과립; 각종 탈크, 세라믹 및 기타 무기 물질, 이를테면 견운모, 석영, 황, 활성탄,탄산칼슘 및 수화된 실리카; 및 화학적 비료, 이를테면 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄이 포함될 수 있다.

액체 담체에는, 물; 알콜, 이를테면 메탄올 및 에탄올; 케톤, 이를테면 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 이를테면 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 이를테면 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일;에스테르, 이를테면 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 이를테면 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 이를테면 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 이를테면 N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 이를테면 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 이를테면 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

기체 담체 또는 추진제(propellant)에는, 프레온 가스, 부탄 가스, LPG(액화 석유 가스), 디메틸 에테르 및 이산화탄소가 포함될 수 있다.

독성 유인물에 사용되기 위한 염기 물질에는, 유인물 물질, 이를테면 그레인 분말, 식물성 오일, 슈거 및 결정성 셀룰로스; 산화방지제, 이를테면 디부틸히드록시톨루엔 및 노르디히드로구아이아레트산; 보존제, 이를테면 데히드로아세트산; 비식음 방지용 물질, 이를테면 고추 분말; 및 유인성 풍미, 이를테면 치즈 풍미 및 양파 풍미가 포함될 수 있다.

계면활성제에는, 알킬 술페이트, 알킬 술포네이트, 알킬 아릴술포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 알콜 에스테르 및 당 알콜 유도체가 포함될 수 있다.

접착제 또는 분산제와 같은 보조제에는, 카세인, 젤라틴; 다당류, 이를테면 전분, 아라비아검, 셀룰로스 유도체 및 알긴산; 리그닌 유도체, 벤토나이트, 슈거 및 합성 수용성 중합체, 이를테면 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리아크릴 산이 포함될 수 있다.

안정화제에는, PAT(이소프로필 산 포스페이트), BHT(2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀), BHA(2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및 3-tert-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물), 식물성 오일, 미네랄 오일, 계면활성제, 지방산 및 그것의 에스테르가 포함될 수 있다.

본 발명의 살충제가 농업용 살충제, 살진드기제 또는 살선충제로 사용될 경우, 그것들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.1 내지 100 g 이다. 물로 희석한 후 사용되는 유화가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형물들의 경우,그 적용 농도는 통상 1 내지 100,000 ppm의 범위이다. 과립, 더스트 또는 기타 유사 제형물의 적용은, 희석하지 않은 제형물로서 수행된다. 본 발명의 살충제를 유행병 예방을 위한 살곤충제, 살진드기제 또는 살선충제로서 사용할 경우, 그것들은 유화가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 또는 기타 유사 제형물의 경우, 물로 농도 0.1 내지 500 ppm으로 희석하거나, 그것들을 오일 스프레이, 에어로졸, 훈연제, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 기타 유사 제형물의 경우에는, 그대로 적용된다. 이러한 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감 가능하다.

본 발명의 살충제를 소 및 돼지 등의 가축, 또는 고양이 및 개 등의 애완동물의 기생충 방제를 위한 살곤충제 또는 살진드기제로 사용할 경우, 그 조성물 또는 이의 염을 공지된 수의학적 방법들, 예컨대 계통적 방제를 위한 정제, 캡슐, 침액용 용액, 볼리(boli), 먹이 혼입, 좌약 또는 주사제; 또는 유성 또는 수성 용액의 분무, 주입(붓기 또는 점적) 처리로써, 또는 비계통적 방제를 위해 칼라 및 귀 태크(꼬리표)와 같은 적절한 모양으로 만든 성형품을 이용하여 적용할 수 있다. 이 경우, 본 화합물은 통상 숙주 체중 kg 당, 1 내지 100 mg의 양으로 적용된다.

본 발명의 살충제는, 다른 살곤충제, 살선충제, 살진드기제, 살세균제, 살진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 및/또는 동물 사료와 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.

본 발명의 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제에 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물 또는 화학식 1의 화합물을 포함하는 살충제는 유해 선충류 또는 해충의 유충들에 방제효과를 가질 수 있다. 바람직하게 상기 유해 선충은 오이 뿌리혹선충, 벼이삭선충, 및 벼뿌리선충으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방, 및 흰불나방으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 로즈마리 추출물을 포함하는 살충제는 가장 바람직하게는 배추좀나방에 대한 방제 효력을 나타낼 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 살충제를 이용하여 해충을 살충하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 살충방법은 살충제의 제형, 살충하고자하는 해충의 종류, 살충 대상 개체, 장소 및 방법 등의 다양한 요인을 감안하여 본 발명의 살충제를 적용시키는 것을 포함하며, 바람직한 일 양태로서 상기 살충제를 유효량으로 곤충 또는 서식지에 처리하는 단계를 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 갖는 로즈마리 추출물을 포함하는 살충제는 해충의 생체 내에서 스테롤 대사를 억제하여 유충의 살충활성이 우수하면서도 환경친화적이다.

도 1은 화학식 1의 화합물 처리에 의한 아실 코에이 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제의 저해활성을 나타낸 그래프이다
도 2는 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 질량분석스펙트럼이다.
도 3은 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 수소 핵자기 공명 스펙트럼이다.
도 4는 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 탄소 핵자기공명 스펙트럼이다.
도 5는 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 수소-수소핵자기공명 스펙트럼이다.
도 6은 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 수소-탄소핵자기공명 스펙트럼이다.
도 7은 로즈마리에서 분리한 활성 화합물의 먼거리 수소-탄소 핵자기공명 스펙트럼이다.
도 8은 버베논 처리에 의한 배추좀나방 유충의 식이 효과를 나타낸 것으로서, 제1열은 버베논 50ppm 처리 48시간 경과 후 섭식정도를 나타내며, 제2열은 버베논 100ppm 처리 48시간 경과 후 섭식정도를 나타내고, 제3열은 버베논 무처리 48시간 경과 후 섭식정도를 나타낸 것이다.

실시예 1 : 로즈마리로부터 아실코에이 :콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해물 질의 추출, 정제 및 저해활성물질의 구조분석

1-1. 추출 및 정제

살충활성을 나타내는 로즈마리 추출물 제조는 로즈마리를 대전 약전 시장에서 구입 후 식물 분류학자에게 자문을 받아 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조한 후, 분쇄기로 분말화시켰다. 분말화된 로즈마리 100g에 3배의 에탄올(건조된 로즈마리 중량에 대해) 300ml를 가하여 마개를 하여 실온에서 7일간 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 감압 농축하여 로즈마리 조추출물을 얻었다. 상기 조추출물을 에틸에테르를 넣어가면서 감압 농축하여 조추출물을 520mg을 얻어 50배량의 실리카겔 (230-400 mesh, Art. 9385, Merck사)을 담체로 실리카겔 컬럼크로마토그래피(2X10cm)를 수행하였다. 이때 용출용매로서 노르말헥산을 초기 용매(100%)로 하여 에틸아세테이트의 양을 증가시켜 헥산 : 에틸아세테이트 혼합액(3 : 1)까지 극성을 올리면서 분획을 받았다. 이 분획들을 아실 코에이 : 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(이하 "ACAT "라 칭함) 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 농축하여 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피(2X10cm)를 수행하였다. 이때 용출용매로서 헥산: 에틸아세테이트를 초기 용매(100:1)로 하여 에틸아세테이트의 양을 증가시켜 헥산:에틸아세테이트 혼합액(3 : 1)까지 극성을 올리면서 분획을 받았다. 이 분획들을 아실 코에이 : 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 저해활성을 측정하여 그 중에서 가장 저해활성이 높은 분획들을 모아 농축하여 120mg을 얻었다. 실리카겔 컬럼크로마토그라피를 행하여 활성물질을 담체로 세파덱스 LH-20컬럼에서 메탄올을 용출액으로 크로마토그라피를 수행하여 ACAT 저해활성물질(80㎎)을 순수화합물로서 분리하였다.

1-2: ACAT 저해활성물질의 이화학적 특성 분석

상기 아실 코에이 : 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제를 저해하는 활성물질의 이화학적 특성을 분석하였다. 분자량을 측정하기 위하여 (electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 이용하였다. 활성물질의 구조를 알아보기 위하여 핵자기공명 방법을 이용하였다. NMR실험은 각 시료를 CDCl₃ 녹여 5 NMR 튜브에서 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하였으며, 각 용매의 피크를 테트라메틸실란(tetramethylsilane)의 피크를 기준으로 측정하였다. 활성화합물에 대하여 물질의 성상, 분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과 활성물질의 성상은 유상이며, (M+Na)⁺는 174.3m/z로 측정되어, 화합물의 질량은 151.3으로 추정되었다(도 3). 고분해능 질량분석 결과, 활성물질의 분자식은 C₁₀H₁₄O로 추정되었다. 이화학적 특성을 참고하면서 활성물질을 CDCl₃에 녹여 분석한 수소 핵자기공명 스펙트럼에서 14분의 수소가 protons (1.00ppm (A), 1.49ppm (B), 2.01ppm (C), each 3H, s), (2.07ppm (D), 1H, d), (2.41ppm (E), 2.64ppm (F), each 3H, t), (2.8ppm (G), 1H, m), (5.72ppm (H), 1H, s)에서 측정되었다 (도 4). 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서 10개의 탄소가 22ppm (C-1), 24ppm (C-2), 27ppm (C-3), 41ppm (C-4), 50ppm (C-5), 54ppm (C-6), 58ppm (C-7), 122ppm (C-8), 170ppm (C-9), 191ppm (C-10))에서 측정되었다 (도 5). ¹H -¹H COSY스펙트럼에서 (A - B), (D - G), (E - G, F), (F-E, G), (G-D, E, F)가 관련있음을 나타내었고 (도 6), HMBC스펙트럼 (도 7) 및 HMQC스펙트럼 (도 8)을 분석하여 활성물질의 구조를 추정한 결과, 하기 화학식 1과 같은 구조를 가졌으며, 이러한 활성 화합물은 Passaro LC and Webster FX., J. Agric Food Chem. (2004) 19; 52 (10): 2896-2899에서 규명한 버베논(verbenone)과 일치하는 것으로 판명되었다.

[화학식 1]

실시예 2 : ACAT 효소원의 제조

본 발명에서 아실코에이:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 효소원으로는 흰쥐 (Male Sprague - Dawley rats 250 -300 g)의 간을 분리하여 마이크로좀 버퍼 A (0.25 M 수크로스, 1 mM EDTA, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4)로 세척하고 가위로 적당히 세절하고 teflon-glass homogenizer로 균질화 하였다. 균질액을 14,000 x g에서 15분 동안 원심 분리하여 침전물은 제거하고 상등액을 모아 100,000 x g에서 1시간 동안 원심 분리하였다. ACAT이 포함된 마이크로좀 분리를 위해 원심분리한 침전물을 마이크로좀 버퍼 B (0.25 M 수크로스, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4)를 가하여 재균질화 시킨 후 100,000 x g에서 1시간 동안 다시 원심분리하였다. 시험시 효소원의 단백질 농도의 균일화를 위하여 원심분리된 침전물에 마이크로좀 버퍼 B를 적당히 가하여 침전물을 완전히 용해하였다. 단백질 표준물질로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 Lowry 방법에 의해 단백질 농도를 결정한 후, 효소원은 마이크로좀 버퍼 B로 희석하여 단백질 농도를 10㎎/㎖로 조정하여 1 ㎖ 바이알에 분주하여 -70℃에서 보관하면서 시험에 사용하였다.

실시예 3 : 본 발명의 화합물의 ACAT 활성 실험

본 발명의 화합물의 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 활성저해물질의 활성측정은 브리쳐(Brecher)방법을 약간 수정하여 사용하였다[Brecher.P and C. Chen; Biochimica Biophysica Acat 617:458~471, 1980].

상기 방법은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 활성 효소원으로 흰쥐의 간으로부터 부분 정제한 마이크로좀을 사용하였으며, 기질로는 콜레스테롤과 방사능으로 표식된 올레오일(oleoyl) 코에이(Co-A)를 효소반응시키는 것으로, 반응생성물인 콜레스테롤 에스테르(cholesterol ester)에 포함된 방사능의 양으로 효소의 반응 정도를 측정하였다.

구체적으로 아세톤에 용해시킨 콜레스테롤과 아세톤에 용해시킨 Triton WR-1339를 물에 현탁시키고 아세톤을 질소가스로 제거한 후, K-포스페이트 완충용액(pH 7.4, 최종농도 0.1 M)을 첨가하였다. 효소반응을 안정화시키기 위하여 소 혈청 알부민을 최종농도로 30 μM을 넣고, 디메틸술폭시드 또는 메탄올로 녹인 시료를 적량 넣어 37 ℃에서 30 분간 예비반응시켰다. 상기 예비반응 후 본 반응은 기질인 [1-¹⁴C]oleoyl-Coenzyme A를 0.04 μCi가 되게 넣고 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 완결 후 이소프로판올-헵탄 1 ㎖를 넣어 반응을 정지시킨 후 n-헵탄 0.6 ㎖와 KPB buffer 0.4 ㎖ 를 넣고 잘 섞은 후 2분간 방치하였다. 분액되면 상등액 200 μl를 취하여 scintillation vial에 넣었다. 상기 용액에 scintillation cocktail(Lipoluma, Lumac Co.) 4 ㎖를 넣어 scintillation counter(Packard Delta-200)에서 생성된 cholesteryl oleate의 양을 측정하였으며 저해활성은 하기 수학식 1에 따라 계산되었다.

수학식 1

저해활성(%) = 1 - (T-B/C-B) *100

(상기 식에서,

T : 효소반응액에 시료를 넣어 시험구의 cpm값,

C : 효소반응액에 시료를 넣지 않은 대조구의 cpm값,

B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조구의 cpm값)

이때 공시험은 효소원을 넣지 않은 시험값과 시료를 넣지 않은 시험값을 보정하여 저해활성을 계산하였다. 그리고 실험의 양성 대조군으로는 obovatol을 사용하여 ACAT 저해활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 로즈마리 추출물로부터 분리한 활성물질인 버베논의 ACAT 저해활성 IC₅₀값은 2.3 μM으로 나타났으며, ACAT 효소에 농도의존적인 저해활성을 보여 주었다(도 1).

실험예 4 : 배추좀나방( Plutella xylostella L.)유충에 대한 활성시험

본 발명에서는 시험곤충으로 배추좀나방(Plutella xylostella L.)을 사용하여 2009년 9월 경상북도 경주시 경북농약주식회사 연구부에서 살충실험을 하였다. 본 발명의 상기 실시예 1에서 추출한 로즈마리 추출물로부터 정제한 ACAT 저해활성을 가진 화학식 1의 버베논을 정밀하게 무게를 측정하여 아세톤에 적정량을 녹인 후 triton X-100 100ppm 수용액 9배와 혼합하여 순차적으로 희석하고 처리할 활성검색물질 용액을 조제하였다. 배추좀나방 유충의 먹이는 균일한 발육상태의 양배추 잎을 잎 디스크(지름 3.0cm)로 잘라 준비된 활성검색물질 용액에 30초간 충분히 잠길 정도로 침적한 후 꺼내 후드 내에서 60분간 건조하였다. 증류수로 적신 여과지가 깔린 페트리디쉬(55X20mm)에 활성검색물질이 처리된 잎을 올려놓고, 배추 좀나방 2령 유충을 충체가 상하지 않도록 부드러운 붓으로 유충을 이동시켜 10마리씩 세번 반복하여 접종하였다. 활성검색물질이 처리된 배추좀나방 유충은 항온실(25±1℃, 상대습도 40-45%, 16L:8D)에서 사육하며 24, 48시간의 살충률을 조사하였다. 무처리구는 처리된 추출물을 제외한 아세톤 10 % 용액에 triton X-100 100ppm 수용액 9배를 처리하여 활성검색물질 처리방법과 같은 방법으로 처리하였다. 활성검색실험은 세 번 반복하여 실시하였고 이에 대한 결과를 표 1에 나타내었다.

버베논 처리에 의한 배추좀나방 유충 살충효과

시료	농도 (ppm)	반복	개체수	유충수		Day 살충률(%)
				1일	2일
버베논	50	1	10	8	4	33.3
		2	10	8	5
		3	10	8	8
	100	1	10	6	4	56.7
		2	10	9	5
		3	10	5	4
무처리 대조구		1	10	0	0	0.0
		2	10	0	0
		3	10	0	0

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 사용한 화학식 1의 버베논을 50과 100 ppm씩 배추좀나방 유충에 처리하고 1일과 2일에 살충정도를 측정하였을 때 무처리 대조구와 비교하여 지속적인 살충현상이 나타났으며 농도,시간 의존적으로 살충 효과가 나타났다. 또한, 상기와 같이 버베논을 무처리한 것과 버베논을 각각 50ppm, 100ppm으로 처리 48시간이 경과한 후에 배추좀나방 유충의 섭식정도를 비교조사하여 도 8에 나타내었다.

상기의 결과를 통해, 로즈마리 추출물의 in vitro ACAT저해활성과 해충에 대한 살충력이 상관성이 있음을 확인하였다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 농화학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 살충제:
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 로즈마리로부터 분리한 것인 살충제.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을 가지는 것인 살충제.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 해충의 유충 또는 선충에 대하여 살충효과를 가지는 살충제.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방, 및 흰불나방으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 살충제.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 선충은 오이 뿌리혹선충, 벼이삭선충, 및 벼뿌리선충으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 살충제.
   
7. 로즈마리 추출물을 포함하는 배추좀나방에 대한 살충제.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 로즈마리 추출물은 하기 화학식 1의 화합물을 활성성분으로 하는 살충제:
   [화학식 1]
   

   

   
   
9. 제7항에 있어서, 상기 로즈마리 추출물은 로즈마리를 유기용매를 이용하여 추출한 것인 살충제.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 유기용매는 1 내지 4의 탄소 수를 갖는 알코올로 이루어진 군에서 선택되는 것인 살충제.
    
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 살충제를 이용하는 살충방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 살충제를 유효량으로 곤충 또는 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 살충방법.

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