KR101614095B1 - 담쟁이의 용매 추출물의 살충제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 담쟁이(Parthenocissus tricuspidata PLANCH) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제 (acyl CoA:cholesterol acyltransferase)의 활성 저해제 또는 살충제 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 담쟁이 추출물이 곤충 유충의 체내에서 곤충이 필수적으로 요구되는 스테롤 대사들을 억제하여 유충의 살충 활성을 가지며, 스테롤 대사기작 저해는 인축에 해가 없음을 확인함으로써, 고독성농약을 사용할 수 없는 실내원예용 살충제 이용 시나 농약살포에 어려운 그린하우스 등에서 유해 선충류를 포함한 유충들, 또한 종래 살충제에 대한 저항성이 강해진 유충에 대하여 효소 활성 저해제 또는 살충제로서 유용하게 이용될 수 있다.

담쟁이, 알콜 추출물, 살충제, 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제.

Description

담쟁이의 용매 추출물의 살충제 조성물 {Parthenocissus tricuspidata PLANCH extracts for killing insects thereof}

본 발명은 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제(acyl CoA:cholesterol acyltransferase, 이하 “ACAT"라 명명함)의 활성 저해제 또는 살충제 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 경향신문 2006.7.25

[문헌 2] 농약연보 2004

[문헌 3] 곤충학, 부경생, 집현사, 1996

[문헌 4] Science, Vol 156, No.3782, 1637-1638, 1967

[문헌 5] Medicinal Research Reviews, 14(3), 271-305, 1994

[문헌 6] Brecher.P and C. Chen, Biochimica. Biophysica. Acat., 617, pp458~471, 1980

[문헌 7] 한국응용곤충학회 Vol 29, No.3, 194-200, 1990

전 세계 국가들은 그동안 무분별하게 사용되었던 위해성 물질들의 생산과 사용을 줄여 인류의 생존을 지키자는 취지에서 한자리에 모여 그 방법을 협의하였고 그중에서 지구의 온난화와 환경오염을 줄이자고 전 세계 국가가 합의하기에 이르렀다. 우리나라도 2006년부터 향후 5년간 친환경농업을 우리 농업 전반으로 확산시켜 우리 농산물의 품질경쟁력을 높이고 우리 농업의 체질도 지속가능한 친환경농업으로 전환시킬 계획이며 이를 위하여 자연순환형 친환경농업을 정착시켜 우리 농산물의 품질과 안전성을 향상시키고 현재 4%인 친환경농산물 비중도 2010년까지 10%로 확대하며, 농약과 화학비료 사용량도 2010년까지 30%, 2013년까지 40%를 감축해 우리 농업 전반을 지속가능한 농업으로 전환할 계획이다 (2006.7.25 경향신문).

세계적으로 많은 연구진이 유기인계, 유기염소계 농약을 대체할 수 있는 환경친화적 살충제를 개발하려고 많은 노력을 하였으나 아직 고독성농약을 대체할 새로운 기작의 안전한 살충제를 개발하지 못하고 있는 실정이다. 그러므로 전 세계적인 농약생산 감축회의 협정내용이 지켜지기 어려운 상황이며, 조만간에 안전한 살충제가 생산되지 않고 사용할 살충제의 량이 부족하게 된다면 식량생산에 관련된 농업뿐만 아니라 여러 가지 산업에 어려운 문제가 대두될 것으로 예상되고 있다.

UR 농업협정은 크게 관세화와 관세인하에 관한 시장개방 분야, 농업보조의 감축을 규정하고 있는 국내보조 분야, 그리고 수출보조 분야 등으로 구성되어 있다. 국내보조 분야에서는 각국의 농업보조를 이행기간 동안에 줄여나가야 하는 감 축대상보조(amber box)와 감축의무에서 면제되는 허용보조(green box)로 분류하고 있다. 그리고 생산제한을 조건으로 사용하는 직접지불금은 블루박스(blue box)로 분류하여 감축대상에서 제외하고 있다.

최근 전 세계의 농약관련 시장동향을 분석해 보면 2004년 통계에 의하면 전세계 농약시장은 280억$이고 그중에서 제초제가 46.6%, 살충제 27.7%, 살균제 20.8%, 기타농약이 4.9% 차지하고 있다. 그리고 국내의 농약시장은 2006년 통계에 의하면 총 1조 600 억원 이고 전 세계시장과는 농약별 점유률에서 차이가 있으며 국내는 농약 중에서 제초제 23.9%, 살충제 37.0%, 살균제 35.5%, 기타농약이 3.6%를 점유하고 있다. 그러므로 살충제는 3760억원 시장이며 점차적으로 증가추세에 있다(농약연보 2004).

살충제가 살충 작용하기 위하여 곤충체내 침입경로에는 입피부 및 기문이 있으며, 체조직 내로 들어간 살충제가 작용점에 도달할 때 어떤 것은 분해되어 무독화되고, 어떤 것은 반대로 활성화되어 보다 강력한 독성을 지닌 물질로 변하여 일부는 기관에 축적되고 일부는 배출된다. 그리고 충체에 약제가 도달하더라도 그 전부가 살충작용에 관여하는 것은 아니고 침입시 체조직 내에서 여러 가지인자에 의하여 저항을 받기 때문에 그 일부만이 작용부위에 도달한 후 곤충 생리 및 생화학적 기능의 변화를 일으켜 치사작용을 나타낸다. 그러므로 살충제의 작용기구를 고려할 때 살충제의 작용점과 그 방법, 그리고 곤충체내에 유효한 살충제의 양을 지배하는 대사작용 등이 중요한 의미를 지니고 있다. 현재 사용되는 살충제들은 작용 기작면에서 신경 전달 저해제, 에너지 생성 저해제, 생장조절제 및 성 페르몬 유인 제로 분류할 수 있으며, 그중에서 생장조절제는 유약호르몬 저해제 및 키틴 생합성 저해제로 구분할 수 있다.신경 전달 저해제는 곤충의 신경계를 이상자극, 흥분 또는 이상 억제하여 곤충을 살충시키며, 아세틸콜린에스터의 저해작용을 나타내는 살충제는 유기인계와 카바메이트(carbamate)계 화합물들이 신경화학전달물질인 아세틸콜린을 분해하는 효소인 아세틸콜린에스터의 활성작용을 저해하게 되면 아세틸콜린은 시냅스에 축척되어 신경전달 기능에 이상을 일으키고 경련과 마비를 일으키게 되어 곤충이 죽게 된다. 생장조절제는 곤충 표피의 구성과 키틴 생합성 저해작용을 나타내어 살충효과를 나타내는 것으로, 유약호르몬 저해제와 키틴 생합성 저해제가 있다.곤충체 내로 침입한 살충제는 각종 효소에 의하여 산화, 환원, 가수분해 등의 대사분해를 한다. 그러나 살충제 중에는 이러한 대사과정에서 해독과는 반대로 독성이 현저하게 증가하는 경우가 있다. 이러한 변화를 활성화라고 하는데, 살충제에서는 산화에 의한 것이 대부분이다. 곤충의 체벽인 피부는 외골격이라 하고, 척추동물의 피부와는 달리 체형유지와 근육지지 등 구조기능 및 화학적 조성이 여러 가지 점에서 다르다. 곤충은 점진적 생장을 위하여 탈피를 하는데, 표피의 생합성과정은 생리기능상 매우 중요하다. 곤충의 피부는 표피진피 및 기저막으로 구성되어 있는데, 표피는 외표피와 원표피로 나누어져 있다. 키틴은 척추동물에는 존재하지 않고 곤충 표피의 주요 구성성분으로서 탈피저해제인 살충제에 의하여 이 키틴 생합성을 저해하면 곤충은 탈피를 못하여 죽게 된다. 성 페로몬 유인제는 곤충의 암컷에서 분비되는 수컷 유인페로몬을 이용하여 수컷을 유도하여 포획하여 죽이는 것이다. 그러나 현재 성 페르몬 유인제는 아직 야외포장시험에서는 그다지 효 력을 나타내지 못하고 있다. 종래의 살충제는 기계유화제를 사용하여 충체 표면을 덮어 질식사시키는 물리적 치사작용을 일으키는 것도 있지만, 현재 사용되는 대부분의 살충제는 생명유지에 기본적 역할을 하는 신경계나 에너지 생성계의 효소에 작용하는 것들이 주종을 이루고 있다. 최근에는 표피층을 형성하는 키틴의 생합성을 저해하거나 유약 호르몬의 생성을 저해하는 등 곤충 특유의 기능에 작용하는 살충제를 개발중에 있다(곤충학, 부경생, 집현사, 1996).

많은 연구자에 의하여 곤충의 생리 관련연구가 부분적으로 밝혀지고 있으며, 최근의 연구동향은 분자생물학적 방법을 통하여 대사관련 효소나 수용체에 대한 연구가 진행 중에 있다.

곤충이 생육하는 과정에서 세포막의 생성, 표피층의 왁스성분 및 혈림프에서의 지방수송 등에 스테롤이 필요하다고 알려졌으며, 실제로 대부분의 곤충들은 이 스테롤을 이용하는 과정에서 콜레스테롤 대신에 22-데히드로콜레스테롤(22-dehydrochoesterol)이나 7-데히드로에르고스테롤(7-dehydroergosterol)로 대체가 가능하고 또한 이러한 화합물을 곤충학적으로는 대체화합물이라 한다. 그러나 탈피호르몬 합성에 관여하는 스테롤은 콜레스테롤만 이용 가능하고 대체화합물은 이용할 수 없다고 알려졌다(곤충학, 부경생, 집현사, 1996).

많은 연구자들에 의하여 곤충의 생리 관련연구가 분자생물학적 방법을 이용하여 대사 관련 효소나 수용체에 대한 연구가 부분적으로 밝혀지고 있으나 호르몬의 이송이나 스테롤의 저장에 관련된 연구결과는 그다지 되어 있지 않다.

대부분의 곤충들은 스테롤 합성능력이 없으므로 스테롤을 외부로부터 섭취하 여야 하는 필수 영양분으로 요구되며 대부분 많은 곤충들은 식물성스테롤을 먹어 체내에서 콜레스테롤로 전환시켜 이용하고, 일부 육식성 곤충들은 타 곤충을 잡아먹어 스테롤을 충당하기도 한다. 콜레스테롤은 탈피호르몬을 합성하는 데 필수적이며 세포막을 형성하는 데도 인지질과 함께 필수적으로 관여하며 여러 가지 생리작용에 관여하고 있다(Science, Vol 156, No 3782, 1637-1638, 1967).

한편, 인간과 가축들에서는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제 (acyl CoA:cholesterol acyltransferase)는 콜레스테롤의 아실화에 관여하여 소장에서 콜레스테롤의 흡수, 간장에서 초저밀도 지단백질의 합성, 지방세포와 혈관내벽에 저장형인 아실화된 콜레스테롤의 축적에 관여하여 동맥경화 진전에도 관여하는 효소로 알려져 있어 새로운 대사기작의 신약 개발 연구가 진행 중에 있으며 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제 저해제들은 대다수가 유기 화학적으로 합성된 우레아, 아미드, 페놀계의 합성화합물들이 주종을 이루고 있다. 그 중에서는 in vivo 활성시험을 마치고 동맥경화 예방치료제로 사용하기 위하여 전 임상 단계 시험 중인 의약품 후보물질은 있으나, 아직까지 임상에 사용되고 있는 것은 없다(Medicinal Research Reviews, 14(3) 271-305, 1994).

이에 본 발명자들은 곤충들이 스테롤을 필수적으로 요구하고 있는 현상에 착안하여 이들의 스테롤대사 기작 중에 저장형이나 이동에 관여하는 스테롤 아실화효소를 저해하여 나타내는 유충의 살충 활성의 작용기작을 이용하였으며, 본 발명에서는 자연계에 널리 존재하는 천연자원인 담쟁이 추출물로부터 새로운 효소저해 활성 기능을 탐색하였고, 배추좀나방 유충에서 살충 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제(acyl CoA:cholesterol acyltransferase)의 활성 저해제를 제공한다.

또한 본 발명은 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 살충제 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 살충제 조성물을 유효량으로 곤충 또는 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 살충 방법을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 담쟁이의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올,메탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 70 ~ 100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트, 보 다 바람직하게는 클로로포름에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 살충제는 해충의 유충, 진드기 또는 선충을 방제하는 것을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방 및 흰불나방으로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 진드기는 복숭아 혹 진딧물, 양딸기 수염진딧물, 및 파 혹 진딧물로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 선충은 오이 뿌리혹선충, 벼이삭선충 및 벼뿌리선충으로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 살충 방법은 곤충에게 분무 또는 투여하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 담쟁이 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 담쟁이 조추출물은 대전 유성구 어은동에서 채집한 담쟁이를 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조하여, 분쇄기로 분말화시킨 후, 분말화 된 담쟁이를 용매에 가하여 추출하여 여과한 것으로, 구체적으로는 분말화된 담쟁이 중량의 1배 내지 10배, 바람직하게는 2배 내지 5배 부피(w/v)의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물과메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 70-100% 메탄올에 가용한 추출물을 1 내지 15일, 바람직하게는 3 내지 10일 동안, 실온에서 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 용매추출법으로 추출하여 감압여과하고 농축하는 제조공정을 통하여 본 발명의 담쟁이 조추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 담쟁이의 조추출물, 바람직하게는 담쟁이의 메탄올 조추출물 중량의 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 분획하여 본 발명의 담쟁이의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제의 활성 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 살충제 조성물을 제공한다.

본 발명의 담쟁이 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 임의의 기타 성분들의 첨가없이, 그 자체로서 또는 염(염산및 황산과 같은 무기산, 또는 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산과의 농화학적으로 허용가능한 염)의 형태로 사용될 수 있다. 그러나 본 발명의 추출물은 통상 고체 담체, 액체 담체, 기체 담체 또는 유인물 (bait)과 혼합하거나, 염기성 물질, 예컨대 다공질 세라믹 플레이트 또는 부직포에 흡수시킨 후, 계면활성제 및 필요한 경우, 기타 보조제들을 첨가하여, 이를 각종 형태들, 예컨대 오일 스프레이, 유화가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제(예: 포깅), 증기화가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 수지 제형물로 제형할 수 있다.

상기 각 제형물들은 통상 유효성분으로서 하나 이상의 본 추출물을 0.01 내지 95 중량% 함유할 수 있다.

제형물에 사용될 수 있는 고체 담체에는, 카올린 점토, 규조토, 합성 수화된 산화규소, 벤토나이트, 푸바사미 점토 및 산점토 등의 점토 물질의 미세 분말 또는 과립; 각종 탈크, 세라믹 및 기타 무기 물질, 예컨대 견운모, 석영, 황, 활성탄,탄산칼슘 및 수화된 실리카; 및 화학적 비료, 예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄이 포함될 수 있다.

액체 담체에는, 물; 물, 예컨대 메탄올 및메탄올; 케톤, 예컨대 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예컨대 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예컨대 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일;에스테르, 예컨대 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예컨대 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예컨대 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예컨대 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예컨대 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

기체 담체 또는 추진제 (propellant)에는, 프레온 가스, 부탄 가스, LPG (액화 석유 가스), 디메틸 에테르 및 이산화탄소가 포함될 수 있다.

독성 유인물에 사용되기 위한 염기 물질에는, 유인물 물질, 예컨대 그레인 분말, 식물성 오일, 슈거 및 결정성 셀룰로스;산화방지제, 예컨대 디부틸히드록시톨루엔 및 노르디히드로구아이아레트산; 보존제, 예컨대 데히드로아세트산; 비식음 방지용 물질, 예컨대 고추 분말; 및 유인성 풍미, 예컨대 치즈 풍미 및 양파 풍미가 포함될 수 있다.

계면활성제에는, 알킬 술페이트, 알킬 술포네이트, 알킬 아릴술포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 물 에스테르 및 당 물 유도체가 포함될 수 있다.

접착제 또는 분산제와 같은 보조제에는, 카세인, 젤라틴; 다당류, 예컨대 전분, 아라비아검, 셀룰로스 유도체 및 알긴산;리그닌 유도체, 벤토나이트, 슈거 및 합성 수용성 중합체, 예컨대 폴리비닐 물, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리아크릴산이포함될 수 있다.

안정화제에는, PAT(이소프로필 산 포스페이트), BHT(2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀), BHA(2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및 3-tert-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물), 식물성 오일, 미네랄 오일, 계면활성제, 지방산 및 그것의 에스테르가 포함될 수있다.

본 조성물이 농업용 살곤충제, 살진드기제 또는 살선충제로 사용될 경우, 그것들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.1 내지 100 g 이다. 물로 희석한 후 사용되는 유화가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형물들의 경우, 그 적용 농도는 통상 1 내지 1,000 ppm 의 범위이다. 과립, 더스트 또는 기타 유사 제형물의 적용은, 희석하지 않은 제형물로서 수행된다. 본 발명의 화합물을 유행병 예방을 위한 살진드기제 또는 살선충제로서 사용할 경우, 그것들은 유화가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 또는 기타 유사 제형물의 경우, 물로 농도 0.1 내지 500 ppm으로 희석하거나, 그것들을 오일 스프레이, 에어로졸, 훈연제, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 기타 유사 제형물의 경우에는, 그대로 적용된다. 이 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감 가능하다.

본 조성물을 소 및 돼지 등의 가축, 또는 고양이 및 개 등의 애완동물의 기생충 방제를 위한 살진드기제로 사용할 경우, 그 조성물 또는 이의 염을 공지된 수의학적 방법들, 예컨대 계통적 방제를 위한 정제, 캡슐, 침액용 용액,볼리 (boli), 먹이 혼입, 좌약 또는 주사제; 또는 유성 또는 수성 용액의 분무, 주입 (붓기 또는 점적) 처리로써, 또는 비계통적 방제를 위해 칼라 및 귀 태크 (꼬리표)와 같은 적절한 모양으로 만든 성형품을 이용하여 적용할 수 있다. 이 경우, 본 화합물은 통상 숙주 체중 kg 당, 1 내지 100 mg 의 양으로 적용된다.

본 조성물은, 다른 살충제, 살선충제, 살진드기제, 살세균제, 살진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 및/또는 동물 사료와 함께, 혹은 그것들과 별도로 하되 동시에 사용될 수 있다.

본 발명의 담쟁이 추출물이 곤충 유충의 체내에서 곤충이 필수적으로 요구되는 스테롤 대사들을 억제하여 살충 작용을 하는 기작을 확인하고, 스테롤 대사 기작 저해는 인축에 해가 없음을 확인함으로써, 고독성농약을 사용할 수 없는 실내원 예용 살충제와 농약살포에 어려운 그린하우스 등에서 유해 선충류를 포함한 유충들, 또한 종래 살충제에 대한 저항성이 강해진 유충의 효소 활성 저해제 및 안전성이 우수한 살충제로서의 효능을 확인한 바, 상기 조성물은 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제 저해제 또는 살충제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 담쟁이 잎 메탄올 조추출물의 제조

본 발명의 담쟁이 잎은 대전 유성구 어은동에서 채집하여 식물 분류학자에게 자문을 구한 것으로, 채집한 담쟁이 잎을 물로 깨끗이 세척한 후 그늘에서 건조하여 분쇄기로 분말화 시켰다. 분말화 된 담쟁이 1000 g을 5000 ml의 메탄올을 가한 다음, 7일 동안 실온에서 용매추출하여 여과한 후, 이 여과액을 감압 농축하여 본 발명의 담쟁이 조추출물(이하, "PE"라 명명함) 150 g(수율: 15%)을 수득하였다.

실시예 2. 헥산 가용성 추출물의 제조

상기 실시예 1의 방법으로 제조한 담쟁이잎 메탄올 조추출물 150 g에 1000 ml의 물에 현탁시킨 후, 5000 ml의 분획깔대기에 넣은 다음, 1000 ml의 헥산을 가 하여 진탕추출 후, 분획하여 헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 헥산 가용성 분획층을 감압 농축하여 헥산 가용성 추출물(이하, "PE-H"라 명명함) 6 g(추출율: 4%)을 수득하였다.

실시예 3. 클로로포름 가용성 추출물의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물에 클로로포름 1,000ml을 가하여 진탕추출 후, 분획하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 클로로포름 가용성 분획층을 감압 농축하여 클로로포름 가용성 추출물(이하, "PE-C"라 명명함) 3 g(추출율: 2%)을 수득하였다.

실시예 4. 에틸아세테이트 가용성 추출물의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물에 에틸아세테이트 1,000ml을 가하여 진탕추출 후, 분획하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 얻고, 에틸아세테이트 가용성 분획층을 감압 농축하여 에틸아세테이트 가용성 추출물(이하, "PE-EA"라 명명함) 2 g(추출율: 1%)을 수득하였다.

실시예 5. 수가용성 추출물의 제조

상기 실시예 4의 방법으로 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획층을 제외한 나머지 수가용성 분획물을 농축, 감압여과하여 수가용성 추출물(이하 "PE-W"라 명명함) 5 g (추출율 : 3.3%)을 수득하였다.

실험예 1. ACAT(효소활성저해)활성 실험

본 발명의 담쟁이 추출물(PE, PE-H, PE-C, PE-EA, PE-W)의 살충 효과는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제(이하, "ACAT"라 명명함) 활성저해를 통하여 확인하였으며, 이 물질의 활성측정은 브리쳐(Brecher)방법을 약간 수정하여 사용하였다(Brecher.P and C. Chen, Biochimica. Biophysica. Acat., 617, pp458~471, 1980).

상기 방법은 ACAT 활성 효소원으로는 간으로부터 부분 정제한 마이크로좀을 사용하였으며, 기질로는 콜레스테롤과 방사능으로 표식된 올레오일(oleoyl) 코에이(Co-A)를 반응시키는 것으로, 반응생성물인 콜레스테롤 에스테르(cholesterol ester)에 포함된 방사능의 양으로 반응정도를 측정하였다. 구체적으로는, 아세톤에 용해시킨 콜레스테롤과 아세톤에 용해시킨 트리톤 WR-1339를 물에 현탁시켜 아세톤은 질소가스로 제거한 후 K-포스페이트 완충용액 (pH 7.4, 최종농도 0.1 M)을 첨가하였다. 효소반응을 안정화 시키기 위하여 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 최종농도로 30 μM을 넣고, DMSO 또는 MeOH로 녹인 시료를 적량넣어 37℃에서 30 분간 예비반응시켰다. 상기 예비반응 후 본 반응은 기질인 올레오일-코엔자임 A([1-¹⁴C]oleoyl-Coenzyme A)를 0.04 μCi가 되게 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 완결 후 이소프로판올-헵탄 1 ㎖를 넣어 반응을 정지시킨 후 n-헵탄 0.6 ㎖와 KPB bufferf 0.4 ㎖를 넣고 잘 섞은 후 2분간 방치하였다. 분액되면 상등액 200 μl를 취하여 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에 넣었다. 상기 용액에 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail)(Lipoluma, Lumac Co.) 4 ㎖를 넣어 신틸레이션 카운터(scintillation counter)(Packard Delta-200)에서 생성된 콜레스테릴 올레이트(cholesteryl oleate)의 양을 측정하였으며 저해활성은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

저해활성(％) = 〔 1 - (T-B/C-B) 〕＊100

T : 효소반응액에 시료를 넣어 시험군의 cpm값,

C : 효소반응액에 시료를 넣지 않은 대조군의 cpm값,

B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조군의 cpm값.

이때 공시험은 효소원을 넣지 않은 시험값과 시료를 넣지 않은 시험값을 보정하여 저해활성을 계산하였다.

실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 담쟁이 조추출물(PE)의 ACAT 효소활성저해는 100 ug/ml를 처리하였을 때 49.29% 효소저해 하는 것으로 측정되었고, 담쟁이 헥산 가용성 추출물(PE-H), 클로로포름 가용성 추출물(PE-C), 에틸아세테이트 가용성 추출물(PE-EA), 수가용성 추출물(PE-W)의 효소저해활성은 100 ug/ml로 처리하였을 때 각각 66.89%, 67.30%, 9.69%, 46.94% 저해하는 것으로 측정되었 다. 담쟁이 조추출물(PE) 및 클로로포름 가용성 추출물(PE-C)에서 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제 효소 저해 활성도가 가장 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 배추좀나방 유충에 대한 활성시험

상기 실험예 1에서 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제(ACAT) 효소에 대하여 우수한 저해 활성효과를 나타낸 본 발명의 담쟁이 조추출물(PE)의 배추좀나방 유충의 살충 효과를 확인하기 위하여 하기 문헌에 따라 실험을 수행하였다(한국응용곤충학회 vol29, No3, 194-200, 1990).

살충 효과를 확인하기 위해 사용된 시험곤충은 배추좀나방(Plutella xylostella L.)으로 2006년 9월 충청북도 청주시 충북대학교 농업생물환경대학 농생물과에서 살충실험을 하였다.

상기 실험예 1에서 확인한 ACAT 저해 활성을 갖는 본 발명의 담쟁이 조추출물(PE)을 정밀하게 무게를 측정하여 아세톤에 적정량을 녹인 후 트리톤 X-100 100 ppm 수용액 9배와 혼합하여 순차적으로 희석하고 처리할 활성검색물질 용액을 조제하였다.

본 실험에 사용된 배추좀나방 유충의 먹이는 균일한 발육상태의 양배추잎을 잎 디스크(지름 3.0 ㎝)로 잘라 준비된 활성검색물질 용액에 30초간 충분히 잠길 정도로 침적한 후 꺼내 후드 내에서 60분간 건조하였다. 증류수로 적신 여과지가 깔린 페트리디쉬(55×20 mm)에 활성검색물질이 처리된 잎을 올려놓고, 배추 좀나방 2령 유충을 충체가 상하지 않도록 부드러운 붓으로 유충을 이동시켜 10마리씩 3반 복으로 접종하였다. 활성검색물질이 처리된 배추좀나방 유충은 항온실(25±1℃, 상대습도 40-45%, 16L:8D)에서 사육하며 24, 48시간의 살충률을 조사하였다. 대조군은 처리된 추출물을 제외한 아세톤 10% 용액에 트리톤 X-100 100 ppm 수용액 9배를 처리하여 활성검색물질 처리방법과 같은 방법으로 처리하였다. 활성검색실험은 3반복으로 실시하였고 이에 대한 결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다.

실험결과, 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1의 방법으로 수득한 담쟁이 조추출물을 1, 10 및 100 ppm씩 배추좀나방 유충에 처리하고 1일 간격으로 4일간 살충정도를 측정하였을 때, 대조군과 비교하여 담쟁이 조추출물(PE) 처리에 의해 지속적인 살충현상이 나타났으며, 이 살충 효과는 농도 및 시간 의존적으로 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

시료	농도 ppm	반복	개체수	살충수				4Day 살충률(%)
				1Day	2Day	3Day	4Day
담쟁이 조추출물	1000	1	10	2	10	10	10	100.0
		2	10	3	10	10	10
		3	10	2	10	10	10
	100	1	10	4	6	8	10	96.7
		2	10	2	5	10	10
		3	10	2	7	7	9
	10	1	10	3	4	7	7	80.0
		2	10	3	5	7	7
		3	10	2	8	10	10
	1	1	10	0	5	5	9	73.3
		2	10	2	5	7	7
		3	10	2	6	6	6
Control		1	10	0	0	1	2	10.0
		2	10	0	0	0	0
		3	10	0	0	0	1

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호] 107048032SB010

[부처명] 농림기술관리센터

[연구사업명] 농림수산특정연구개발사업

[연구과제명] 섭식성 해충의 성장 및 탈피에 필요한 스테롤 대사 조절 신개념 살충소재 개발 연구

[주관기관] 고려대학교

[연구기간] 2008년 05월 30일 ~ 2009년 05월 29일

도 1은 담쟁이 추출물(PE, PE-H, PE-C, PE-EA, PE-W)의 아실 코에이 아실 트란스퍼라제의 저해 효과를 측정한 도이며,

도 2는 담쟁이 조추출물(PE)의 배추좀나방 유충의 살충 효과를 측정한 도이다.

Claims (12)

1. 분말화된 담쟁이 중량의 1배 내지 10배 부피(w/v)의 70-100% 메탄올 혼합용매로 1 내지 15일 동안, 실온에서 용매추출법으로 추출하여 감압여과하고 농축하는 제조공정을 통하여 담쟁이 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 얻은 담쟁이의 조추출물 중량의 1 내지 10배 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 분획하는 제 2단계 공정으로 수득되는 담쟁이의 헥산 또는 클로로포름 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제(ACAT)의 활성 저해제.
2. 분말화된 담쟁이 중량의 1배 내지 10배 부피(w/v)의 70-100% 메탄올 혼합용매로 1 내지 15일 동안, 실온에서 용매추출법으로 추출하여 감압여과하고 농축하는 제조공정을 통하여 담쟁이 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 단계에서 얻은 담쟁이의 조추출물 중량의 1 내지 10배 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물을 순차적으로 분획하는 제 2단계 공정으로 수득되는 담쟁이의 헥산 또는 클로로포름 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 배추 좀나방의 유충을 방제하는 것을 특징으로 하는 살충제 조성물.
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