KR101542843B1 - 우르솔릭 산을 포함하는 살충제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우르솔릭 산을 포함하는 살충제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제(DGAT) 저해 활성을 갖는 우르솔릭 산을 포함함으로써 살충 효과를 나타낼 수 있는 살충제에 관한 것이다.

Description

우르솔릭 산을 포함하는 살충제{An insecticide comprising ursolic acid}

본 발명은 우르솔릭 산을 포함하는 살충제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제(DGAT) 저해 활성을 갖는 우르솔릭 산을 포함함으로써 살충 효과를 나타낼 수 있는 살충제에 관한 것이다.

전 세계적으로 병충해로부터 작물을 보호하여 농산물의 생산성을 증가시키기 위해서 농약의 사용은 필요한 실정이다. 그러나, 전 세계적으로 농약의 잔류 독성과 환경오염으로 인한 여러 가지 문제점이 나타나자 전 세계 국가들은 인류건강을 위하여 독성이 강한 유기합성 농약의 사용을 자제하기로 국제적으로 논의하였다. 이러한 국제적인 협의에서 특히 인축에 영향을 많이 미치는 유기 합성된 농약의 사용을 점차 제한하자고 협의하였다. 국내에서도 2004년도에 지난 10년 전부터 사용하여 왔던 화학합성 유기인계 및 유기염소계 농약을 50%까지 생산 및 사용을 감축하기로 합의하였고, 또한 2010년까지 다시 유기인계 및 유기염소계 농약의 사용을 50%로 감소시키기로 합의하였다.

그러나, 전 세계적으로 유명한 다국적 기업을 포함한 많은 연구진의 노력에도 불구하고 새로운 기작의 살충제를 개발하지 못하였다. 이에 따라 안전한 살충제가 개발되지 못할 경우 국외뿐 아니라 국내도 살충제의 부족으로 인한 문제가 대두될 것으로 예상되고 있다.

최근 전 세계의 농약관련 시장동향을 분석해 보면 2004년 전세계 농약시장은 280억$이고 그 중에서 제초제가 46.6%, 살충제가 27.7%, 살균제가 20.8%, 기타농약이 4.9% 차지하고 있다. 그리고 국내의 농약시장은 2006년 총 1조 600 억원이고 농약 중에서 제초제가 23.9%, 살충제가 37.0%, 살균제가 35.5%, 기타농약이 3.6%를 점유하고 있다. 살충제는 대략 3760억원 시장이며 매년 점차적으로 증가 추세에 있다. 이 중에서 전체 살균제 소비량의 30%는 벼에 이용되고 있으며 나머지는 원예작물에 이용되고 있다. 1990년대 후반에 등록된 228개의 살균제를 종류별로 살펴보면 스테롤 합성 저해제 64종, 벤지미다졸 16종, 디카르복시이미드 14종, 유기인산 화합물 15종, 페닐아마이드 12종 및 기타 7종으로 화학 합성품이 주종을 이루고 있다.

살충제의 체내 유입경로에는 입, 피부 및 기문이 있으며 체조직 내에 유입된 살충제는 작용점에 도달할 때 어떤 것은 분해되어 무독성화 되고, 어떤 것은 반대로 활성화되어 보다 강력한 독성을 지닌 물질로 변하여 일부는 기관에 축적되기도 하고 일부는 배출된다. 그리고 곤충 체내에 약제가 도달하더라도 그 약제 전부가 살충작용에 관여하는 것은 아니고 유입될 때 곤충의 체조직 내에서 여러 가지 저항을 받을 수 있기 때문에 약제 일부만이 작용부위에 도달한 후 생리 및 생화학적 기능의 변화를 일으켜 치사작용을 나타내기도 한다. 그러므로 살충제의 작용기작을 생각할 때 살충제가 작용하는 위치와 대사작용 등이 주요한 의미를 지니고 있다.

전 세계적으로 사용되고 있는 살충제를 작용 기작 면에서 분류하면 신경 전달 저해제, 에너지 생성 저해제, 유약호르몬 저해제와 키틴 생합성 저해제의 생장조절저해제, 및 성 페로몬 유인제로 나눌 수 있고, 최근 본 발명자들에 의하여 개발된 스테롤 대사억제 살충제가 있으며, 현재 전 세계적으로 사용되고 있는 대부분의 살충제는 곤충의 생명유지에 기본적 역할을 하는 신경계나 에너지 생성계의 효소에 작용하는 것들이다.

또한, 많은 연구자들에 의하여 곤충의 생리 관련연구가 분자생물학적 방법을 통하여 곤충의 대사 관련 효소나 수용체에 대하여 수행되고 있으며, 이러한 연구 결과에 기초하여 살충제를 개발하려고 노력하고 있다. 그러나, 아직까지 곤충 체내의 호르몬의 이송이나 지방질의 저장에 관련된 연구는 많지 않은 상황이다. 곤충들은 대부분이 지방질의 합성능력이 없으므로 지방질은 필수 영양분으로 요구되며 많은 곤충들은 식물성 지방을 전환시켜 곤충 체내에서 이용하고 있다.

현재까지 DGAT 효소저해제로는 소수의 화학 합성품이 알려져 있으며, 천연물로부터 분리된 활성물질이 몇 종이 보고되어 있다.

국외의 경우, DGAT 효소저해제로 로셀리핀(roselipins)[Gliocladium roseum KF-1040, IC₅₀: 15-22 μM], 아미뎁신(amidepsines)[Humicola sp. FO-2942, IC₅₀: 10-50 μM]과 크산토후몰(xanthohumols)[Humulus lupulus, IC₅₀: 50-194 μM], 이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid), 2-브로모옥타노에이트(2-bromooctanoate)가 보고되어 있다(Tabata et al.; Phytochemistry, 46, pp683-687, 1997; Rustan et al.; J. Lipid. Res ., 29, pp1417-1426, 1988).

국내의 경우, 비만과 고지혈증 등의 중성지방의 흡수와 대사이상에 의한 질병의 분자 표적으로 인삼으로부터 비만억제활성을 갖는 신규물질이 보고된바 있으며(대한민국 등록특허 제10-0460438호), 생약자원인 오수유와 단삼으로부터 분리한 퀴놀론 알칼로이드와 탄시논계 물질이 보고된바 있다(Ko et al., Arch . Phar . Res., 25, pp446-448, 2002).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 곤충들의 대부분이 필수 영양분인 지방질을 체내에서 생합성하지 못하고 외부의 먹이로부터 지방질을 섭취하여 여러 대사과정을 거쳐 생존에 필요한 지방질을 이용하고, 필요한 에너지원을 만드는데 지방질을 이용하고 있다는 사실에 착안하여 곤충류의 지방질 대사 기작에 관련되어 있는 저해제를 탐색하고, 이를 이용하여 살충 활성을 나타낼 수 있음을 발견하였으며, 그 결과, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 작용기작이 확실하고 인축에 보다 안전한 살충제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 살충제를 이용하는 살충방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 살충제를 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서, 상기 화합물은 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제(Diacyl CoA: glycerol acyltransferase; DGAT) 저해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 살충제는 해충의 유충 또는 선충을 방제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방, 및 흰불나방으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 선충은 오이뿌리혹선충, 벼이삭선충, 및 벼뿌리선충으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 살충제를 이용하는 살충방법을 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 곤충의 트리글리세라이드 합성을 저해하는 물질을 포함하는 살충제 조성물에 관한 것이다.

곤충 체내에서 지질은 가장 중요한 에너지원으로서 이용한다. 지질은 주로 중성지방으로 지방체에 가장 많이 축적된다. 또한, 지질은 세포막의 구성성분으로서 이용될 수 있으며, 인지질과 스테롤이 함께 관련되며, 탈피호르몬, 유약호르몬, 페로몬의 생성에 관여하기도 한다. 이와 같이 대부분의 곤충들이 성장에 지방질을 필수적으로 요구하기 때문에 지질대사가 아주 중요하다.

이에 따라 본 발명에서는 곤충의 필수적인 지질대사를 인위적으로 저해하여 곤충 체내에서 트리글리세라이드의 합성이 저해됨에 따라 살충 효과를 나타낼 수 있음에 착안하여, 트리글리세라이드의 합성을 저해하는 물질을 포함하는 살충제 조성물을 제공하고자 한다.

곤충 체내에서 중성지방인 트리글리세라이드는 1,2-디아실글리세롤(sn-1,2-diacylglycerol)과 지방 아실코에이(Fatty acyl CoA)를 기질로 사용하여 DGAT에 의하여 촉매되어 합성된다.

디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제(DGAT)는 글리세롤 3-포스페이트(Glycerol 3-phosphate) 경로의 마지막 과정을 촉매하는 효소로서, 1,2-디아실글리세롤(sn-1,2-diacylglycerol)과 지방 아실코에이(Fatty acyl CoA)를 기질로 사용하여 트리글리세라이드(Triglyceride) 중성지방을 합성하는 역할을 한다. 구체적으로, 외부로부터 섭취된 중성지방은 췌장에서 분비된 리파제(lipase)에 의해 지방산(fatty acid)과 모노글리세라이드(monoglyceride)로 분해되어 장의 상피세포를 통해 흡수된 후, DGAT에 의해 트리글리세라이드 중성지방으로 변화된다. 중성지방의 생합성은 글리세롤 3-포스페이트 경로와 모노아실글리세롤 경로에 의해 소장의 장 상피세포에서 주로 이루어진다.

따라서, 본 발명에서는 곤충의 체내에서 상기 트리글리세라이드의 합성을 저해하는 것으로서 글리세롤 아실화 효소, 특히 DGAT활성을 저해하는 물질을 이용하여 유해한 해충을 사멸시킬 수 있는 살충제를 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "트리글리세라이드의 합성 저해"는 곤충의 체내에서 트리글리세라이드의 합성을 차단 또는 감소시키는 것을 말하며, 특히 바람직하기로는, 곤충 체내에서 트리글리세라이드를 합성하는 과정에서 작용하는 효소의 활성을 저해함으로써 트리글리세라이드의 합성 효율을 차단 또는 감소시키는 것을 의미한다.

상기 효소 활성을 저해시킬 경우, 곤충 세포 내에서 다양한 반응이 유도될 수 있다. DGAT 효소 활성을 저해시킴으로써 유도되는 반응의 하나의 예는 탈피호르몬 또는 유약호르몬 등이 생성되지 않음으로 인해 곤충의 생장이 저해되고 결국에는 살충되는 것이다.

본 발명은 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제(DGAT) 저해 활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함함으로써 살충 효과를 발휘하는 살충제를 제공할 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 우르솔릭 산(ursolic acid)으로도 불린다.

본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연 소재로부터 공지의 방법으로 분리하거나, 공지의 화학적 합성법으로 합성할 수 있다. 또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 시판되는 것을 입수하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 비파나무 열매로부터 분리된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물을 살충제의 유효 성분으로 사용할 경우, 그것은 임의의 기타 성분들의 첨가 없이 그 자체로서 또는 염의 형태로 사용될 수 있다. 그러나, 상기 화학식 1의 화합물은 통상 고체 담체, 액체 담체, 기체 담체 또는 유인물과 혼합하거나, 염기성 물질, 예로 다공질 세라믹 플레이트 또는 부직포에 흡수시킨 후, 계면활성제 및 필요한 경우, 기타 보조제들을 첨가하여, 이를 각종 형태들, 예로 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제, 증기화 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 수지 제형물로 제형할 수 있다.

상기 각 제형물들은 통상 유효 성분으로서 본 발명의 화합물을 0.01 내지 95 중량% 함유할 수 있다.

제형물에 사용될 수 있는 고체 담체에는, 카올린 점토, 규조토, 합성 수화된 산화규소, 벤토나이트, 푸바사미 점토 및 산점토 등의 점토 물질의 미세 분말 또는 과립; 각종 탈크, 세라믹 및 기타 무기 물질, 예로 견운모, 석영, 황, 활성탄, 탄산칼슘 및 수화된 실리카; 및 화학적 비료, 예로 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 염화암모늄이 포함될 수 있다.

액체 담체에는, 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

기체 담체 또는 추진제에는, 프레온 가스, 부탄 가스, LPG , 디메틸 에테르 및 이산화탄소가 포함될 수 있다.

독성 유인물에 사용되기 위한 염기 물질에는, 유인물 물질, 예로 그레인 분말, 식물성 오일, 슈거 및 결정성 셀룰로스; 산화방지제, 예로 디부틸히드록시톨루엔 및 노르디히드로구아이아레트산; 보존제, 예로 데히드로아세트산; 비식음 방지용 물질, 예로 고추 분말; 및 유인성 풍미, 예로 치즈 풍미 및 양파 풍미가 포함될 수 있다.

계면활성제에는, 알킬 술페이트, 알킬 술포네이트, 알킬 아릴술포네이트, 알킬 아릴 에테르 및 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 폴리에틸렌 글리콜 에테르, 다가 알콜 에스테르 및 당 알콜 유도체가 포함될 수 있다.

접착제 또는 분산제와 같은 보조제에는, 카세인, 젤라틴; 다당류, 예로 전분, 아라비아검, 셀룰로스 유도체 및 알긴산; 리그닌 유도체, 벤토나이트, 슈거 및 합성 수용성 중합체, 예로 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리 아크릴산이 포함될 수 있다.

안정화제에는, PAT(이소프로필 산 포스페이트), BHT(2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀), BHA(2-tert-부틸-4-메톡시페놀 및 3-tert-부틸-4-메톡시페놀의 혼합물), 식물성 오일, 미네랄 오일, 계면활성제, 지방산 및 그것의 에스테르가 포함될 수 있다.

본 화합물이 농업용 살 곤충제, 또는 살 선충제로 사용될 경우, 그것들의 적용량은 통상 10 에이커 당, 0.1 내지 100 g이다. 물로 희석한 후 사용되는 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 및 기타 유사 제형물들의 경우, 그 적용 농도는 통상 1 내지 1,000 ppm의 범위이다. 과립, 더스트 또는 기타 유사 제형물의 적용은, 희석하지 않은 제형물로서 수행된다. 본 발명의 화합물을 유행병 예방을 위한 살 곤충제, 또는 살 선충제로서 사용할 경우, 그것들은 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물 또는 기타 유사 제형물의 경우, 물로 농도 0.1 내지 500 ppm으로 희석하거나, 그것들을 오일 스프레이, 에어로졸, 훈연제, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 또는 기타 유사 제형물의 경우에는, 그대로 적용된다. 이 적용 양 및 농도는, 제형물의 형태, 적용 시기, 장소 및 방법, 해충의 종류, 손해 정도 및 기타 요인들에 따라 다를 수 있으므로, 상기 범위에 한정되지 않고, 증감 가능하다.

본 발명의 화합물을 소 및 돼지 등의 가축, 또는 고양이 및 개 등의 애완동물의 기생충 방제를 위한 살 곤충제로 사용할 경우, 그 조성물 또는 이의 염을 공지된 수의학적 방법들, 예로 계통적 방제를 위한 정제, 캡슐, 침액용 용액, 볼리, 먹이 혼입, 좌약 또는 주사제; 또는 유성 또는 수성 용액의 분무, 주입 처리로써, 또는 비계통적 방제를 위해 칼라 및 귀 태그와 같은 적절한 모양으로 만든 성형품을 이용하여 적용할 수 있다. 이 경우, 본 화합물은 통상 숙주 체중 kg 당, 0.01 내지 100 mg의 양으로 적용된다.

본 화합물은, 다른 살 곤충제, 살 선충제, 살 진드기제, 살 세균제, 살 진균제, 제초제, 식물 성장 조절제, 시너지스트, 비료, 토양 컨디셔너 및/또는 동물 사료와 함께, 혹은 그것들과 순차적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 DGAT에 저해활성을 갖는 화학식 1의 화합물을 포함하는 살충제는 유해 선충류 또는 해충의 유충들에 방제효과를 가질 수 있다. 바람직하게 상기 유해 선충은 오이뿌리혹선충, 벼이삭선충, 및 벼뿌리선충으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방, 및 흰불나방으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 화합물을 포함하는 살충제는 가장 바람직하게는 배추좀나방에 대한 방제 효력을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 화학식 1의 화합물의 DGAT 효소활성을 측정한 결과, 상기 화학식 1의 화합물이 DGAT 효소활성을 저해할 수 있음을 확인하였다(실시예 4, 도 2).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 화학식 1의 화합물을 배추좀나방 유충에 처리하고 살충활성을 조사한 결과, 상기 화학식 1의 화합물을 처리한 군에서 지속적인 살충현상이 나타났으며 농도 의존적으로 살충효과가 나타남을 확인하였다(실시예 5, 표 1).

본 발명의 살충제는 DGAT 효소활성을 저해할 수 있는 화학식 1의 화합물, 즉 우르솔릭 산을 유효성분으로서 사용함으로써 살충 작용기작이 확실하다는 장점을 갖는다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물이 비파나무 열매 등의 천연 소재로부터 분리될 수 있는 것으로 인축에 해가 없는 물질이고, 스테롤 대사기작 저해 또한 인축에 해가 없으므로 고독성 농약을 사용할 수 없는 실내 원예용 살충제와 농약살포가 어려운 그린하우스 등에서 안심하고 사용할 수 있는 환경 친화적인 살충제로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 살충제를 이용하여 해충을 살충하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 살충방법은 살충제의 제형, 살충하고자하는 해충의 종류, 살충 대상 개체, 장소 및 방법 등의 다양한 요인을 감안하여 본 발명의 살충제를 적용시키는 것을 포함하며, 바람직하기로는 상기 살충제를 유효량으로 곤충 또는 서식지에 처리하는 단계를 포함한다.

본 발명은 곤충의 체내에서 트리글리세라이드의 합성, 특히 DGAT의 저해활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 포함함으로써 살충 효과를 나타내는 살충제를 제공할 수 있다. 상기 DGAT의 저해활성 화합물은 해충의 생체 내에서 이들에게 필수적인 중성지방이 부족하게 되어 유충의 살충 활성이 나타나므로 작용기작이 확실하고, 비파나무 열매 등의 천연 소재로부터 분리하여 사용할 수 있어 인축에 보다 안전한 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명에 사용한 화학식 1의 화합물의 DGAT 저해활성 정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 사용한 화학식 1의 화합물의 배추좀나방에 대한 살충활성 정도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 활성 화합물의 분리

본 실시예에서 사용된 비파나무 열매(Eriobotrya japonica Lindl)는 대전광역시 대전역 근처의 한약건재상에서 구입하였다.

건조된 비파나무 열매 1.0 kg을 용매로서 에탄올 10L를 사용하여 3시간 동안 3회 반복 열탕(reflux) 추출한 후, 감압농축기로 용매를 제거하여 추출물 451g을 얻었다. 상기 에탄올 추출물을 10% 증류수에 현탁시킨 후, 클로르포름(CHCl₃)으로 분획하였다. 클로르포름 가용부 89g을 실리카 겔(70-230 mesh, 250g) 컬럼 크로마토그래피(지름 4cm, 길이 70cm)를 통해 CHCl₃:MeOH (100:0→0:100) 순으로 용출용매를 사용하여 10개의 분획을 얻었다.

상기 분획에 대하여 DGAT의 저해활성을 측정하여 저해활성이 있는 분획을 모아 증발 건조시켜 2.5g을 얻은 다음, YMC GEL ODS-A, s-150㎛, 50g이 충진된 컬럼 크로마토그래피에 용매로서 MeOH:H₂O(85:15→100:0)를 흘려주면서 분획을 나누어 DGAT의 저해활성을 측정하여 저해활성이 있는 분획을 모아 증발 건조하였다.

마지막으로 활성이 있는 분획을 건조하여 1.7g을 얻은 다음, Sephadex LH20을 34g 메탄올로 활성화시킨 후 용매로서 CHCl₃:MeOH(1:1)를 흘려주어 안정화시킨 뒤, 컬럼 크로마토그래피에서 용매로서 CHCl₃:MeOH(1:1)를 흘려주면서 분획을 나누어 DGAT의 저해활성을 측정하여 저해활성이 있는 분획을 모아 증발 건조시켜 활성 화합물 940mg을 얻었다.

실시예 2: 활성 화합물의 동정

상기 실시예 1에서 분리한 활성 화합물의 분자량을 측정하기 위하여, 전기분무 질량분광기(electrospray ionization mass spectrometry)(Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 이용하였다. 또한, 활성물질의 구조를 알아보기 위하여 핵자기공명 방법을 이용하였다. NMR 실험은 각 시료를 피리딘에 녹여 5 ㎜ NMR 튜브에서 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하였으며, 각 용매의 피크를 테트라메틸실란의 피크를 기준으로 측정하였다.

분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과, 화합물의 질량은 455.2로 추정되었다. 실제 분자량은 ESI-MS[M-H]⁺ m/z: 456.2로 측정되었다. 또한, 분리한 활성화합물의 구조동정을 위해 수소(¹H-)와 탄소(¹³C-) 핵자기공명기(NMR)와 질량분석기(MS)로 분석한 결과, 활성물질의 ¹H-와 ¹³C-NMR 스펙트럼 데이터와 MS 분석결과는 다음과 같았다.

¹H-NMR(피리딘,400 MHz): δ 0.89 (3H, s, H-25), 0.95 (3H, d, J=6.2 Hz, H-30), 1.00 (3H, d, J=6.4 Hz, H-29), 1.02 (3H,s, H-24), 1.05 (3H, s, H-26), 1.23 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-23), 2.64 (1H, d, J=11.3 Hz, H-18), 3.46 (1H, dd, J=4.0 및 10.0 Hz, H-3), 5.49 (1H, s, H-12).

¹³C-NMR(피리딘, 100 MHz) δ 39.40 (C-1), 24.94 (C-2), 78.15 (C-3), 40.00 (C-4), 53.58 (C-5), 18.81 (C-6), 33.60 (C-7), 39.51 (C-8), 48.07 (C-9), 37.31 (C-10), 28.16 (C-11), 125.68 (C-12), 139.30 (C-13), 42.53 (C-14), 31.30 (C-15), 23.65 (C-16), 48.07 (C-17), 55.85 (C-18), 39.43 (C-19). 39.10 (C-20), 28.71 (C-21), 37.47 (C-22), 23.94 (C-23), 16.60 (C-24), 17.48 (C-25), 15.70 (C-26), 28.84 (C-27), 179.91 (C-28), 17.55 (C-29), 21.44 (C-30).

상기 분자량 측정치와 NMR 데이터를 통해, 상기 활성 화합물이 하기 화학식 1의 구조를 가지는 화합물로서, 비파나무 열매에 함유되어 있는 것으로 알려져 있는 우르솔릭 산과 일치함을 확인하였다(Pichard W. Kriwacki et. al Pharmaceutical Research, Vol.6 No.7 531-554, 1989).

[화학식 1]

실시예 3: DGAT 효소원의 제조

효소원으로는 흰쥐(Male Sprague-Dawley rat, 250~300 g)의 간을 분리하여 버퍼 A(0.25 M 수크로즈, 1.0 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)로 세척하고 테프론 봉이 달린 유리 균질기로 균질화하였다. 상기 균질액을 14,000 × g에서 4 ℃, 15분 동안 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액을 다시 100,000 × g에서 4℃, 1 시간 동안 원심분리하였다. DGAT가 포함된 마이크로솜의 분리를 위해, 침전물에 버퍼 B(0.25 M 수크로즈, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4)를 가하여 100,000 × g에서 4℃, 1시간 동안 다시 원심 분리하여 생성된 침전물에 버퍼 B(4 ml)를 가해 용해시키고 표준물질로 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 단백질의 농도를 결정하였다. 효소원 용액은 단백질 양으로 10 mg/ml의 농도로 희석하고 각 바이알에 분주하여 -70℃에서 보관하며 DGAT 활성평가 시험에 사용하였다.

실시예 4: 본 발명 화합물의 DGAT 효소활성 측정

DGAT 효소활성 측정은 DGAT 효소원으로 래트의 microsomal protein과 기질로서 1,2-디아실글리세롤과 [¹⁴C]팔미토일-코에이를 사용하여 생성된 [¹⁴C]트리아실글리세롤의 방사능의 양을 측정하였다. 효소활성 측정 과정은 다음과 같았다.

반응액은 175 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 ㎕의 소혈청알부민(10 mg/ml), 8 mM의 MgCl₂, 30 μM의 [¹⁴C]palmitoyl CoA(0.02 mCi, Amersham), 200 μM의 1,2-디올레오일 글리세롤을 포함하였다. 여기에 메탄올 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 시료액 10.0 ㎕을 가하고 100-200 mg의 microsomal protein을 넣은 다음 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 반응 종결액(2-프로판올/헵탄/물 = 80/20/2, v/v/v) 1.5 ml를 가하여 반응을 정지시켰다.

생성된 [¹⁴C]트리아실 글리세롤을 분리하기 위하여, 1 ml의 헵탄과 0.5 ml의 H₂O를 가하여 진탕한 후 상층액 1 ml을 취하고 여기에 2 ml의 알칼리성 에탄올 용액(에탄올/0.5 N 수산화 나트륨/물 = 50/10/40, v/v/v)을 가하여 진탕하였다. 상층액 0.65 ml를 취하여 LSC(liquid scintillation counter)로 방사능의 양을 측정하여 하기 수학식 1에 의해 DGAT의 효소활성 저해율을 계산하였다.

[수학식 1]

저해활성(%) = [1-(T-B/C-B)]×100

(상기 식에서,

T : 효소반응액에 시료를 넣어 시험구의 cpm값,

C : 효소반응액에 시료를 넣지 않은 대조구의 cpm값,

B : 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조구의 cpm값)

상기 활성 화합물의 DGAT효소 저해 활성을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 활성 화합물에 대하여, 최종농도 1 ㎍/ml에서 13%, 5 ㎍/ml에서 37%, 10 ㎍/ml에서 53%, 15 ㎍/ml에서 65%의 저해활성이 측정되어 DGAT 효소를 50% 저해하는 저해농도는 8.90 ㎍/ml로 계산되었다. 활성 화합물인 우르솔릭 산의 분자량이 455.2이므로 우르솔릭 산의 DGAT 효소 50% 저해 농도는 20 μM로 계산되었다.

실시예 5: 배추좀나방 ( Plutella xylostella L.) 유충에 대한 활성시험

본 실시예에 사용된 시험 곤충은 배추좀나방(Plutella xylostella L.)으로 충북대학교 농업생물환경대학 농생물과에서 분양받아 살충실험에 사용하였다.

먼저, 본 발명의 DGAT 저해활성을 가진 화합물은 정밀하게 무게를 측정하여 아세톤에 적정량을 녹인 후 트리톤 X-100 100 ppm 수용액 9배와 혼합하여 순차적으로 희석하여 처리할 활성검색물질 용액을 조제하였다. 배추좀나방 유충의 먹이는 균일한 발육상태의 양배추잎을 잎 디스크(지름 3.0 ㎝)로 잘라 준비된 활성검색물질 용액에 30초간 충분히 잠길 정도로 침적한 후 꺼내 후드 내에서 60분간 건조하였다. 증류수로 적신 여과지가 깔린 페트리 디쉬(55×20mm)에 활성검색물질이 처리된 잎을 올려놓고, 배추 좀나방 2령 유충을 충체가 상하지 않도록 부드러운 붓으로 유충을 이동시켜 10마리씩 3반복으로 접종하였다. 활성검색물질이 처리된 배추좀나방 유충은 항온실(25±1℃, 상대습도 40-45%, 16L:8D)에서 사육하며 24, 48 시간의 살충율을 조사하였다. 무처리구는 활성검색물질을 제외한 아세톤 10% 용액에 트리톤 X-100 100 ppm 수용액 9배를 처리하여 활성검색물질 처리방법과 같은 방법으로 처리하였다. 활성검색실험은 3반복으로 실시하였고 반수치사농도(LC₅₀)을 산출하였다. 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 DGAT 저해제인 화학식 1의 우르솔릭 산의 반수치사농도(LC₅₀)는 8.9 ㎍/ml인 것으로 확인하였다.

한편, 본 발명의 DGAT 저해제인 화학식 1의 화합물을 1, 10, 100 ppm씩 배추좀나방 유충에 처리하고 1일 간격으로 4일 동안 살충 정도를 측정하였다. 비교를 위하여, 대조구로서 화학식 1의 화합물을 넣지 않고 용매만을 배추좀나방 유충에 처리하고 살충 정도를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

약제	농도 (ppm)	반복	N	살충률				4D 살충률(%)±SD
				1D	2D	3D	4D
Ursolic acid	100	1	10	2	9	9	10	100.0±0.0
		2	10	0	7	9	10
		3	9	0	9	9	9
	10	1	10	0	2	5	7	65.6±5.1
		2	9	0	2	4	6
		3	10	0	2	3	6
	1	1	10	0	1	1	2	26.9±6.7
		2	11	0	0	0	3
		3	9	0	0	1	3
	0	1	10	0	0	0	0	0.00±0
		2	10	0	0	0	0
		3	10	0	0	0	0

상기 표 1을 통해, 아무것도 넣지 않고 용매만 처리한 대조구와 비교하여 활성 화합물을 처리한 군에서는 지속적인 살충현상이 나타났으며 농도 의존적으로 살충효과가 나타남을 확인할 수 있다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염이 살충 유효성분인 농업용 살충제로서, 상기 화합물은 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제 저해 활성을 갖는 것인 살충제:
   [화학식 1]
   

   

   
   
3. 제2항에 있어서, 상기 살충제는 해충의 유충 또는 선충을 방제하는 것인 살충제.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 해충은 배추좀나방, 담배거세미나방, 및 흰불나방으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 살충제.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 선충은 오이뿌리혹선충, 벼이삭선충, 및 벼뿌리선충으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 살충제.
   
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 살충제를 이용하는 살충방법.
   
7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 디아실 코에이:글리세롤 아실 트랜스퍼라제 저해용 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   

Images