CN102512426A - 熊果酸在制备减肥和改善脂肪肝功效的保健品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供熊果酸在制备防治肥胖及肥胖引起的脂肪肝保健品中的应用。在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中发现熊果酸能够显著降低其体重,并有效改善了肥胖引起的脂肪肝。
Description
技术领域
本发明涉及一种熊果酸的新用途,具体涉及熊果酸在制备预防和治疗肥胖及肥胖引起的脂肪肝的保健品中的应用。
背景技术
肥胖作为一种发病率高,危害性大的综合症,已经日益引起人们的关注。世界卫生组织(WHO)调查表明2005年全球有16亿人超重,至少4亿人肥胖。2002年中国营养调查表明,我国成人超重率为22.8%,肥胖率为7.1%,与1992年调查资料相比,成人超重率上升39%,肥胖率上升97%。肥胖严重危害着人类的健康和生活质量,研究表明BMI(Body Mass Index,体质指数)大于32即可使预期寿命平均减少6-7年,导致死亡率的加倍。肥胖还可引起一系列代谢系统的紊乱,其中肥胖所致脂肪肝的发病率正逐年上升,肥胖人群中脂肪肝的发病率高达60%,已成为中国重大的公共卫生问题。
目前针对肥胖的治疗药物和保健品种类繁多,大致分为五种类型,包括食欲抑制型、增加能量消耗型、抑制肠道消化吸收型、中草药和复方制剂型以及其他治疗肥胖的类型。尤其是大多数都有不同程度的副作用,绝大多数的食欲抑制药及增加能量消耗的减肥药都可以产生不同程度的中枢神经系统兴奋作用,表现出易激惹症状、失眠、欣快感等。易感者及长期用药可发生依赖性,造成滥用,成瘾者突然停药会出现戒断症状,尤以苯丙胺易成瘾,故苯丙胺和含有苯丙胺的复合制剂不可用于减肥。目前,奥利司他是我国唯一批准上市的OTC减肥药,但是其副作用也不容忽视,主要表现在胃肠道不良反应及肝毒性等,故不适用于肥胖伴脂肪肝的患者。另外,单纯靠节食或减肥药快速降低体重还会打破机体正常的代谢系统,从而造成营养失调性脂肪肝,加重脂肪肝的病情。
脂肪肝尚无特效的治疗方法,目前以去除病因为主,坚持合理饮食和生活方式,积极治疗危险因素,如肥胖,胰岛素抵抗,脂代谢紊乱等。药物治疗主要是根据脂肪肝的病因和病情选择使用,例如合并高脂血症的脂肪肝患者原则上应使用降脂药,但许多降血脂药可促使血脂更集中于肝脏进行代谢,反而可能促进脂质在肝内的蓄积,并进一步损害肝功能。目前常用的降脂药有他汀类和贝特类药物,其中贝特类药物对脂肪肝的疗效尚存在争议,而他汀类药物治疗最常见的肝脏问题为血清转氨酶增高,此外横纹肌溶解也是他汀治疗最为严重的并发症。因此,目前急需一种综合治疗肥胖及合并高甘油三酯血症的脂肪肝的安全有效的防治方法。
熊果酸(ursolic acid,UA)又名乌苏酸,是一种非极性的五环三萜酸,广泛存在于女贞子,乌梅,山楂,栀子,猕猴桃等天然植物中,它具有广泛的生物学活性,包括抗炎,保肝,降脂,调节免疫和抗癌等。国内外研究报道,熊果酸在小鼠经口急性毒性LD50为9.26g/kg,大鼠每天口服熊果酸500毫克每公斤体重30天,对大鼠的生长、血象、心电图、肝肾功能都没有显著影响,对大鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃等重要脏器、组织亦无明显病理改变。临床实验成人(60kg体重)每天口服熊果酸剂量144mg,102例患者服用后未见明显的毒副反应。用药期间进行心电图、肾功能、血常规、尿常规检查,未发现异常改变。动物灌服临床剂量的208倍×30天,镜检脑、心、肺、肝、肾、脾、胃、睾丸、小肠、膀胱等脏器,未见有明显损害改变。证明熊果酸属低毒物质,可用于保健品的开发。我们的研究首次证实了熊果酸(ursolic acid,UA)能够有效降低饮食诱导肥胖大鼠的体重,改善高甘油三酯血症,治疗肥胖导致的脂肪肝,并进一步在体内验证了熊果酸能够促进甘油三酯在粪便中的排泄。
目前尚未见应用熊果酸治疗肥胖及肥胖引起脂肪肝的报道,孙梅等采用泰脂安胶囊治疗高脂血症性脂肪肝取得较好效果,但泰脂安胶囊是女贞子叶的乙醇提取物,除含有少量的熊果酸外,还含有齐墩果酸等其它功效成分,其具体的有效成分无法确定。并且,市面上治疗肥胖或肥胖性脂肪肝的保健品大多具有一定肝肾毒性,不适用于肥胖伴脂肪肝人群。
发明内容
本发明解决了目前针对肥胖和肥胖引起的脂肪肝药物副作用大,存在不同程度的肝脏毒性,且单纯减肥容易造成机体代谢紊乱导致营养失调性脂肪肝等问题,熊果酸不仅能够明显降低高脂饮食诱导肥胖大鼠的体重,还能有效改善肥胖引起的脂肪肝。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供熊果酸在制备预防和治疗肥胖及肥胖引起的脂肪肝的保健品中的应用。
实验证实98%的熊果酸纯品不仅能够明显降低体重,还能够改善其它肥胖并发的代谢性疾病,例如治疗肝脏脂肪变性,降低血中甘油三酯等。大鼠口服熊果酸的低、中、高剂量分别为每天50mg,100mg,200mg每千克体重,其中每天200mg每千克体重的熊果酸效果显著。
在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中发现熊果酸(ursolic acid,UA)能够有效降低肥胖大鼠的体重,治疗肥胖性脂肪肝。对比于一般治疗肥胖或肥胖引起脂肪肝的方法,熊果酸的优势在于具有较好的综合治疗效果。它能够在不影响摄食中枢,即不影响摄食量的前提下促进甘油三酯的排泄,有效地降低了肥胖大鼠的体重。目前针对肥胖性脂肪肝的治疗方法,首要是降低体重,而通过节食或服用药物减肥的风险在于易造成营养失调性脂肪肝,从而加重脂肪肝病情。研究结果显示熊果酸能够同时达到减肥和治疗脂肪肝的目的,且具有较好的安全性,是不可多得的一种新型保健品。
附图说明
图1为肝脏油红O染色;A为基础对照组,B为模型对照组,C为熊果酸低剂量组,D为熊果酸中剂量组,E为熊果酸高剂量组。
图2为肝脏DGATl、FAS、SREBP-1C、CD36蛋白表达的westernblot结果,CON表示基础对照组,FAT表示模型对照组,UAH表示熊果酸高剂量组;*表示和模型对照组相比p<0.05。
图3为肝脏PPAR-α、CPT-1、ATGL、HSL蛋白表达的western blot结果,CON表示基础对照组,FAT表示模型对照组,UAH表示熊果酸高剂量组;*表示和模型对照组相比p<0.05。
图4为骨骼肌PPARγ、PCKI、SCDI蛋白表达的western blot结果,CON表示基础对照组,FAT表示模型对照组,UAH表示熊果酸高剂量组;*表示和模型对照组相比p<0.05。
图5为骨骼肌p-AMPK、CPT1蛋白表达的western blot结果,CON表示基础对照组,FAT表示模型对照组,UAH表示熊果酸高剂量组;*表示和模型对照组相比p<0.05。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质,下面采用熊果酸药理实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
所用熊果酸购于南京泽朗医药科技有限公司,批号为ZL20090610XGS,提取自女贞子叶,用HPLC检测熊果酸的纯度为98.31%。
体内实验设计如下:
80只健康雄性SD大鼠按体重随机分为2组,一组为基础对照组(12只),另一组为高脂造模组(68只),单笼饲养。适应性喂养一周后,基础对照组给予普通饲料喂养,高脂造模组给予高脂饲料喂养,自由摄食和饮水,记录给食和撒食量,每周称一次体重。喂养6周,第6周末,从68只造模组大鼠中筛选出饮食诱导肥胖(DIO)大鼠40只。
将40只饮食诱导肥胖的SD大鼠根据体重随机分为4组:肥胖模型对照组(10只),熊果酸低剂量组(10只),熊果酸中剂量组(10只)和熊果酸高剂量组(10只)。熊果酸低、中、高三个干预组分别每天给予50、100、200毫克每千克体重的熊果酸,经口食用,干预6周。
一、熊果酸干预后大鼠生长情况的变化
1、熊果酸干预期间各组大鼠体重变化情况
表1-1熊果酸干预期间各组大鼠体重情况的比较(g)
*表示与模型对照组比较P<0.05
从表1-1中可以看出,熊果酸干预初始,模型对照组及熊果酸各剂量组间体重无显著性差异,随着时间推移各组体重逐渐增加。第三周起,熊果酸高剂量组体重明显低于模型对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。第六周时,熊果酸高、中剂量组体重均明显低于模型对照组(p<0.05)。熊果酸低剂量组组体重有低于模型对照组的趋势,但无显著性差异(p>0.05)。结果表明较高剂量组熊果酸可显著降低肥胖大鼠的体重。
2、熊果酸干预期间各组大鼠摄食情况
从表1-2可以看出,熊果酸干预期间,模型对照组和熊果酸各剂量组摄食量无显著性差异,表明熊果酸对大鼠摄食量无影响。
3、熊果酸干预后各组大鼠体内脂肪重量的比较
*表示与模型对照组比较P<0.05
从表1-4中可以看出,熊果酸各剂量组肾周脂肪重量显著低于模型对照组;熊果酸高剂量组睾周脂肪重量显著低于模型对照组。结果表明,熊果酸能够明显降低模型大鼠肾周及睾周脂肪含量。
4、熊果酸干预后各组大鼠脂体比的比较
表1-5熊果酸干预期间大鼠脂体比的比较(%)
*表示与模型对照组比较P<0.05;
从表1-5中可以看出,熊果酸干预期间,熊果酸高剂量组脂体比显著低于模型对照组,中低剂量组大鼠脂体比与模型对照组相比虽有降低趋势,但无统计学差异。结果表明,高剂量熊果酸可以明显降低饮食诱导肥胖大鼠的脂体比,具有一定的减肥效果。
二、熊果酸干预后大鼠血液生化指标的改变
1、熊果酸干预后大鼠血糖血脂的改变
*表示与模型对照组比较P<0.05;
从表2-1中可以看出,基础、模型对照组与熊果酸各剂量组相比,血糖、总胆固醇、高密度脂蛋白、无显著性差异;与模型对照组相比,熊果酸各剂量组甘油三酯显著降低,熊果酸中、高剂量组低密度脂蛋白显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明,高脂饮食诱导的肥胖大鼠其血中甘油三酯明显升高,而低、中、高剂量熊果酸都能够显著降低大鼠血清中的甘油三酯。另外中、高剂量熊果酸还能降低血中的低密度脂蛋白。
2、熊果酸干预后各组大鼠肝功指标的改变
*表示和模型对照组比较,P<0.05
从表2-2中可以看出,基础、模型对照组与熊果酸各剂量组相比,碱性磷酸酶(ALP)无显著性差异;与模型对照组相比,熊果酸各剂量组丙氨酸氨基转换酶(ALT)显著降低,熊果酸中、高剂量组天门冬酸氨基转换酶(AST)显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。说明熊果酸对肝脏有保护作用。
3、熊果酸干预后各组大鼠肾功指标的改变
从表2-3中可以看出,基础、模型对照组与熊果酸各剂量组相比,血肌酐、血尿素氮无显著性差异,说明熊果酸对肾脏无损害作用。
4、熊果酸干预后各组大鼠血清游离脂肪酸的改变
*表示和模型对照组比较,P<0.05
从表2-4中可以看出,模型对照组与基础对照组相比,血清总游离脂肪酸显著升高。熊果酸各剂量组与模型对照组相比,血清总游离脂肪酸显著下降,且出现一定的剂量依赖趋势。表明熊果酸能够显著降低模型组大鼠血清游离脂肪酸的水平,而血中高游离脂肪酸水平是导致胰岛素抵抗和脂肪肝等症状的重要危险因素,故降低血中游离脂肪酸可能是熊果酸改善肥胖相关代谢性疾病的原因之一。
三、熊果酸干预6周后各组大鼠24小时粪便甘油三酯、总胆固醇测定
#表示和基础对照组比P<0.05;*表示和模型对照组比较,P<0.05
从表3-1中可以看出,与基础对照组相比,各高脂饮食组大鼠粪便TG含量均显著升高(P<0.05);熊果酸中、高剂量组大鼠粪便TG含量显著高于肥胖对照组(P<0.05)。各组大鼠粪便中TC含量均无明显差别,这说明熊果酸促进了甘油三酯的排泄,甘油三酯在体内吸收的减少是熊果酸减肥的原因之一。
#表示和基础对照组比P<0.05;*表示和模型对照组比较,P<0.05
从表3-2中可以看出,模型对照组及熊果酸各剂量组大鼠日摄入TG量无差异,均显著高于正常对照组大鼠(P<0.05)。模型对照组及熊果酸各剂量组大鼠日排出TG量均显著高于正常对照组大鼠(P<0.05),熊果酸中、高剂量组日排出TG量显著高于模型对照组(P<0.05),有统计学意义。从摄入排出比来看,熊果酸中、高剂量组摄入排出比显著高于基础对照(P<0.05),模型对照及熊果酸低剂量组,后三组之间无差异。表明熊果酸在不影响大鼠摄食量的前提下,促进了甘油三酯的排泄,对比于一些通过影响摄食中枢达到减肥目的的保健品和药物,熊果酸具备更好的安全性。
四、熊果酸对于肥胖引起的肝脏脂肪变性的改善
1、肝脏油红O染色切片
如图1所示,A为基础对照组,B为模型对照组,C为熊果酸低剂量组,D为熊果酸中剂量组,E为熊果酸高剂量组。结果表明熊果酸干预后能够抑制肝脏中甘油三酯等中性脂肪的沉积,改善肥胖导致的肝脏脂肪变性。
2、熊果酸干预后各组大鼠肝脏甘油三酯、总胆固醇测定
#表示和基础对照组比P<0.05;*表示和模型对照组相比,P<0.01
从表4-1中可以看出,与基础对照组相比,模型对照组肝脏TG显著升高(P<0.05)。熊果酸各剂量组肝脏TG含量显著低于模型对照组(P<0.01),且出现一定的剂量依赖趋势。各组大鼠肝脏TC含量相比,差异无统计学意义。表明熊果酸能够显著降低饮食诱导肥胖大鼠肝脏中的TG含量,但对肝脏中TC含量无影响。
五、机制方面探讨
(一)RT-PCR结果
1、熊果酸抗脂肪肝炎性的指标
脂肪肝按照病理学进程分类包括早期的单纯性脂肪肝、中期的脂肪性肝炎和晚期的脂肪性肝硬化,研究发现,细胞因子通过多个复杂的环节,在非酒精性脂肪性肝病由单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎及肝硬化的启动、发生和发展中起重要作用,它们在单纯脂肪肝进展到脂肪性肝炎的过程中可能扮演重要角色。就脂肪肝的发病机制来看,细胞因子参与非酒精性脂肪性肝炎的发生、发展,不仅直接参与“第一次打击”-脂肪肝的形成,而且在“第二次打击”-脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化的启动、发生和进展中起重要作用。而我们的研究显示熊果酸可以通过调控一些相关的细胞因子延缓或改善脂肪肝的病情,结果如下所述。
*表示和模型对照组相比p<0.05;**表示p<0.01;
表5-1所示,熊果酸各剂量组与模型对照组相比,肝脏肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、白介素8(IL-8)mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型对照组相比,熊果酸高剂量组肝脏白介素6(IL-6)mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),熊果酸低、中剂量组未出现统计学差异。
2、熊果酸参与的肝脏脂代谢途径
在肝脏中,我们检测了熊果酸参与脂代谢的重要调控因子及相关酶的mRNA水平表达,其中包括脂肪酸合成的调控因子固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)及其调控的相关基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC1),脂肪酸合酶(FAS),固醇辅酶A去饱和酶1(SCD1);甘油三酯合成的关键酶二酰基甘油酰基转移酶(DGAT);脂肪酸β氧化的调控因子过氧化物体增殖物激活受体α(PPARα)及其调控的相关基因肉碱脂酰转移酶1(CPT1);甘油三酯水解酶:脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL);以及脂肪酸转位酶(CD36)。
*表示和模型对照组相比p<0.05;**表示p<0.01;
表5-2所示,熊果酸各剂量组与模型对照组相比,肝脏SCD1 mRNA表达水平无显著性差异;熊果酸各剂量组与模型对照组相比,肝脏DGAT1、FAS、ACC1、PPARγ、SREBP-1C、CD36mRNA表达水平显著降低;肝脏ATGL、HSL、PEDF mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,熊果酸高剂量组肝脏DGAT2 mRNA表达水平显著降低;肝脏PPAR-α、CPT-1表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);熊果酸低、中剂量组未出现统计学差异。
由上述结果可见熊果酸一方面通过下调脂肪酸和甘油三酯合成相关基因的mRNA水平从而减少了脂类在肝脏中的沉积,另一方面熊果酸还可以通过上调甘油三酯水解酶和脂肪酸氧化相关基因的mRNA水平同样达到减少脂类沉积的目的。为了进一步探讨熊果酸治疗肥胖及肥胖相关脂肪肝的分子机制,我们又检测了肝脏和骨骼肌组织中参与脂类代谢的关键因子其蛋白水平的表达。
(二)Western blot结果
1、肝脏中蛋白表达
熊果酸高剂量组与模型对照组相比,肝脏DGAT1、FAS、SREBP-1C、CD36蛋白表达水平显著降低(图2);肝脏PPAR-α、CPT-1、ATGL、HSL蛋白表达水平显著升高(图3),差异有统计学意义(P<0.05)。
由结果可知,熊果酸调节这些肝脏脂代谢重要因子的mRNA水平和蛋白水平的趋势是一致的,证明熊果酸降低血中甘油三酯,治疗肥胖相关脂肪肝的机制是通过下调脂肪酸和甘油三酯合成关键酶,上调甘油三酯水解和脂肪酸氧化关键酶实现的。
2、骨骼肌中蛋白表达
文献报道PPARγ可以通过调控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)和SCD1,促进甘油三酯的生成,磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能够正向调控CPT1的表达从而促进脂肪酸的β氧化。我们的实验结果证实熊果酸通过负调控PPARγ和PCK1、SCD1抑制了甘油三酯的沉积,通过上调磷酸化的AMPK和CPTI促进了骨骼肌的能量消耗,从而加速了能量的消耗,达到减肥的目的,具体的实验结果如下:
熊果酸高剂量组与模型对照组相比,骨骼肌PPARγ、PCK1、SCD1蛋白表达水平显著降低(图4);骨骼肌p-AMPK、CPT1蛋白表达水平显著升高(图5),差异有统计学意义(P<0.05)。
综上,熊果酸对高脂饮食诱导肥胖大鼠的减肥、降脂、改善脂肪肝的作用机制有以下几点:1、减少了能量的摄入——(1)UA干预各组与空白、模型对照组间摄食量无差别;(2)UA干预各组粪便中TG摄入排出比增加,减少TG在体内的吸收。2、促进了能量的消耗——UA通过PPARγ途径抑制了PKC1和SCD1的表达,抑制了甘油三酯的合成,并通过AMPK途径促进了脂肪酸的β氧化,从而达到了减肥的目的。3、抑制了脂类在肝脏中的沉积:(1)熊果酸通过抑制CD36表达及SREBP-1c途径抑制了ACC1、FAS、SCD1、DGAT的表达,从而抑制了甘油三酯的合成;(2)熊果酸通过PPARα途径促进了CPT1的表达,从而促进了脂肪酸的β氧化;(3)熊果酸能够促进ATGL和HSL的表达,从而加速甘油三酯的水解。
Claims (1)
1.熊果酸在制备防治肥胖及肥胖引起的脂肪肝的保健品中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120627 |