KR20160094896A - 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 그 유도체를 사용하는 방법 - Google Patents

히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 그 유도체를 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 지방생성과 지방분해 억제 및 지방축적 감소에 사용하는 방법에 관한 것으로서, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 미리 정한 용량으로 비만억제 혹은 지방간 치료의 의약 조성물 내의 유효성분으로 사용하거나, 혹은 식품의 구성성분으로도 사용할 수 있다. 여기에서, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 감귤속 식물의 과피에서 유래한다.

Description

히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 그 유도체를 사용하는 방법{THE USES OF HYDROXYL POLYMETHOXYLFLAVONES AND/OR DERIVATIVE THEREOF}
본 발명은 천연화합물을 사용하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 히드록시기 폴리메톡시플라본을 사용하는 방법에 관한 것이다.
비만이 발생하는 주요 요인에 있어서, 개체의 섭취열량이 소모열량보다 높고, 과도하게 많은 에너지가 트리글리세리드의 형태로 지방조직 내에 축적되므로 이자, 간, 골격근 등에 축적되면서 비만 및 대사증후군(metabolic syndrome)을 초래하고, 심혈관 질환, 고혈압, 고지혈증, 제2형 당뇨병 등을 유발한다. 현재 세계보건기구에서는 비만을 일종의 만성 질환으로 분류하고 있으며, 대만 2004~2008년 영양건강조사결과에서는 영양 과잉이 다수 만성 질환을 유발한다는 것을 보여주고 있다.
운동, 열량통제, 외과수술 등과 같이 비만을 치료하는 방법이 많이 있기는 하나, 현대인들은 업무가 바쁘고 외식 중심의 식습관이 있기 때문에 운동 및 열량통제 등의 방법을 통해서는 체중 감량의 좋은 효과를 얻기 힘들다. 또한, 지방흡입 수술, 위장관 수술 등과 같은 외과수술을 통해 체중을 감량하려 할 경우, 소요비용이 비교적 높고 수술과정에서 개체에 불확정적인 영향이 가해질 수 있다. 그 외, 신진대사 자극제, 식욕 억제제, 녹말소화 차단제 등과 같은 약물을 통해 체중을 감량할 경우, 약물을 장기 복용하면 인체에 부작용을 일으킬 수 있다. 약물복용이 인체에 악영향을 미치지 않도록 하기 위하여 현재 종래기술에서는 천연성분 또는 천연추출물을 이용하여 식욕을 억제하고 에너지 대사를 증가시키는 등의 약용기전을 통하여 비만을 억제하는 효능을 얻으려는 연구가 다수 추진되고 있다. 예를 들어, 카페인은 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase)를 억제하여 세포 내 고리형 아데노신1인산(cyclic adenosine monophosphate) 수치를 높임으로써 에너지 대사를 향상시키고, 후디아(Hoodia) 선인장 추출물은 식욕을 억제하고, 하고초(Prunella vulgaris) 추출물은 프티알린(ptyalin)의 활성을 억제하여 녹말소화 차단제로 사용되고, 선연소 또는 질경이는 지질대사를 촉진시킴으로써 혈액 내 트리글리세리드를 감소시킨다.
상기 천연성분 또는 천연추출물의 작용기전은 지방세포의 생명주기 조절, 지방세포 분화 억제, 지방세포 분해 촉진 작용에 직접적으로 관여하지 않기 때문에 다이어트 효과가 비교적 우수하지 않다. 따라서 보다 효과적으로 지방축적을 억제하고 비만을 통제하기 위하여 현재 종래 기술에서는 지방세포 기능을 조절하거나 또는 지방형성을 억제하는 천연성분 개발에 노력하고 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 제1 과제는 히드록시기 폴리메톡시플라본(hydroxyl polymethoxylflavones, HPMFs) 화합물 또는 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것으로서, 비만을 억제하는 의약 조성물을 조제하는 데에 사용되고, 개체의 체내 지방생성 및 지방분해를 억제하는 데에 사용되며, 섭식율을 변화시키지 않는 조건에서 지방조직이 장기에 축적되는 것을 줄여준다. 여기에서, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 감귤속 식물의 과피에서 유래하며, 상기 감귤속 식물은 유자, 만다린, 탄제린, 오렌지 또는 레몬 등을 말한다.
본 발명에서 해결하고자 하는 제2 과제는 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것으로서, 지방간을 치료하는 의약 조성물을 조제하는 데에 사용되며, 지방간 병변을 개선하고 간에 기름 방울(유적)이 축적되는 것을 줄이는 데에 사용된다. 여기에서 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 감귤속 식물의 과피에서 유래하며, 상기 감귤속 식물은 유자, 만다린, 탄제린, 오렌지 또는 레몬 등을 말한다.
본 발명에서 해결하고자 하는 제3 과제는 영양보조식품에 관한 것으로서, 상기 영양보조식품은 개체가 평소에 대사증후군과 관련 있는 최소 하나의 증상을 예방 또는 개선하는 데에 사용하며, 상기 영양보조식품은 최소 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 포함하고, 여기에서 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본은 감귤속 식물의 과피에서 유래하며, 상기 감귤속 식물은 유자, 만다린, 탄제린, 오렌지 또는 레몬 등을 말한다.
상기 해결하고자 하는 각 과제는 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에 관한 것으로서,
a. 미리 정한 양의 감귤속 식물 과피의 추출물을 취하는 단계;
b. 상기 단계 a에 있어서 상기 감귤속 식물 과피 추출물을 알코올로 용해하고, 염산을 첨가하여 혼합액을 만드는 단계;
c. 상기 혼합액에 대해 가열 환류 반응을 진행하는 단계;
d. 상기 혼합액에서 상기 알코올을 제거하고 유기용제와 물로 추출하는 단계; 및
e. 상기 단계 d에 있어서 유기용제층을 수집하고, 정제하여 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 획득하는 단계를 포함한다.
여기에서,
상기 알코올은 에탄올이고,
상기 유기용제는 아세트산 에틸이다.
본 발명에 따르면, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방분해와 지방성숙을 억제하고 지방간을 개선하고 지방축적을 저하시키는 효능이 있으므로, 약물의 유효성분으로 사용할 경우 비만 억제 또는 지방간 치료의 목적을 달성할 수 있다. 또한, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 천연식물에서 유래하여 세포에 대해 독성이 없으므로 개체에 대한 부작용을 감소시키며, 식품 구성성분으로 사용하여 일상생활의 영양보조식품으로 조제할 경우 비만 예방 및 지방간 개선의 목적을 달성할 수 있다.
도 1에 있어서 A는 3T3-L1 지방전구세포 배양 0일차 세포형태이고;
도 1에 있어서 B는 3T3-L1 지방전구세포 배양 2일차 세포형태이고;
도 1에 있어서 C는 3T3-L1 지방전구세포 배양 4일차 세포형태이고;
도 1에 있어서 D는 3T3-L1 지방전구세포 배양 6일차 세포형태이고;
도 1에 있어서 E는 3T3-L1 지방전구세포 배양 8일차 세포형태이고;
도 1에 있어서 F는 3T3-L1 지방전구세포 배양 8일차 ORO(oil red O)염색의 결과이고;
도 2에 있어서 A 및 B는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포의 분화 8일차 ORO염색 결과이고;
도 2에 있어서 C는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 트리글리세리드의 함량이고;
도 3에 있어서 A는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 PPARγ 발현이고;
도 3에 있어서 B는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 C/EBPα의 발현이고;
도 4에 있어서 A는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 지방산 합성효소의 발현이고;
도 4에 있어서 B는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 지방산 결합단백질2의 발현이고;
도 4에 있어서 C는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 아세틸조효소A카르복시화효소의 발현이고;
도 5에 있어서 A는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 AMPKα(Adenosine monophosphate-activated protein kinase α) 및 p(phosphorylation)-AMPKα(Thr172)의 발현이고;
도 5에 있어서 B는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 AMPK-β 및 p-AMPKβ(Ser108)의 발현이고;
도 5에 있어서 C는 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 SREBP1c(sterol regulatory element binding protein 1c)의 발현이고;
도 6은 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포 분화 8일차의 PI3K 및 p-PI3K(Tyr508)와 AKT 및 p-AKT(Ser473)의 발현이고;
도 7은 각기 다른 처리를 거친 3T3-L1 지방전구세포의 세포주기분석 결과이고;
도 8은 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 체중변화이고;
도 9는 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 섭식량이고;
도 10은 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 외관이고;
도 11에 있어서 A 내지 D는 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 생식선 지방 외관이고;
도 12에 있어서 A 내지 D는 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 복부 지방 외관이고;
도 13은 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 생식선 지방 중량이고;
도 14는 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 복부 지방 중량이고;
도 15는 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 장관 지방 중량이고; 및
도 16에 있어서 A 내지 D는 순서대로 각기 다른 조건에서 사육한 각 그룹 쥐의 간 절편 염색도이다.
본 발명에 있어서 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 상기 유도체는 지방생성과 지방분해를 억제하고 지방축적을 감소시키는 데에 사용되며, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 상기 유도체는 유효량으로 비만을 억제하거나 또는 지방간을 치료하는 의약 조성물을 조제하는 데에 사용되고, 영양보조식품을 조제하는 데에 사용되고, 여기에서 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 감귤속 식물의 과피에서 유래한다. 개체에 유효량의 상기 의약 조성물을 투여하거나 또는 개체에 상기 영양보조식품을 섭취시키면 상기 개체 내 지방세포분화가 억제되고 지방세포 축적이 감소되는 효능을 얻을 수 있다.
더욱 상세하게는, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 폴리메톡시플라본(polymethoxylflavones, PMFs) 상에서 최소 하나의 메톡시기(-OCH3)를 히드록시기로 전환하여 획득한다.
종래 기술에서는 3T3-L1 지방전구세포가 분화되어 성숙 지방세포로 바뀌는 데에는 여러 인자가 작용을 일으킨다는 것을 밝혀냈다. 예를 들어, PPAR 및 C/EBPs와 같이 지질합성을 자극하는 전사인자는 3T3-L1 지방전구세포 분화를 촉진시킬 수 있다. 여기에서, C/EBPs는 지방산 결합단백질(fatty acid binding protein 2, aP2)과 같은 지방대사효소를 활성화시킬 수 있는 유전자이고, SREBP-1(sterol regulatory element-binding protein 1)은 지방분해를 결정하는 인자로서 다수 중요한 지방생성인자를 전사하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들어 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS), 아세틸조효소A카르복시화효소(acetyl-CoA carboxylase, ACC)는 지방산 및 지방 합성을 가속화할 수 있으며 PPARγ를 활성화하는 데에 사용할 수도 있다. 그 외, LKB1/STK11를 통해 p-AMPKα(Thr172)를 활성화시킬 수 있고, 더 나아가 인산화 아세틸조효소A카르복시화효소의 활성을 감소시켜 지방산 합성을 억제한다. 다시 말해 AMPK (Adenosine monophosphate-activated protein kinase)를 조절하기 때문에 지방생성 억제의 지표가 된다.
본 발명에 있어서 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방분해의 전사인자 및 관련 경로를 조절하기 때문에, 지방분해를 억제하고 지방성숙 능력을 저하시킬 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방세포분화 과정에서 PPARγ 및 C/EBPα와 같은 중요한 전사인자의 발현을 억제할 수 있고, 아세틸조효소A카르복시화효소, 지방산합성효소, aP2와 같은 하위표적유전자의 단백질 발현을 억제할 수 있어 트리글리세리드의 축적을 감소시킬 수 있다. 다시 말해, AMPK의 신호전달경로를 활성화하고 PI3K/Akt의 신호전달경로를 억제할 수 있어 지방전구세포 분화를 억제하는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서 명세서와 특허청구범위에서 사용하는 용어는 각각 아래 설명과 같으나, 아래 설명은 예시에 불과하며 본 발명의 명세서 및 특허청구범위를 제한하지 않는다.
소위 “의약 조성물”이라 함은 본 발명에 있어서 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물과 같은 유효성분을 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 조성물이며, 최소 하나의 약학적으로 수용할 수 있는 운반체 및 부형제와 결합하여 적당한 투여형태로 조제한다. 여기에서 적당한 투여형태에는 과립, 분말, 정제, 캡슐, 좌약, 액상, 현탁제, 점적, 주사용제 등이 사용될 수 있다.
소위 “약학적으로 수용할 수 있는 염류”라 함은 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물의 산성 또는 염기성 산물로서, 상기 염류 또는 유리 형태(free state)로 존재한다. 여기에서 염류의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 조성할 수 있으며 상기 입체이성질체를 포함한다.
소위 “유효량” 또는 “유효용량”이라 함은 개체종류, 개체중량 및 투여방식에 따라 계산하여 획득하는 것이다.
소위 “투여”라 함은 경구복용, 흡입, 경직장(transrectal), 경피흡수, 또는 피하, 동맥, 정맥, 복막 등 주사 방식을 말한다.
소위 “식품”이라 함은 임의의 형식으로 존재하며 개체에 식용으로 제공하는 것으로서, 과립제품, 분말제품, 고형제품, 액상제품, 현탁액제품, 반고체제품, 유제품 등의 식품을 말한다.
아래 실시예 및 도면을 통해 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1: 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 제조
10g의 귤피 추출물을 취하고, 40%의 폴리메톡시플라본을 함유한 95%의 에탄올로 용해한 후, 다시 3M의 염산(hydrochloric acid, HCl)을 첨가한다. 상기 혼합액에 대하여 가열 환류 반응을 12시간 진행하고, 상기 반응과정을 TLC와 LC/MS로 분석하고 반응이 종료할 때까지 대기한 후 냉각시키고, 진공상태에서 에탄올을 제거하고, 아세트산 에틸과 물을 첨가하여 추출을 진행한다. 유기층 추출물과 물층 추출물을 수집한 후 다시 아세트산 에틸로 추출 후 합친다. 합친 유기추출층을 희석한 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 용액, 물 및 염수(30% NaCl) 용액으로 세척하고, 무수 황산나트륨(sodium sulfate)으로 수분을 제거하여 건조한다. 그 후 여과, 감압농축과 동결건조(lyophilized)를 거친 후 획득한 담황색 고체가 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물이다.
실시예 2: 3T3-L1 지방전구세포 배양
3T3-L1 지방전구세포를 10% 소태아혈청을 함유한 10,000units/mL 페니실린과 10,000μg/mL 스트렙토마이신의 DMEM 배지에서 배양하고, 10cm 배양접시에서 5% 이산화탄소의 37℃ 세포배양상자에 넣고 배양한다. 세포생장 약 7~8분 경에 배양액을 제거하고 인산염 완충액으로 세척한 후, 37℃에서 적정량의 트립신(trypsin-EDTA)을 첨가한 후, 배양접시에서 배양된 세포를 가볍게 두드려 배양접시 기저부에서 분리시키고, 다시 신선한 배지로 트립신의 작용을 종료시키고, 피펫으로 수 차례 흡수하여 세포를 균일하게 분산시킨 후, 일정한 비율로 세포를 균일하게 각종 크기의 배지에 분배하고, 5% 이산화탄소의 37℃ 세포 배양상자에서 배양한다.
실시예 3: 3T3-L1 지방전구세포 분화 시험
3T3-L1 지방전구세포를 24홀 배양접시에 넣고, 소태아혈청(fetal calf serum)을 함유한 DMEM 배지에서 3일간 배양한 후, 다시 배지를 다른 소태아혈청(fetal bovine serum)을 함유한 DMEM 배지에서 2일간 배양하고, 상기 배양 완료일을 0일차로 정하고, DMI 유도제(DEX, MIX, insulin) 배지를 첨가하여 2일간 배양하고, 3T3-L1 지방전구세포 분화에 사용한다. 다시 배지를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 5μg/mL 약제 INS를 함유한 DMEM 배지로 바꾸고 2일간 배양한 후, 4일차, 6일차 및 8일차에 각각 배지를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 함유한 배지로 교환한다. 0일차 내지 8일차의 배양 과정에 있어서 2일 간격으로 3T3-L1 지방전구세포의 세포형태를 관찰한 결과는 도 1의 A 내지 E에서 도시하는 바와 같고, 8일차 배양을 완료한 3T3-L1 지방전구세포를 ORO 염색을 한 결과는 도 1의 F에서 도시하는 바와 같고, 여기에서 적색 부분은 지방세포 내의 적색 지방구이다.
도 1에서 도시하는 바와 같이, 미분화된 3T3-L1 지방전구세포의 세포형태는 방추형(도 1의 A에서 도시하는 바와 같음)이고, 2일차에 일부 3T3-L1 지방전구세포의 세포형태가 점차 원형으로 바뀌었고, 4일차에 3T3-L1 지방전구세포 내에 작은 기름방울이 생성되기 시작했고, 6일차에 3T3-L1 지방전구세포 내에 집적되는 기름방울이 증가하였고, 8일차에 90% 이상의 3T3-L1 지방전구세포가 성숙 지방세포로 분화하였고, 그 안에 크고 작은 기름방울이 집적하였다.
실시예 4: 3T3-L1 지방전구세포 내 지질축적 시험
실시예 3의 단계와 동일하게 3T3-L1 지방전구세포를 8일차까지 분화시키고, 분화과정에 있어서 각기 다른 처리조건의 4개 그룹으로 나눈다. 여기에서, 제1그룹은 대조군이고, 제2그룹은 2일차에 DMI 배지를 첨가한 실험군이고, 제3그룹과 제4그룹은 각각 2일차에 DMI 배지를 첨가하였고 각각 0일차, 2일차, 4일차, 6일차에 10μg/mL 및 20μg/mL 용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 첨가하였다. 각 그룹을 8일간 배양하고 세포를 ORO(Oil Red O) 염색을 하고 현미경으로 관찰 및 사진을 촬영한 결과는 도 2의 A 및 B에서 도시하는 바와 같다. 다시 분광광도계(510nm)로 측정한 결과는 도 2의 C에서 도시하는 바와 같다.
도 2에서 도시하는 바와 같이, DMI 유도제를 첨가하지 않은 제1그룹은 3T3-L1 지방전구세포가 미분화 상태에 있었으며 세포형태가 방추형이었고, DMI 유도제만 처리한 제2그룹은 상기 3T3-L1 지방전구세포가 분화되어 성숙 지방세포로 바뀌었으며 세포형태는 원형이었고 성숙 지방세포 내에 적색 지방구가 관찰되었고, 제3그룹 및 제4그룹에서 획득한 3T3-L1 지방전구세포 내 적색 지방구는 각각 제2그룹과 비교할 때 많이 감소한 것으로 나타났다. 다시 말해, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 DMI 유도제를 통해 유도된 3T3-L1 지방전구세포 지질합성작용을 억제할 수 있다. 따라서 도 2에서 도시하는 바와 같이, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물로 처리한 후 3T3-L1 지방전구세포 내 지질함량은 감소세를 나타냈으며, 지방전구세포 내 지질축적이 현저하게 억제되었다.
실시예 5: 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물의 지방분해 억제 기전 분석
실시예 3 및 실시예 4의 단계와 동일하게, 3T3-L1 지방전구세포를 8일차까지 분화 배양을 진행하고, 분화과정에 있어서 각기 다른 처리조건의 4개 그룹으로 나눈다. 여기에서, 제1그룹은 대조군이고, 제2그룹은 2일차에 DMI만 첨가한 배지로서 실험군이고, 제3그룹과 제4그룹은 각각 2일차에 DMI 배지를 첨가하고 각각 0일차, 2일차, 4일차, 6일차에 10μg/mL 및 20μg/mL 용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 첨가하였다. 각 그룹의 모든 세포용해액을 수집하고, 웨스턴 블로팅법(Western blotting method)으로 각 그룹의 단백질 발현을 분석한 결과는 도 3 내지 도 5에서 도시하는 바와 같다. 여기에서, 도 3의 A는 각 그룹 PPARγ의 발현이고, 도 3의 B는 각 그룹 C/EBPα의 발현이고, 도 4의 A는 각 그룹의 지방산합성효소 발현 결과이고, 도 4의 B는 각 그룹 지방산결합단백질2의 발현이고, 도 4의 C는 각 그룹 아세틸조효소A카르복시화효소의 발현이고, 도 5의 A는 각 그룹 AMPKα 및 p-AMPKα(Thr172)의 발현이고, 도 5의 B는 각 그룹 AMPKβ 및 p-AMPK(Ser108)의 발현이고, 도 5의 C는 각 그룹 SREBP-1c의 발현이다.
또한, 상기 단계와 동일하게 3개 그룹으로 나누고, 제1그룹은 대조군이고, 제2그룹은 2일차에 DMI만 첨가한 배지로서 실험군이고, 제3그룹은 2일차에 DMI 배지를 첨가하고 0일차, 2일차, 4일차, 6일차에 20μg/mL 용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 첨가하였다. 그 후 각 그룹의 모든 세포용해액을 수집하고 웨스턴 블로팅법으로 각 그룹의 단백질 발현을 분석한 결과는 도 6에서 도시하는 바와 같다. 여기에서, 도 6은 각 그룹의 PI3K 및 p-PI3K(Tyr508)와 p-Akt(Ser473)의 발현이다.
도 3 및 도 4에서 도시하는 바와 같이, DMI 유도제만 처리한 제2그룹만 PPARγ, C/EBPα, 아세틸조효소A카르복시화효소, 지방산합성효소 및 aP2 등 단백질의 발현양이 제1그룹보다 증가하였고, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물로 처리한 제3군 또는 제4군은 PPARγ, C/EBPα, 아세틸조효소A카르복시화효소, 지방산합성효소 및 aP2 등 단백질의 발현양이 제2군의 발현양보다 감소하였다. 도 5에서 도시하는 바와 같이, p-AMPKα(Thr172)와 p-AMPKβ(Ser108)의 발현양은 제1그룹과 제2그룹에 있어서 차이가 없었고, 제2그룹에 비하면 제3그룹 또는 제4그룹의 p-AMPKα(Thr172)와 p-AMPKβ(Ser108)의 발현양이 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물의 농도가 증가함에 따라 상승하였고, SREBP-1c의 발현양은 감소하였다. 도 6에서 도시하는 바와 같이, 제2그룹의 p-PI3K(Tyr508) 및 p-AKT(Ser473)의 발현양은 제1그룹보다 증가하였고, 제3그룹에 있어서 p-PI3K(Tyr508) 및 p-AKT(Ser473)의 발현양은 제2그룹보다 감소하였다.
도 3 내지 도 6에서 도시하는 바와 같이, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방세포 분화과정에 있어서 반드시 필요한 전사인자 PPARγ, C/EBPα 및 하위 단백질 아세틸조효소A카르복시화효소, 지방산합성효소 및 aP2의 발현을 억제하였고, p-AMPKα 및 AMPKβ 상의 단백질을 증가시키고 AMPK 신호전달경로를 활성화시키고, SREBPs 발현양을 감소시켜 PPARγ 유전자 발현 및 하위 단백질 아세틸조효소A카르복시화효소와 지방산합성효소의 발현을 억제시켰고, p-PI3K(Tyr508) 및 p-AKT(Ser473)을 감소시켜 PI3K/Akt 신호전달경로를 억제함으로써, 3T3-L1 지방전구세포 분화를 억제하는 효능을 발휘하였다.
실시예 6: 3T3-L1 지방전구세포의 세포주기 분석
3T3-L1 지방전구세포를 24홀 배양접시에 넣고, 소태아혈청(fetal calf serum)을 함유한 DMEM 배지에서 3일간 배양한 후, 다시 배지를 다른 소태아혈청(fetal bovine serum)을 함유한 DMEM 배지로 바꾸어 2일간 배양하고, 상기 배양 완료일을 0일차로 정한 후, 각기 다른 배양 조건에 의거하여 그룹을 나누어 2일간 배양한다. 여기에서, 제1그룹은 대조군이고, 제2그룹은 2일차에 DMI만 첨가한 배지는 실험군이고, 제3그룹과 제4그룹은 각각 2일차에 DMI 배지를 첨가하고, 각각 10μg/mL 및 20μg/mL 용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 첨가하였다. 18 및 24시에 각 그룹 세포를 고정시키고 프로피디움 요오드화물로 염색하고, 유세포분석기 및 모드피트(ModFit LT)로 각 그룹의 세포주기분포를 분석한 결과는 도 7 및 아래 표에서 도시하는 바와 같다.
표 1은 각기 다른 배양시간의 각 그룹의 세포주기 분포를 나타낸다.
시간 그룹별 세포주기 분포(%)
G0/G1 S G2/M
18시 1 76.72±0.13 15.36±0.27 7.60±0.41
2 27.61±0.63 71.89±0.65 0.50±0.53
3 70.08±0.64c 29.64±0.03 c 0.04±0.05
4 83.66±0.56 c 12.21±0.27 c 5.22±0.82 c
24시 1 77.05±0.89 13.96±0.27 8.59±0.75
2 49.13±0.35 15.40±0.24 35.47±0.12
3 30.67±0.88 c 48.87±0.44 c 10.17±0.19 c
4 82.59±0.44 c 12.57±0.04a 4.84±0.48 c
도 7에서 도시하는 바와 같이 18시간 처리한 후, 제1그룹은 76.72%의 3T3-L1 지방전구세포가 G0/G1기에 정체했고, 15.36％의 3T3-L1 지방전구세포만 S기에 진입하였고, 제2그룹은 71.89%의 3T3-L1 지방전구세포가 S기에 진입하였고, 제3그룹은 29.64%의 3T3-L1 지방전구세포가 S기에 진입하였고, 제4그룹은 12.21%의 3T3-L1 지방전구세포가 S기에 진입하였다. 24시간 처리 후, 제1그룹의 3T3-L1 지방전구세포는 여전히 G0/G1기에 정체되어 있고, 제2그룹의 3T3-L1 지방전구세포는 35.47%가 G2/M기에 진입하였고, 제3그룹은 10.17%의 3T3-L1 지방전구세포가 G2/M기에 진입하였고, 제4그룹의 3T3-L1 지방전구세포는 4.84%만 G2/M기에 진입하였다. 도 7에서 도시하는 바와 같이, DMI 유도제는 3T3-L1 지방전구세포의 클론 확장(mitotic clonal expansion)을 유발할 수 있고, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 DMI 유도제로 인해 유발된 클론 확장 현상을 지연시킴으로써, 세포주기를 G1/G1기에 정체시켜 3T3-L1 지방전구세포 분화에 영향을 주어 지방생성을 억제할 수 있다.
실시예 7: 비만 쥐 동물 모델 제조
적정수량의 4주령 C57BL/6 수컷 쥐를 4개 그룹으로 나누어 각기 다른 사육조건에서 사육한다. 여기에서 제1그룹은 대조군으로서 사료 및 물만 주고, 제2그룹은 고지방 사료 및 물을 주고, 제3그룹은 고지방 사료, 물 및 1kg당 250mg 용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 주고, 제4군은 고지방 사료, 물, 1kg당 10g의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 준다. 각 그룹의 쥐를 10주간 사육하고 매주 각 그룹 쥐의 중량을 측정한다. 도 8에서 도시하는 바와 같이, 각 그룹 쥐의 섭식량 통계는 도 9에서 도시하는 바와 같고, 10주차에 각 그룹 쥐의 외관을 촬영한 것은 도 10의 A 내지 D에서 도시하는 바와 같다.
도 8 내지 도 10에서 도시하는 바와 같이, 0주차 내지 10주차 사육과정에 있어서 각 그룹 쥐가 섭취한 사료량은 큰 차이가 없었다. 체중변화 측면에 있어서 제1그룹 쥐의 체중은 20,27g에서 28.31g으로 8.04g 증가하였고, 제2그룹 쥐의 체중은 19.93g에서 35.11g으로 15.18g 증가하였고, 제3그룹 쥐의 체중은 19.15g에서 27.18g으로 8.03g 증가하였고, 제4그룹 쥐의 체중은 19.32g에서 27.18g으로 7.86g 증가하였다. 사육과정이 10주차를 지나자, 제2그룹 쥐의 외관은 제1그룹 쥐 외관보다 현저하게 커졌고, 제3그룹 및 제4그룹의 쥐 외관은 각각 제2그룹 쥐 외관보다 작아졌고, 제4그룹 쥐 외관은 제1그룹 쥐 외관과 더욱 유사하였다. 따라서, 상기 결과에 있어서, 고지방 사료를 먹이면 확실히 비만 쥐가 제조되고, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 먹이면 비만 쥐의 체중 증가가 억제될 수 있다는 것을 알 수 있다. 다시 말해, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에는 체중증가 억제 효능이 있다.
실시예 8: 각 그룹 쥐의 각 장기 중량 분석
실시예 7의 각 그룹 쥐를 특성에 따라 분류한 후 각 그룹 쥐의 간, 신장, 비장 중량을 기록한 결과는 아래 표 2에서 도시하는 바와 같다.
표2는 각 그룹 쥐의 장기 중량을 나타낸다.
장기 제1그룹 제2그룹 제3그룹 제4그룹
간 1.14 ± 0.17 1.47 ± 0.07# 1.30 ± 0.16 1.23 ± 0.08*
신장 0.45 ± 0.02 0.54 ± 0.05# 0.44 ± 0.05* 0.40 ± 0.03
비장 0.06 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.02 0.07 ± 0.01
표 2에서 도시하는 바와 같이 제1그룹 쥐와 비교할 때 제2그룹 쥐의 간 및 신장 중량이 각각 0.33g 및 0.06g 증가하였고, 여분의 지방이 장기 내에 축적되어 장기 중량을 증가시킨 것으로 나타났다. 제2그룹 쥐와 비교할 때 제3그룹 쥐의 간 및 신장 중량은 각각 0.17g 및 0.10g 감소하였고, 제4그룹 쥐의 간 및 신장 중량은 각각 0.24g 및 014g 감소하였고, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 먹이면 지질이 간 및 신장 등의 장기에 축적되는 것을 억제하는 효능이 있으며, 섭식량이 증가할수록 상기 효능이 더욱 현저해지는 것으로 나타났다. 또한, 제1그룹 내지 제4그룹 쥐의 비장 중량은 모두 현저한 차이가 없었으므로 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에는 독성이 없는 것으로 나타났다.
실시예 9: 각 그룹 쥐 체내지방 분석
실시예 7의 각 그룹 쥐를 특성에 따라 분류하고 각 그룹 쥐의 생식선, 복부, 장관의 백색지방조직을 취하여 각 상기 부위의 지방조직 외관을 관찰한 결과는 도 11 및 도 12에서 도시하는 바와 같다. 여기에서, 도 11의 A 내지 D는 순서대로 각각 제1그룹 내지 제4그룹 쥐의 생식선 지방 외관을 도시한 것이고, 도 12 A 내지 D는 순서대로 제1그룹 내지 제4그룹의 복부 지방 외관을 도시한 것이다. 또한, 각 그룹 쥐의 생식선, 복부, 장관의 지방 중량을 측정한 결과는 다음과 같다. 제1그룹 쥐의 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 0.60g, 0.06g, 0.34g이고, 제2그룹 쥐 쥐의 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 1.65g, 0.56g, 0.67g이고, 제3그룹 쥐의 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 0.79g, 0.21g, 0.39g이고, 제4그룹 쥐의 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 0.42g, 0.06g, 0.27g이다. 중량 측정 결과의 통계는 도 13 내지 도 15에서 도시하는 바와 같고, 여기에서 도 13은 각 그룹 쥐 생식선 지방 중량의 측정결과이고, 여기에서 도 14는 각 그룹 쥐 복부 지방 중량의 측정결과를 도시한 것이고, 도 15는 각 그룹 쥐 장관 지방 중량 측정 결과를 도시한 것이다.
도 12 내지 도 13에서 도시하는 바와 같이, 제1그룹의 생식선 및 복부 지방 외관과 비교할 때 제2그룹의 생식선 및 복부 지방 외관은 현저하게 커졌으나, 제2그룹의 생식선 및 복부 지방 외관과 비교할 때 제3그룹 및 제4그룹의 생식선 및 복부 지방 외관은 각각 현저하게 작아졌다. 다시 말해, 도 13 내지 도 14에서 도시하는 바와 같이, 제1그룹 쥐 생식선, 복부, 장관의 지방 중량과 비교할 때 제2그룹 쥐 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 1.05g, 0.05g, 0.33g 증가하였고, 제2그룹 쥐 생식선, 복부, 장관의 지방 중량과 비교할 때 제3그룹 쥐 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 0.86g, 0.35g, 0.26g 감소하였고, 제4그룹 쥐 생식선, 복부, 장관의 지방 중량은 각각 1.23g, 0.50g, 0.38g 감소하였다. 도 11 내지 도 15에서 도시하는 바와 같이, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방조직확장을 억제하는 효능이 있고, 용량이 증가할수록 상기 효능도 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 10: 각 그룹 쥐의 혈청생화학검사
실시예 7의 각 그룹 쥐를 특성에 따라 분류한 후 각 그룹 쥐의 혈액을 취하여 원심분리하여 혈청을 획득하고, 혈청 내의 글루타민산 옥살로초산 트란스아미나제(GOT), 글루타민산 피루빈산 트란스아미나제(GPT), 트리글리세리드(TG), 총콜레스테롤(T-cho) 등 간기능 생화학 지표를 이용하여 분석한 결과는 아래 표 3에서 도시하는 바와 같다.
표 3은 각 그룹 쥐의 간기능 생화학 지표 함량을 나타낸다.
그룹 GOT
(U/L)		 GPT
(U/L)		 TG
(mg/dl)		 T-cho
(mg)
1 77.40 ± 9.15 19.00 ± 2.12 89.60 ± 28.61 80.60 ± 16.22
2 73.80 ± 29.02 29.80 ± 2.86# 117.20 ± 20.87 140.20 ± 15.30#
3 78.80 ± 15.78 27.20 ± 3.96 111.40 ± 13.31 130.40 ± 13.77
4 54.00 ± 13.69 25.60 ± 8.56 89.00 ± 21.42 119.00 ± 6.36*
표 3에서 도시하는 바와 같이, 제2그룹 쥐는 제1그룹 쥐와 비교할 때 상기 GPT, TG 및 T-cho의 농도가 각각 비교적 상승하였고, 제3그룹 및 제4그룹 쥐는 각각 제1그룹 쥐와 비교할 때 GOT, GPT, TG 및 T-cho가 모두 각각 감소하였다. 따라서, 표 3에서 도시하는 바와 같이, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방간 병변의 리스크를 감소시키고 지방축적을 감소시키는 효능이 있고, 상기 효능은 섭식량이 증가할 수록 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 11: 각 그룹 쥐의 간 절편 분석
실시예 7의 각 그룹 쥐를 특성에 따라 분류한 후 각각의 간을 취하고, 각 그룹 쥐의 간을 포말린으로 고정시킨 후 다시 파라핀 포매로 절편을 만든다. 그 후 각 그룹 쥐의 간 절편을 탈랍시킨 후 헤마톡실린-에오진 염색제로 염색한 결과는 도 16에서 도시하는 바와 같다. 여기에서, 도 16의 A 내지 D는 순서대로 제1그룹 내지 제4그룹 쥐의 간 절편 염색의 결과를 도시한 것이다.
도 16에서 도시하는 바와 같이, 제1그룹의 간세포와 비교할 경우, 제2그룹의 간세포 배열이 현저하게 다르고, 상기 내부에 대량의 기름방울이 축적되어 간 병변을 일으켰으나, 저용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 섭취한 제3그룹 쥐의 간 절편에서는 축적된 기름방울이 비교적 감소하였고, 고용량의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 섭취한 제4그룹 쥐의 간 절편에서는 내부에 축적된 기름방울이 대폭 감소하였을 뿐만 아니라, 간세포의 배열이 정상상태의 경향을 보였다. 따라서, 도 16에서 도시하는 바와 같이, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에는 간지방 병리상태를 개선하는 효능이 있고, 상기 효능은 섭식용량이 증가할 수록 향상되는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 있어서 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 지방분해와 지방성숙을 억제하고 지방간을 개선하고 지방축적을 저하시키는 효능이 있으므로, 약물의 유효성분으로 사용할 경우 비만 억제 또는 지방간 치료의 목적을 달성할 수 있다. 그 외, 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물은 천연식물에서 유래하여 세포에 대해 독성이 없으므로 개체에 대한 부작용을 감소시키며, 식품 구성성분으로 사용하여 일상생활의 영양보조식품으로 조제할 경우 비만 예방 및 지방간 개선의 목적을 달성할 수 있다.
상기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범주 내에서 본 발명의 실시에에 대하여 진행한 수정 또는 변경은 모두 본 발명의 특허청구범위 내에 속한다.

Claims (20)

  1. 비만을 치료하는 의약 조성물에 있어서,
    하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본(hydroxyl polymethoxylflavones, HPMFs) 화합물 또는 상기 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 물질, 또는 약학적으로 수용할 수 있는 운반체 및 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물이 감귤속 식물의 과피에서 유래한 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 감귤속 식물이 유자, 만다린(mandarin), 탄제린(tangerine), 오렌지 또는 레몬 등에서 자유롭게 선택한 군집인 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에 있어서,
    a. 미리 정한 양의 감귤속 식물 과피의 추출물을 취하는 단계;
    b. 상기 단계 a에 있어서 상기 과피 추출물을 알코올로 용해하고, 염산을 첨가하여 혼합액을 만드는 단계;
    c. 상기 혼합액에 대해 가열 환류 반응을 진행하는 단계;
    d. 상기 혼합액에서 상기 알코올을 제거하고 유기용제와 물로 추출하는 단계; 및
    e. 상기 단계 d에 있어서 유기용제층을 수집하고, 정제하여 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 유기용제는 아세트산 에틸인 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 의약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항 중의 유효량의 상기 의약 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 비만을 치료하는 방법.
  8. 지방간을 치료하는 의약 조성물에 있어서,
    하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물 및 상기 약학적으로 수용할 수 있는 염류 또는 상기 형태에서 임의의 비율로 조제한 물질, 또는 약학적으로 수용할 수 있는 운반체를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물이 감귤속 식물의 과피에서 유래한 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 감귤속 식물이 유자, 만다린, 탄제린, 오렌지 또는 레몬 등에서 자유롭게 선택한 군집인 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에 있어서,
    a. 미리 정한 양의 감귤속 식물 과피의 추출물을 취하는 단계;
    b. 상기 단계 a에 있어서 상기 과피 추출물을 알코올로 용해하고, 염산을 첨가하여 혼합액을 만드는 단계;
    c. 상기 혼합액에 대해 가열 환류 반응을 진행하는 단계;
    d. 상기 혼합액에서 상기 알코올을 제거하고 다시 유기용제와 물로 추출하는 단계; 및
    e. 상기 단계 d에 있어서 상기 혼합액의 유기용제층을 수집하고, 정제하여 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 알코올은 아세트산 에틸인 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 의약 조성물.
  14. 제8항 내지 제13항의 어느 한 항 중의 유효량의 상기 의약 조성물을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 지방간을 치료하는 방법.
  15. 영양보조식품으로서,
    적어도 한 종류의 대사증후군과 관련 있는 증상을 예방 또는 개선하는 데에 사용하고,
    적어도 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물이 감귤속 식물의 과피에서 유래한 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 감귤속 식물이 유자, 만다린, 탄제린, 오렌지 또는 레몬 등에서 자유롭게 선택한 군집인 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물에 있어서,
    a. 미리 정한 양의 감귤속 식물 과피의 추출물을 취하는 단계;
    b. 상기 단계 a에 있어서 상기 과피추출물을 알코올로 용해하고, 염산을 첨가하여 혼합액을 만드는 단계;
    c. 상기 혼합액에 대해 가열 환류 반응을 진행하는 단계;
    d. 상기 혼합액에서 상기 알코올을 제거하고 다시 유기용제와 물로 추출하는 단계; 및
    e. 상기 단계 d에 있어서 상기 혼합액의 유기용제층을 수집하고, 정제하여 하나의 히드록시기 폴리메톡시플라본 화합물을 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 알코올은 아세트산 에틸인 것을 특징으로 하는 영양보조식품.
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