CN115363030B - 一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂及其应用。所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，包含马鞭草酮迷迭香精油，其中，马鞭草酮迷迭香精油的处理浓度为200～1000μL/mL，本发明的研究结果表明马鞭草酮迷迭香精油具备作为一种安全、绿色、高效的桔小实蝇诱杀剂的潜质，为开发新型桔小实蝇田间防控策略提供了新思路、新技术，为研发高效、安全、长效的桔小实蝇诱杀剂防控桔小实蝇提供技术支撑。

Description

一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂及其应用。

背景技术

桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)是一种世界性的检疫性重要害虫，给果蔬业和花卉业造成严重的经济损失(李夕英等，2012；Shen et al.,2012)。桔小实蝇对水果和蔬菜造成的为害主要表现为雌虫产卵于果皮下后其幼虫潜居果瓤取食直至化蛹，蛹处于土壤中，因此化学防治存在一定的障碍，且该虫田间种群已对有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯和阿维菌素等农药产生了严重的抗药性(Jin et al.,2011；Vontas et al.,2011)。根据持续控制、安全有效的防治思路，防控成虫是目前防治桔小实蝇的主要策略。

甲基丁香酚(Methyl eugenol，ME)是一种天然的苯基丙烷化合物，对桔小实蝇性成熟雄虫有强烈的引诱作用，被广泛应用于监测、诱杀、根除桔小实蝇田间种群(Lin etal.,2012；Pagadala et al.,2012；Shen et al.,2012)。但研究发现，ME是一种致癌物质，长期田间使用必然会对人类健康造成威胁，且ME对非靶标生物表现出一定的诱杀活性(Zheng et al.,2012)。因此，研发新型、绿色桔小实蝇引诱剂迫在眉睫。

植物精油是指从植物组织中提取的一类具有挥发性的小分子油状次生代谢物质，自然界中资源较为丰富，同时兼具绿色安全、污染低、环境友好、可降解等特性，对害虫有驱避、拒食、引诱、触杀和产卵忌避的作用，在农业害虫、储粮害虫、卫生害虫防控等领域均受到研究者越来越多的关注。已有研究表明，植物精油对绿豆象、赤拟谷盗、蓝莓果蝇、烟草甲、小菜蛾等多种农业害虫具有引诱和驱避的行为反应。将植物精油微胶囊化，能有效防止其氧化和降解，并且能够控制植物精油缓慢释，从而增强其功能活性。因此，筛选具有引诱活性的植物精油对防控桔小实蝇具有重要的现实意义。

此外，值得注意的是，由于环境中农药污染会对人类产生毒理学后果，因此环境毒理学有必要阐明农药对哺乳动物的毒性作用和规律。因此，评价农用化学品对环境中非靶标生物的毒性是开发和应用新药剂的重要环节。

发明内容

为了克服现有防控技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂。

本发明的另一目的在于提供上述桔小实蝇雌雄双诱引诱剂在桔小实蝇防控中的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用桔小实蝇雌雄双诱引诱剂防控桔小实蝇的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，包含马鞭草酮迷迭香精油；

所述的马鞭草酮迷迭香精油的处理浓度优选为200～1000μL/mL；

所述的马鞭草酮迷迭香精油的处理浓度进一步优选为200～800μL/mL；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂优选针对16-32日龄的桔小实蝇成虫；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂优选针对16日龄的桔小实蝇雄成虫和雌成虫；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的作用时间优选为9:00-11:00am；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，优选包含马鞭草酮迷迭香精油、阿拉伯明胶、多孔淀粉、高脂膜和纳米蒙脱土；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的制备方法，优选包含如下步骤：

(1)以体积分数为5％的吐温80为乳化剂和助溶剂，配制马鞭草酮迷迭香精油溶液；

(2)将多孔淀粉、高脂膜、纳米蒙脱土、马鞭草酮迷迭香精油溶液和阿拉伯明胶溶液混匀后，超声处理，然后再次快速搅拌，得到桔小实蝇雌雄双诱引诱剂；

步骤(1)张所述的马鞭草酮迷迭香精油溶液中马鞭草酮迷迭香精的浓度优选为200～1000μL/mL；

所述的多孔淀粉、高脂膜、纳米蒙脱土、马鞭草酮迷迭香精油溶液、阿拉伯明胶的质量比为500:100:50:94:1；

所述的超声处理的条件优选为功率300W，频率40kHz；

所述的搅拌的条件优选为以2000r/min的搅拌速度，使各组分均匀混合，形成均匀稳定的乳化液；

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂在桔小实蝇防控中的应用；

一种利用桔小实蝇雌雄双诱引诱剂防控桔小实蝇的方法，包含如下步骤：

(1)当桔小实蝇成虫处于16日龄时，选择9:00-11:00am时间段采用桔小实蝇雌雄双诱引诱剂对桔小实蝇进行诱捕，进而达到防控桔小实蝇的目的；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)为了筛选对桔小实蝇成虫有显著引诱活性的植物精油，本研究通过室内诱捕法比较了9种芳香植物精油对桔小实蝇成虫的引诱活性，结果显示：桔小实蝇性成熟成虫对马鞭草酮迷迭香精油的趋向性最强，不同浓度的马鞭草酮迷迭香精油对桔小实蝇性成熟成虫均有明显的引诱作用，在400μL/mL时的引诱活性最强，总引诱率高达73.50±3.32％，对雌、雄成虫的引诱率分别为63.00±4.06％和84.00±2.92％，且雄成虫对不同浓度马鞭草酮迷迭香精油的趋向性显著高于雌成虫。

(2)本发明进一步探明了马鞭草酮迷迭香精油对桔小实蝇的引诱规律，其中，性成熟雌、雄成虫在白天活动期对马鞭草酮迷迭香精油的趋性最强。

(3)本发明利用Y型嗅觉仪选择行为试验测定了马鞭草酮迷迭香精油对天敌瓢虫的引诱活性，同时利用人胚肺成纤维细胞HFL1和小鼠肝细胞BNL-CL.2测定了马鞭草酮迷迭香精油对非靶标生物离体培养细胞系的毒力，结果显示：马鞭草酮迷迭香精油对七星瓢虫没有诱杀活性，同时对人胚肺成纤维细胞HFL1和小鼠肝细胞BNL-CL.2没有显著细胞毒性。

(4)本发明探究了微胶囊化制备对马鞭草酮迷迭香精油的缓释效果。结果表明，此外，以吐温80为乳化剂和助溶剂，用多孔淀粉、阿拉伯明胶、高脂膜和纳米蒙脱土等天然壁材载体与马鞭草酮迷迭香精油进行包埋后，有效控制了精油的释放，显著延长了马鞭草酮迷迭香精油引诱桔小实蝇的活性时间。

(5)本发明的研究结果表明马鞭草酮迷迭香精油具备作为一种安全、绿色、高效的桔小实蝇诱杀剂的潜质，为开发新型桔小实蝇田间防控策略提供了新思路、新技术，为研发高效、安全、长效的桔小实蝇诱杀剂防控桔小实蝇提供技术支撑。

附图说明

图1是诱捕法测定桔小实蝇性成熟成虫对不同植物精油趋性的结果分析图，其中，(A)马鞭草酮迷迭香精油；(B)栀子花精油；(C)梨花精油；(D)菊花精油；(E)桃花精油；(F)茉莉花精油；(G)桂花精油；(H)玫瑰花精油；(I)月季精油，柱上字母不同者表示在0.05水平差异性显著(邓肯氏新复极差法，P<0.05)，每次试验重复5次。

图2是诱捕法测定桔小实蝇雌、雄成虫对不同植物精油趋性的结果分析图，其中，(A)马鞭草酮迷迭香精油；(B)栀子花精油；(C)梨花精油；(D)菊花精油；(E)桃花精油；(F)茉莉花精油；(G)桂花精油；(H)玫瑰花精油；(I)月季精油，ns代表无显著性差异，*表示在0.05水平差异性显著，**表示在0.01水平差异性显著，***表示在0.001水平差异性显著(t-test)，每次试验重复5次。

图3是马鞭草酮迷迭香精油对不同羽化日龄的成虫的引诱作用的结果分析图，其中，(A)雄虫；(B)雌虫。柱上字母不同者表示在0.05水平差异性显著(P<0.05)，每次试验重复5次。

图4是羽化16d性成熟成虫对马鞭草酮迷迭香精油趋性的日节律性的结果分析图，其中，(A)雄虫；(B)雌虫。柱上字母不同者表示在0.05水平差异性显著(P<0.05)，每次试验重复5次。

图5是性成熟成虫交配前后对马鞭草酮迷迭香精油趋性的结果分析图，其中，(A)雄虫；(B)雌虫，ns代表无显著性差异，*表示在0.05水平差异性显著，**表示在0.01水平差异性显著，***表示在0.001水平差异性显著(t-test)，每次试验重复5次。

图6是Y型嗅觉仪测定瓢虫对马鞭草酮迷迭香精油趋性的结果分析图，其中，NR代表没有行为选择的瓢虫试虫数量，ns代表无显著性差异，*表示在0.05水平差异性显著，**表示在0.01水平差异性显著，***表示在0.001水平差异性显著(Chi-square test)，每次试验重复5次。

图7是马鞭草酮迷迭香精油对HFL1和BNL-CL.2细胞毒杀活性结果分析图，其中，(A)马鞭草酮迷迭香精油对小鼠肝细胞BNL-CL.2的毒力；(B)马鞭草酮迷迭香精油对人胚肺成纤维细胞HFL1的毒力，柱上字母不同者表示在0.05水平差异性显著(邓肯氏新复极差法，P<0.05)，每次试验重复5次。

图8是微胶囊化制备对马鞭草酮迷迭香精油的缓释作用的结果分析图，其中，处理组1代表多孔淀粉：高脂膜：纳米蒙脱土：马鞭草酮迷迭香精油溶液：阿拉伯明胶质量比为500:100:50:94:1；处理组2代表多孔淀粉：高脂膜：纳米蒙脱土：马鞭草酮迷迭香精油溶液：阿拉伯明胶质量比为400:200:50:94:1；处理组3代表多孔淀粉：高脂膜：纳米蒙脱土：马鞭草酮迷迭香精油溶液：阿拉伯明胶质量比为250:250:150:94:1；处理组4代表多孔淀粉：高脂膜：纳米蒙脱土：马鞭草酮迷迭香精油溶液：阿拉伯明胶质量比为200:200:250:94:1；将马鞭草酮迷迭香精油滴加到脱脂棉作为对照组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及的供试昆虫和实验试剂具体如下：

(1)供试昆虫：桔小实蝇遗传性别品系(GSS)，在河南科技大学昆虫生态实验室已人工饲养30代左右，雌虫的蛹为白色，雄虫的蛹为褐色。人工饲养条件：饲养室温度为27±1℃，相对湿度为75％，光周期为14L：10D。

(2)试验试剂：植物精油，雅克耶提芳香医药科技(青岛)有限公司；多孔淀粉、阿拉伯明胶、高脂膜和纳米蒙脱土，上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇，天津科密欧公司产品。

(3)实验细胞：HFL1细胞系源自人胚胎肺细胞，BNL-CL.2细胞系源自小鼠胚胎肝细胞，已经过多代继代培养，均购置于武汉普诺赛生命科技有限公司。

实施例1

一、实验方法：

(1)室内诱捕法测定9种植物精油对桔小实蝇成虫的引诱活性

以体积分数为5％的吐温80为乳化助溶剂，将9种植物精油(马鞭草酮迷迭香精油、栀子花精油、梨花精油、菊花精油、桃花精油、茉莉花精油、桂花精油、玫瑰花精油和月季精油)配制成不同浓度的植物精油溶液(1000、800、400、200、100、50μL/mL)。然后，每个处理组随机选择40头羽化16d的性成熟桔小实蝇成虫(雌雄比例为1：1)，放于30cm×30cm×30cm的养虫笼中，适应30min后，将含有200μL植物精油溶液的诱捕器放于笼中央，对照组放置仅含等量体积分数为5％的吐温80的诱捕器。处理2h后，统计不同植物精油处理组和对照组诱捕器中总成虫、雌成虫、雄成虫的数量，比较不同植物精油对桔小实蝇的引诱活性，以明确高活性精油种类及其引诱桔小实蝇的最佳试验浓度。保持试验光照强度为100lux，温度27±1℃，RH 75±1％，每处理独立5次生物学重复。

(2)羽化日龄对桔小实蝇雌、雄成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油影响的测定

随机选择不同羽化日龄(2d、4d、6d、12d、16d、24d、32d)的桔小实蝇雌、雄成虫各40头，分别放于30cm×30cm×30cm的养虫笼中，适应30min后，分别将含有200μL马鞭草酮迷迭香精油溶液(400μL/mL)的诱捕器放于笼中央，对照组放置仅含等量体积分数为5％的吐温80的诱捕器。处理2h后，统计不同处理组和对照组诱瓶中桔小实蝇的数量，分析比较日龄对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油的影响。控制试验光照强度为100lux，温度27±1℃，RH 75±1％，每处理独立5次生物学重复。

(3)日节律对桔小实蝇雌、雄成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油影响的测定

为了研究日节律对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油的影响，采用上述室内诱捕法分别在同一天9:00am、13:00pm和17:00pm时间段检测马鞭草酮迷迭香精油(400μL/mL)对羽化16d雌、雄成虫的引诱活性。控制试验温度27±1℃，RH 75±1％，每处理独立5次生物学重复。

(4)交配行为影响桔小实蝇雌、雄成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油的测定

此外，为了研究交配行为对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油的影响，采用上述室内诱捕法分别检测马鞭草酮迷迭香精油(400μL/mL)在最佳引诱时间段对性成熟已交配成虫和性成熟未交配成虫的引诱活性。控制试验光照强度为100lux，温度27±1℃，RH75±1％，每处理独立5次生物学重复。

(5)马鞭草酮迷迭香精油对天敌七星瓢虫的引诱作用

利用Y型嗅觉仪选择行为法测试天敌七星瓢虫1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、成虫对马鞭草酮迷迭香精油的选择行为反应。Y型嗅觉仪由玻璃管制成，内径3cm，主臂长为30cm，两测试臂长均为20cm，两者夹角为60°。两臂分别连接规格一致的玻璃容器，分别放置味源物和对照，含有100μl马鞭草酮迷迭香精油(400μL/mL)脱脂棉球作为味源，含有等量体积分数为5％的吐温80的脱脂棉球作为对照，进入管中的空气经过活性炭过滤和蒸馏水加湿，每臂空气流量计调为100mL/min。选择标准为5min内试虫沿着柄端爬行到两臂交接处，选择一臂进入超过1/3处，并停留30s即确定为做出选择；如果停留在交接处超5min没有选择则确定为无反应，记录为0。每10头虫作为一组(瓢虫幼虫无法区分雌雄，成虫雌雄比例为1：1)，重复5组。按公式1计算选择反应率。为避免光对试虫选择的影响，Y型玻璃管部分放置于纸盒中让试虫在黑暗环境中选择。测定一组试虫后用丙酮和蒸馏水冲洗Y型管，烘干后调换两臂与味源位置，以避免Y型管不对称造成的误差。保持试验温度27±1℃，RH 75±1％。

(6)马鞭草酮迷迭香精油对非靶标人源和鼠源正常细胞系的毒力测定

采用MTT检测法测定马鞭草酮迷迭香精油对人胚肺成纤维细胞HFL1、小鼠肝细胞BNL-CL.2的毒性。马鞭草酮迷迭香精油用少量DMSO溶解，用细胞培养基稀释药液，控制稀释液中DMSO最终含量为0.5％(体积分数)，以含0.5％(体积分数)DMSO的细胞培养基为对照。于96孔培养板中加入100μL处于对数生长期的细胞悬浮液(1×10⁵个/mL)，孵育24h待细胞贴壁后，翻转96孔培养板将原培养液倒出，然后每孔加入100μL含有不同浓度药剂的培养液，每个处理设10次重复。在37℃CO₂细胞培养箱中分别培养24h后，每孔加入5mg/mL MTT20μL，轻微震荡后继续培养4h，弃去孔内上清液，每孔分别加入100μL DMSO溶液，置室温避光孵育30min，等到紫色结晶物完全溶解后，在酶标仪上(n＝570nm)测定各孔吸收值(OD值)，按公式(2)计算细胞增殖抑制率：

(7)马鞭草酮迷迭香精油GC-MS分析条件

采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)对马鞭草酮迷迭香精油化学组分进行定性定量分析。气相色谱GC条件：色谱柱为HP-5ms石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：起始温度40℃，保持2min，后运行70℃，再以5℃/min升温至150℃，保持1min，再以10℃/min升温至250℃，于250℃保持4min。载气为高纯氦气，载气模式为恒流模式，流量1.0mL/min；进样口温度250℃；分流比4：1；溶剂延迟3.5min；进样量为1.0μL。

质谱MS条件：电离源为标准EI源，电子能量70eV，采用全扫描方式，扫描范围33-350amu；离子源温度220℃，四极杆温度为150℃。采用峰面积归一化法确定组分的相对含量，通过检索NIST17化学工作站标准质谱图库，参阅有关文献，鉴定组分的化学结构。

(8)数据处理

试验数据应用SAS 9.20数据处理平台(SAS Institute Inc.Cary.NC)统计分析，所有的数据都用夏皮罗-威尔克(Shapiro-Wilk)法进行正态分布检验，用Levene测试来检测数据的方差齐性。符合正态分布和方差齐同的数据进行方差分析(One-way analysis ofvariance，ANOVA)，并用邓肯氏新复极差法(Duncan’s multiple range test，DMRT，P＝0.05)和t-检验(P＝0.05)对各处理数据进行差异显著性分析。不符合正态分布的数据使用非参数Kruskal-Wallis测试法分析比较中位数，在0.05显著性水平上差异的数据使用Mann-Whitney检验进行成对比较。

二、试验结果：

(1)室内诱捕法测定9种植物精油对桔小实蝇成虫(总数、雌成虫数量、雄成虫数量)的引诱活性

①不同植物精油对桔小实蝇成虫总数的引诱活性

不同植物精油对桔小实蝇成虫诱捕试验结果如图1所示，马鞭草酮迷迭香精油对桔小实蝇成虫的引诱活性最高，而其他8种芳香精油对成虫没有显著的引诱作用。其中，不同浓度的马鞭草酮迷迭香精油对桔小实蝇性成熟成虫均有一定的引诱作用。马鞭草酮迷迭香精油在低浓度(50μL/mL)时的引诱率为30.50±2.15％。在50～400μL/mL浓度范围内，随着马鞭草酮迷迭香精油浓度的增加，其对成虫的引诱作用明显增强，400μL/mL马鞭草酮迷迭香精油对成虫的诱捕率最高(73.50±3.32％)，与其他浓度的诱捕率相比差异性显著(F＝24.54；df＝5；P<0.0001)。

②桔小实蝇雌、雄成虫对不同精油的趋向性比较

在(1)的基础上，进一步对雌、雄成虫分别进行统计、分析，其中，桔小实蝇雌、雄成虫对不同植物精油趋性的试验结果如图2所示，桔小实蝇雌、雄成虫对桂花精油、玫瑰花精油和月季精油的趋向性较低，且性别之间差异性不显著；在400～1000μL/mL浓度范围内，栀子花精油、桃花精油、茉莉花精油对雄成虫的引诱活性显著高于雌成虫，其中茉莉花在1000μL/mL时对雄成虫的引诱率最高，但仅为31.00±1.87％。相比之下，马鞭草酮迷迭香精油对桔小实蝇雌、雄成虫均有显著的引诱活性，雄成虫对不同浓度马鞭草酮迷迭香精油的趋向性显著高于雌成虫，400μL/mL马鞭草酮迷迭香精油引诱桔小实蝇雌、雄成虫的活性最高，分别为63.00±4.06％和84.00±2.92％。

(2)羽化日龄对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油行为的影响

羽化日龄显著影响桔小实蝇雌、雄成虫对马鞭草酮迷迭香精油的趋性，如图3所示，刚羽化2-6日龄成虫对鞭草酮迷迭香精油的趋性较低；随着雌、雄成虫日龄的增加，其对马鞭草酮迷迭香精油的趋性也逐渐增强，16日龄性成熟雌、雄成虫对400μL/mL马鞭草酮迷迭香精油的趋性率最高，分别为63.50±4.37％和84.50±2.15％，与其他日龄雌、雄成虫对马鞭草酮迷迭香精油的趋性相比差异性显著(F＝115.44；df＝6；P<0.0001；F＝232.14；df＝6；P<0.0001)。此外，32日龄的雌、雄成虫对马鞭草酮迷迭香精油仍有较高的趋性，分别为34.00±3.02％和71.00±1.87％。

(3)日节律对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油行为的影响

日节律影响桔小实蝇雌、雄成虫对马鞭草酮迷迭香精油的趋性如图4所示，结果表明，桔小实蝇性成熟雄虫在9:00am-15:00pm时间段对马鞭草酮迷迭香精油有很强的趋性，其中，桔小实蝇雄虫在早上活动期(9:00-11:00am)对马鞭草酮迷迭香精油的趋性最强(84.50±2.15％)，而在傍晚求偶期(17:00pm)对马鞭草酮迷迭香精油的趋性最弱(10.0±0.79％)(F＝188.30；df＝2；P<0.0001)。桔小实蝇雌成虫在下午活动期(13:00-15:00pm)对马鞭草酮迷迭香精油的趋性最强(76.50±1.87％)(F＝45.86；df＝2；P<0.0001)。

(4)交配行为对桔小实蝇成虫趋向马鞭草酮迷迭香精油行为的影响

交配行为影响桔小实蝇性成熟雌、雄成虫对马鞭草酮迷迭香精油的趋性如图5所示，结果表明，400μL/mL马鞭草酮迷迭香精油分别对已交配和未交配雌、雄成虫的引诱率无显著性差异。

(5)马鞭草酮迷迭香精油对天敌七星瓢虫的引诱活性

Y型嗅觉仪选择行为试验结果如图6所示。结果表明，七星瓢虫2龄、3龄幼虫和成虫对400μL/mL马鞭草酮迷迭香精油和对照体积分数为5％的吐温80 选择反应率差异性不显著，1龄幼虫和4龄成虫对马鞭草酮迷迭香精油的选择率分别为38.57±6.27％(χ²＝5.23,df＝1,P＝0.0223)和35.67±11.35％(χ²＝58.21,df＝1,P<0.01)，显著低于对照组。此外，绝大多数瓢虫幼虫和成虫没有作出选择行为，结果表明马鞭草酮迷迭香精油对瓢虫成虫和幼虫没有明显引诱活性。

(6)马鞭草酮迷迭香精油对人胚肺细胞HFL1和小鼠肝细胞BNL-CL.2的细胞毒力

采用MTT法测定了马鞭草酮迷迭香精油对HFL1与BNL-CL.2细胞的毒性。由图7-A可知，高浓度(500μg/mL和1000μg/mL)马鞭草酮迷迭香精油处理24h后，BNL-CL.2细胞存活率分别高达88.07±1.41％和85.98±1.01％，IC₅₀为66930.69μg/mL(表1)；高浓度(500μg/mL和1000μg/mL)马鞭草酮迷迭香精油处理24h后，HFL1细胞存活率分别高达88.57±0.66％和84.99±0.60％(图7-B)，IC₅₀为74153.42μg/mL(表1)。该研究结果验证了马鞭草酮迷迭香精油对对BNL-CL.2和HFL1细胞没有明显的细胞毒性，对非靶标生物是安全的，具备研发桔小实蝇环境友好型诱杀剂的重要潜质。

表1.马鞭草酮迷迭香精油对BNL-CL.2、HFL1细胞的毒力

(7)马鞭草酮迷迭香精油GC-MS分析结果

利用GC-MS对马鞭草酮迷迭香精油化学组分进行分析，利用NIST17质谱解析软件及人工辅助分析确定化合物的结构，剔除匹配度≤80％的物质，最终马鞭草酮迷迭香中共确定27种成分。其中，含量较多的分别为马鞭草烯酮、桉叶油醇、莰烯、莰酮、D-萜二烯、庚烷，占比分别为29.32％、13.81％、7.52％、7.13％、4.29％、4.12％，分析结果见表2。

表2马鞭草酮迷迭香精油成分GC-MS分析

实施例2马鞭草酮迷迭香精油粉末微球的制备及缓释效果测定

(1)马鞭草酮迷迭香精油粉末微球的制备

用体积分数为5％的吐温80配制终浓度为400μL/mL的马鞭草酮迷迭香精油溶液，称取阿拉伯明胶200mg溶于10mL蒸馏水中备用；然后，分别按照表3精确称取各壁材组分于带盖离心管中，加入500μL马鞭草酮迷迭香精油溶液(400μL/mL)和100μL阿拉伯明胶溶液(20mg/mL)，在功率300W、频率40kHz条件下超声10min，再以2000r/min的机械搅拌速度快速均匀搅拌20min，使壁材载体充分吸附马鞭草酮迷迭香精油溶液，即得到马鞭草酮迷迭香精油粉末微球。

(2)马鞭草酮迷迭香精油粉末微球的缓释效果测定

以步骤(1)制备的马鞭草酮迷迭香精油粉末微球(为了确保与对照组含有相同质量的马鞭草酮迷迭香质量分数，此处粉末微球的量为1490mg)为处理组诱芯；在离心管中放入适量脱脂棉，滴加500μL浓度为400μL/mL的马鞭草酮迷迭香精油溶液作为对照组诱芯。处理组和对照组诱芯在室温环境下(25±1℃)敞口放置，分别在第0.5、1、4、8、16、24、32d采用室内诱捕法比较其引诱桔小实蝇成虫的活性，每处理独立3次生物学重复，进而评价微胶囊化制备对马鞭草酮迷迭香精油的缓释效果。

表3有效组分不同配比的马鞭草酮迷迭香精油粉末微球

结果发现，以体积分数为5％的吐温80为乳化剂和助溶剂，将马鞭草酮迷迭香精油溶液通过多孔淀粉、阿拉伯明胶、高脂膜和纳米蒙脱土按照不同比例包埋后，对马鞭草酮迷迭香精油有明显的缓释作用(图8)。如图8所示，将马鞭草酮迷迭香精油溶液放置4d后，脱脂棉吸附马鞭草酮迷迭香精油溶液挥发较快，对桔小实蝇成虫的引诱率仅为46.00±3.06％，显著低于马鞭草酮迷迭香精油粉末微球对成虫的引诱率。处理32d后，按照多孔淀粉：高脂膜：纳米蒙脱土：马鞭草酮迷迭香精油溶液：阿拉伯明胶质量比为500:100:50:94:1制备的马鞭草酮迷迭香精油粉末微球对成虫引诱作用显著，引诱率为53.33±1.33％，明显高于其他处理组和对照组(F＝121.37；df＝4；P<0.0010)。结果表明，马鞭草酮迷迭香精油溶液经过微胶囊制备后，其引诱桔小实蝇成虫的活性有效期明显延长，持效期可达32d以上，其中最佳的制备质量配比为500:100:50:94:1。

害虫行为调控的方法已沿用了几个世纪，其中一种有效的方法是引诱剂的应用，引诱剂能引诱害虫、保护靶标作物免受其为害，同时又保护天敌昆虫资源。综合本研究结果，我们发现马鞭草酮迷迭香精油富含特殊的活性成分，对桔小实蝇雌、雄成虫均有强烈的引诱活性，但对天敌瓢虫没有明显诱杀活性，同时对非靶标生物细胞没有毒性，具备开发桔小实蝇高效、安全引诱剂的重要潜力，可在蔬菜、果树等作物上广泛应用，具有广阔的应用前景。而且，马鞭草酮迷迭香精油经过多孔淀粉、阿拉伯明胶、高脂膜、纳米蒙脱土等天然壁材包埋后，其引诱活性时间明显延长。本发明引诱剂具有成本低廉、环保高效、不易产生抗药性等特点，为进一步开发高效环保的桔小实蝇引诱剂、延长引诱剂的缓释时间作为一种有效控制实蝇害虫的方法提供了科学依据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，其特征在于包含马鞭草酮迷迭香精油、阿拉伯明胶、多孔淀粉、高脂膜和纳米蒙脱土；

所述的马鞭草酮迷迭香精油的处理浓度为200~1000 μL/mL；

所述的马鞭草酮迷迭香精油包含如下按相对含量计的组分：

三环烯 0.51%，侧柏酮 0.72%，α-蒎烯 3.5%，莰烯 7.52%，庚烷 4.12%，2,2-二甲基-5-甲基二十二碳烯 1.24%，3-亚甲基-6-（1-甲基乙基）环己烯 1.68%，β-月桂烯 2.89%，α-水芹烯 0.85%，3-蒈烯 0.67%，1,3-环己二烯 0.63%，伞花烃 2.47%，D-萜二烯 4.29%，桉叶油醇 13.81%，萜品烯 0.95%，环己烯 0.53%，芳樟醇 0.81%，莰酮 7.13%，右旋莰醇 3.39%，松油烯 1.13%，松油醇 1.86%，马鞭草烯酮 29.32%，乙酸龙脑酯 3.35%，双环醇 3.67%，蛇麻烯 0.94%，香树烯 1.13%，正十六烷酸 0.87%。

2.根据权利要求1所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，其特征在于：

所述的马鞭草酮迷迭香精油的处理浓度为200~800 μL/mL。

3.根据权利要求1所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，其特征在于：

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂针对16-32日龄的桔小实蝇成虫。

4.根据权利要求1所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，其特征在于：

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂针对16日龄的桔小实蝇雄成虫和雌成虫。

5.根据权利要求1所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂，其特征在于：

所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的作用时间为9:00-11:00 am。

6.权利要求1-5任一项所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）以体积分数为5%的吐温80为乳化剂和助溶剂，配制马鞭草酮迷迭香精油溶液；

（2）将多孔淀粉、高脂膜、纳米蒙脱土、马鞭草酮迷迭香精油溶液和阿拉伯明胶溶液混匀后，超声处理，然后再次快速搅拌，得到桔小实蝇雌雄双诱引诱剂。

7.根据权利要求6所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的马鞭草酮迷迭香精油溶液中马鞭草酮迷迭香精油的浓度为200~1000μl/mL。

8.根据权利要求6所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的制备方法，其特征在于：

所述的多孔淀粉、高脂膜、纳米蒙脱土、马鞭草酮迷迭香精油溶液、阿拉伯明胶的质量比为500:100:50:94:1。

9.根据权利要求6所述的桔小实蝇雌雄双诱引诱剂的制备方法，其特征在于：

所述的超声处理的条件为功率300 W，频率40 kHz。