KR100905408B1

KR100905408B1 - 마이크로비스포라 속 ａ073 균주, 이를 포함하는 식물병방제용 미생물 제제, 및 이를 이용한 식물병의 방제 방법

Info

Publication number: KR100905408B1
Application number: KR1020070104389A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 최경자; 장경수; 최용호; 이선옥
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-07-01
Also published as: KR20090039006A

Abstract

본 발명은 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제, 및 이를 이용한 식물병의 방제 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 마이크로비스포라 속 A073 균주는, 고추 역병, 토마토 잿빛 곰팡이병 및 토마토 역병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로, 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

마이크로비스포라 속 Ａ073 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제, 및 이를 이용한 식물병의 방제 방법{MICROBISPORA SP. A073 STRAIN, MICROORGANISM FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING THE SAME}

본 발명은 식물병에 대해 길항 활성을 갖는 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제, 및 이를 이용한 식물병의 생물학적 방제 방법에 관한 것이다.

일반적으로 작물을 재배하는데 있어서 농약이 필수적으로 사용되며, 농약을 사용하지 않을 경우 작물의 수확량은 30% 이상 감소할 수 있다. 하지만 합성농약의 오남용으로 인해 환경 오염, 잔류 독성, 생태계 교란, 저항성 병해충잡초의 증가 등의 문제가 발생되었으며, 이에 따라 우리나라를 포함한 OECD 국가에서는 합성 농약의 사용량을 줄이고자 하는 친환경 농업정책을 펼치고 있다. 합성농약의 대안책으로는 미생물 농약과 생화학 농약을 포함한 생물 농약이 제안되고 있다.

국내에서는 2006년 12월 현재 미생물 농약으로 살균제 11종과 살충제 16종 등 총 27개 품목이 등록되어 시판되고 있으나, 살충제의 대부분이 수입 제품인 실정이다. 상기 11종의 미생물 살균제들 중 8개 제품은 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주와 패니바실러스 속(Paenibacillus sp.) 세균이고, 2개 제품은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 방선균(actinomycetes)이며, 나머지 한 개의 제품은 암펠로마이세스 퀴스쿠알리스 속(Ampelomyces quisqualis sp.)의 곰팡이이다.

이와 같이 국내에는 방선균을 이용한 미생물 살균제로서 2개의 제품이 시판되고 있으며, 또한 다수의 방선균에 대하여 특허가 등록되어 있다. 하지만 이들의 대부분은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균이다(참조: 대한민국 특허 제 0411185 호; 제 0422883 호; 제 0512480 호; 제 0563298 호; 제 0634874 호). 또한 이들의 대부분은 토양에서 채취한 균인 것으로 알려져 있다.

상기와 같이 토양에서 채취되는 방선균과 달리, 식물 내생 방선균은 식물 내에 서식하면서 식물과 공생관계에 있는 방선균이며, 현재 이를 이용한 미생물 살균제의 개발이 다수의 연구기관에서 수행되고 있다. 호주의 플린더스 대학(Flinders University)의 프랑코(Franco) 교수 연구 그룹은, 표면 살균한 밀 뿌리로부터 식물 내생 방선균을 분리한 후 이들을 밀 종자에 코팅하여 처리한 결과, 다수의 균들이 밀 마름병 및 밀 모잘록병에 높은 효과가 있다고 보고하였다(참조: Coombs et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 5603-5608; Coombs et al., 2004, Biological Control 29: 359-366). 여기서 효과가 있는 대부분의 균들은 스트렙토마이세스 속에 속하였지만, 몇몇 균주들은 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.), 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) 및 노카디오이데스 속(Nocardioides sp.)에 속하였다. 또한, 일본의 큐노(Kunoh) 교수 연구 그룹은, 식물 내생 방선균인 스트렙토마이세스 갈뷰스(Streptomyces galbus) R-5 균주가 파이토프쏘라 속(Phytophthora sp.), 피시움 속(Pythium sp.) 및 라이족토니아 속(Rhizoctonia sp.)에 의해 유묘에 발병하는 대부분의 토양병을 방제하는데 효과가 있다고 보고하였다(참조: Kunoh, 2002, J. Gen. Plant. Pathol. 68: 249-252). 이외에도 중국의 쥬(Zhou) 교수 연구 그룹은, 바나나 뿌리로부터 분리한 식물 내생 방선균 중 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) S96 균주가 바나나 후자리움 시들음병(Fusarium wilt)에 효과가 우수하다고 보고하였다(참조: Kao et al., 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20: 501-504).

본 발명자들은 배추 뿌리에서 분리한 식물 내생 방선균을 가지고 미생물 살균제 개발에 대한 연구를 진행하던 중에 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주가 엽면 살포시 잿빛 곰팡이병과 토마토 역병에 효과가 있으며, 또한 종자에 처리시 고추 역병에도 효과가 매우 우수하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물병에 대해 길항작용을 갖는 신규 마이크로비스포라 속 A073 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 식물병에 대해 길항작용을 갖는 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주 (KCTC 11170BP)를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 균주 또는 이를 포함하는 미생물 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 마이크로비스포라 속 A073 균주는 고추 역병, 토마토 잿빛 곰팡이병 및 토마토 역병 등과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로, 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주(이하, A073 균주로 기재함)는 배추 식물, 바람직하게는 이의 뿌리로부터 분리될 수 있다. 상기 균주는 형태적 특성 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과에 따라 마이크로비스포라로 동정되었으며, 마이크로비스포라 A073로 명명되어 2007년 8월 13일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 11170BP호로서 기탁되었다.

본 발명에 따른 A073 균주는 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 갖는다.

먼저, 본 발명에 따른 A073 균주는 옥수수 한천 배지 상에서 분홍색을 띤다.

또한, 본 발명에 따른 A073 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과, 유전자은행(GeneBank)의 마이크로비스포라 속 AY445641 균주와 99%의 염기서열 상동성(sequence homology)을 보였다.

본 발명에 따른 A073 균주는, 균주 자체, 이의 배양물, 추출물 또는 포자 또는 균사 형태 단독으로 사용하거나, 농약분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하고 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 미생물 제제로서 사용할 수 있다. 상기 담체로는 물, 화이트 카본, 카올린 등을 사용할 수 있으며, 상기 배양물은 액체 배양물 및 고체 배양물을 포함한다.

제형화된 미생물 제제는, 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.

예를 들어, A073 균주의 배양액을 식물의 엽면에 살포할 경우에는, 토마토 잿빛 곰팡이병(Botrytis cinerea)과 토마토 역병(Phytophthora infestans) 등을 방 제할 수 있다. 또한, A073 균주의 포자를 종자에 처리하거나 뿌리에 침지 처리할 경우에는, 고추 역병 등을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 A073 균주는, 대상 식물 또는 토양에 대해 1.0×10³ 세포/㎖ 내지 1.0×10¹¹ 세포/㎖, 바람직하게는 3.7×10⁵ 세포/㎖ 내지 3.3×10⁹세포/㎖의 양으로 처리하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물 내생 방선균의 분리

2005년 전국의 다양한 지역의 토양을 채취하여 여기에 배추를 파종한 다음, 온실에서 두 달간 키운 후에 배추로부터 식물 내생 방선균을 분리하였다. 식물 내생 방선균의 분리는, 문헌[Coombs and Franco, 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 5603-5608]에 기재된 방법으로 실시하였다. 먼저, 식물 조직을 48시간 동안 건조시킨 다음, 초음파 세척을 통하여 흙을 완전히 제거하였다. 원하는 조직을 잘라서 세 가지 단계로 표면 살균을 실시하였다. 먼저 99%의 에탄올에 60초간 침지하고, 3.125% NaOCl에 6분간 침지한 다음, 다시 99% 에탄올에 30초간 침지한 후, 마지막으로 멸균수로 세척하였다. 각각의 조직을 1 cm의 길이로 자른 후, 분리용 배지인 HV 한천 배지(humic acid-vitamin B agar) (참조: Hayakawa and Nomomura, 1987, J. Ferment. Bioeng. 65: 501-509)에 치상하였다. 식물 내생 곰팡이의 생육을 억제하기 위하여 베노밀(benomyl) 50 ㎍/㎖를 배지에 첨가하였다. 이어서, 28℃에서 배양하고, 성장한 균들을 각각 분리한 후, 1/3 희석 옥수수 한천 배지(cornmeal agar(CMA); 옥수수분(corn meal) 25 g, 한천(agar) 20 g, 증류수 1ℓ)에 계대 배양하여 단일 균주로 분리하였다. CMA 배지에서 포자 및 균사체를 백금이로 긁어 15%(v/v)의 글리세롤에 침지한 후 -80℃에서 장기 보관하였다.

실시예 2: 고추 역병에 우수한 효과를 보이는 식물 내생 방선균 선발

실시예 1에서 분리한 81개의 균주들 중에서, 파종 시 종자에 처리하였을 때 식물 내에 침투하여 고추 역병에 대하여 우수한 효과를 보이는 균주를 선발하고자 다음과 같이 실험하였다.

분리한 총 81개의 방선균을 CMA 배지에 스트리킹(streaking)하여 30℃에서 2주일간 배양하였다. 종자에 코팅되어 있는 살균제를 제거하기 위하여, 고추 종자(부강)를 멸균수에 담근 후, 초음파 처리를 한 다음, 멸균수로 2회 세척하였다. 살균제가 제거된 종자들을 1주일간 멸균수에서 발아시킨 다음, 방선균이 자란 배지 상에 치상하였다. 25℃에서 2일간 배양한 다음, 멸균한 밭토양에 파종하고, 온실에서 4주간 재배하였다. 이후 지름 7.0 cm 인 플라스틱 포트 내의 원예용 상토에 이식하고, 3주간 키운 다음, 1차 분지기가 되었을 때 고추 역병균을 접종하였다. 이 경우, 고추 역병균의 유주자낭 현탁액(1×10⁴ 유주자낭/㎖)을 각각의 포트에 20 ㎖씩 관주 처리함으로서 식물 병원균을 접종하였다. 접종 후 온실에서 저면관수로 8일 동안 발병시키고, 발병도를 조사하였다.

그 결과, A073 균주가 가장 우수한 방제활성, 즉 85%의 방제가를 보여서, 이 균주를 선발하였다.

실시예 3: A073 균주의 동정

실시예 2에서 분리한 A073 균주의 동정은 여러 가지 형태적 특징 조사 및 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 이용하여 실시하였다.

(1) 균주의 형태학적 특징

ISP(International Streptomyces Project) 규정에 따라 상기와 같이 분리한 A073 균주를 28℃에서 14일간 배양하고, 포자를 주사 전자 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1로부터, 포자의 모양은 달걀 모양(oval)이었으며, 포자의 크기는 0.4×0.5 내지 0.5×0.7 ㎛임을 확인할 수 있었다. 또한, 포자의 표면은 매끈하였으며(smooth), 포자의 연쇄 형태는 비스포라(bispora) 형태이었다. 체인 당 포자의 수는 2개이었으며, 포자는 운동성이 없었다. 또한, 포자를 광학 현미경으로 관찰한 결과, 다이아미노피멜릭산(diaminopimellic acid)은 메조(meso) 타입이었으며, 멜라노이드 색소(melanoide pigment)는 생성하지 않았다.

(2) 각종 배지에 따른 배양학적 특성

각종 ISP 배지 조건에서, 상기 분리한 A073 균주를 28℃에서 14일간 배양한 후 배양생리학적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 결과적으로, 공중균사는 흰색 또는 분홍색을 띠었고, 기균사는 분홍색을 띠었다. 또한, A073 균주는 오트밀 한천 배지, 무기염류-전분 한천 배지, 벤넷 한천 배지 등에서 잘 자랐으며, 어떠한 배지에서도 수용성 색소는 생성하지 않는 것으로 나타났다.

(3) 16S rRNA 유전자염기서열 분석

상기 A073 균주의 유전적 분석 및 동정을 위하여 문헌[Coombs and Franco, 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69: 5603-5608]에 기재된 방법에 따라 16S rDNA의 염기서열을 결정하였다.

A073 균주를 벤넷 배지에 7일간 현탁 배양한 후, 배양액을 원심 분리하여 세포를 분리하고, DNA를 추출하였다. 추출된 DNA에 대해서, 유니버설 16S 프라이머(universal 16S primer), 즉 9f(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG) 및 1541r(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC)을 이용하여, 하기 반응액 100㎕에서 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다:

반응액: 4 ㎕의 9f(200 ng/㎕), 4 ㎕의 1541r(200 ng/㎕), 20 ㎕의 5×Taq 완충액(5% 40 mM 디옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트(deoxynucleotide triphosphates), 40% 25 mM MgCl₂, 50% 10×PCR 완충액, 5% 물), 67 ㎕의 물, 1 ㎕의 Taq 중합효소(2 U/㎕) 및 4 ㎕의 주형(template) DNA).

또한, PCR 증폭을 위해, 94℃에서 8분간 반응시킨 후, 94℃에서 1분, 45℃ 1분 및 72℃에서 2분간 확장하는 사이클을 30회 반복하고, 마지막 사이클은 45℃에서 1분간, 72℃에서 10분간 수행하였다.

PCR 생성물을 위자드 피시알 프렙 디엔에이 정제 키트(Wizard PCR Prep DNA purification kit)로 순수 분리한 후, 자동 서열기(automatic sequencer)를 통해 염기서열을 결정하였다. BLASTN을 이용하여 유전자은행(GenBank) 데이터베이스와 비교한 결과, 유전자은행의 마이크로비스포라 속 AY445641 균주와 99%의 염기서열 상동성(sequence homology)을 보여 상기 균주를 마이크로비스포라 속 A073로 명명하였다.

상기 결과에 따라 A073 균주를 마이크로비스포라 속 균주로 동정하였고, A073 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2007년 8월 13일자로 기탁번호 제 KCTC 11170BP 호로 기탁하였다.

실시예 4: A073 균 배양액의 다양한 식물병에 대한 방제 활성

A073 균주 배양액이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛 곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병의 6가지 식물병에 미치는 방제활성을 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 실시예 1에서 -80℃로 보관된 A073 균주를 벤넷 배지에 접종하여, 30℃, 150 rpm으로 1주일간 진탕 배양하였다. 1주일간 전배양한 후 각각 50 ㎖의 벤넷 배지, GP 배지(글리세롤 20 g, 폴리펩톤 10 g, 쇠고기 추출물 5 g, 증류수 1ℓ) 및 GSS 배지(가용성 전분 10 g, 글루코스 2 g, 대두박(soybean meal) 25 g, 쇠고기 추출물 1 g, 효모 추출물 4 g, NaCl 2 g, K₂HPO₄ 0.25 g, CaCO₃ 2 g, 증류슈 1ℓ, pH 7.2)에 1% 접종한 다음 30℃, 150 rpm으로 1주일간 배양하였다. 각각의 배양액을 균질기(homogenizer)로 균질화한 후, 거즈로 고체 성분을 여과하고, 트윈 20을 250 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 실험용 A073 균주 배양액을 제조하였다.

실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25 ± 5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다.

(1) A073 균주 배양액이 벼 도열병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 3 내지 4엽기의 벼 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 건조된 3종류의 벼 유묘에 벼 도열병의 원인균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×10⁵ 포자/㎖)을 각각 분무 접종하였다. 접종한 유묘를 25℃의 습실 상에서 하루 동안 습실 처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 8일 후, 벼 도열병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 하기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

(2) A073 균주 배양액이 벼 잎집무늬마름병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 5엽기 벼 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 잎집무늬마름병의 원인균인 타네이트포러스 큐큐메리스(Thanatephorus cucumeris, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을, 건조된 3종류의 벼 유묘에 각각 접종하였다. 접종한 유묘를 25℃의 습실 상에서 4일간 습실 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 8일 후, 벼 도열병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

(3) A073 균주 배양액이 토마토 역병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 3 내지 4엽기의 토마토 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 건조된 3종류의 토마토 유묘에, 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(3×10⁴ 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 각각 분무 접종하였다. 접종한 유모를 25℃의 습실 상에서 2일간 습실 처리하고, 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 3일 후, 토마토 역병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

(4) A073 균주 배양액이 토마토 잿빛 곰팡이병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 3 내지 4엽기의 토마토 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 건조된 3종류의 토마토 유묘에, 잿빛 곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(10⁶ 포자/㎖)을 각각 분무 접종한 후, 20℃의 습실 상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 3일 후, 토마토 잿빛 곰팡이병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

(5) A073 균주 배양액이 밀 붉은 녹병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 1엽기 밀 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 건조된 3종류의 밀 유묘에, 활물 기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 푸치니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g 포자/ℓ의 양으로 현탁하여 각각 분무 접종하였다. 분무 처리된 유묘를 20℃의 습실에서 하루 동안 습실 처리한 후, 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 7일 후, 밀 붉은 녹병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

(6) A073 균주 배양액이 보리 흰가루병에 미치는 효과

병원균 접종 1일 전에, 1엽기 보리 유묘의 엽면에 벤넷 배지, GP 배지 및 GSS 배지에서 배양한 A073 균주를 각각 분무 살포하고, 상온에서 24시간 동안 건조하였다. 이후에, 건조된 3종류의 보리 유묘에, 숙주 식물에서 계대 배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 각각 접종하였다. 접종된 유묘를 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다.

접종 7일 후, 보리 흰가루병에 의한 병반 면적률을 조사하고, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 벤넷 배양액과 GP 배양액은 6가지 식물병에 대해서는 거의 효과가 없었던 반면, GSS 배양액은 토마토 잿빛 곰팡이병과 토마토 역병에 대해서 방제 활성을 보였다.

실시예 5: A073 균주의 포장에서의 고추 역병에 대한 방제 효과

A073 균주의 고추 역병에 대한 효과를 조사하기 위하여 2006년과 2007년에 포장 시험을 수행하였다.

(1) 2006년 포장 시험

먼저, A073 균주를 CMA 배지에 스트리킹하여 30℃에서 2주일간 배양하였다. 종자에 코팅된 살균제를 제거한 다음, 25℃에서 1주일 최아 발아한 고추 종자(부강)를 A073 균주 위에 치상한 후, 25℃에서 2일간 배양하여 A073 균주가 종자에 침투하도록 하였다. 발아된 고추를 멸균한 밭토양에 파종하고, 온실에서 2주 재배한 후, 원예용 상토에 이식하여 다시 3주간 재배하였다. A073 포자 현탁액(1×10⁷포자/㎖)을 10 ㎖씩 관주하여 밤새 처리한 다음, 고추 유묘를 포장에 정식하였다. 이 경우, A073 균주 처리구는 각 회 당 10주씩, 4회 반복하여 정식하였다. 이때, 대조구에는 메탈락실(Metalaxyl; 상용농도 500 ㎍/㎖)을 정식일부터 1주일 간격으로 실험 수행기간 내내 엽면에 분무 살포하였다. 반면에 무처리구에는 아무런 처리를 하지 않았다. 정식 1주 후에 고추 역병균(Phytophthora capsici)을 한 주당 1×10⁴ 유주자낭/㎖ 농도로 20 ㎖씩 접종하였다. 고추 역병균 접종 1주부터 매주 발병도를 관찰한 후, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에서와 같이 초기에는 대조약제인 메타락실의 방제효과가 A073 균주보다 우수하였지만, 접종 3주 후부터 두 처리구간에 방제효과의 차이가 없었다. 이와 같이 2006년 포장시험에서는 A073 균주 처리구가 메타락실과 유사한 방제효과를 보였다.

(2) 2007년 포장 시험

먼저, A073 균주를 CMA 배지에 스트리킹하여 30℃에서 2주일간 배양하였다. 종자에 코팅된 살균제를 제거한 다음, 최아 발아시키지 않고, A073 균주 균총 위에 치상하여 25℃에서 5일간 배양후 파종하였다. 밭토양에서 2주간 키우고, 원예용 상토에서 4주 동안 더 키운 후, A073 포자 현탁액 (1×10⁷ 포자/㎖)을 10 ㎖씩 관주하여 밤새 처리한 다음, 고추 유묘를 포장에 정식하였다. 이 경우, A073 균주 처리구는 각 회 당 10주씩, 4회 반복하여 정식하였다. 이때, 대조구에는 메탈락실(상용농도 500 ㎍/㎖)을 정식일부터 실험 수행기간 내내 1주일 간격으로 엽면에 분무 살포하였다. 반면에 무처리구에는 아무런 처리를 하지 않았다. 정식 1주 후에, 고추 역병균 접종은 인위적으로 하지 않고 자연감염 시켰다. 대조약제인 메타락실은 정식 2주 후부터 1주일 간격으로 상용 농도(500 ㎍/㎖) 수준으로 엽면에 분무 살포하였다. 대조약제를 살포한 2주 후부터 1주일 간격으로 발병도를 조사한 후, 상기 수학식 1에 의해 방제가를 산출하여 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, A073 균주 처리구는 대조약제인 메타락실보다 방제가가 매우 우수한 것으로 나타났다.

실시예 6: 고추 뿌리로부터 A073 균주의 재분리

포장 실험 후 A073 균주를 처리한 고추의 뿌리로부터 A073 균주의 재분리를 실시하였다. 고추 식물 뿌리를, 상기 실시예 1의 배추 뿌리로부터 식물 내생 방선균을 분리한 방법과 같이 표면 살균한 다음, CMA 배지에 치상하여 28℃에서 2주일간 배양하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4로부터, 고추 뿌리로부터 A073 균주와 형태학적으로 일치하는 균주가 분리되었음을 확인할 수 있었다. 이 균주를 순수하게 분리한 다음, 실시예 3과 같이 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과, 분리된 균주의 염기 서열이 A073 균주의 염기 서열과 100% 일치하는 것으로 나타났으며, 이것은 A073 균주가 고추 뿌리 조직 내에 서식하면서 고추 역병균의 침투를 저지하는 것으로 해석되었다.

실시예 7: 마이크로비스포라 A073 균주의 키티네이즈 생성 여부 조사

키틴 배지를 제조하기 위해, 키틴(시그마(Sigma)) 1 g을 12N HCl 60 ㎖에 용해한 후, 증류수 1ℓ를 첨가하여 밤새도록 정치하였다. 생성된 침전물을 회수하여 8,000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후, 침전물만을 회수하고 증류수에 현탁한 다음, 2N NaOH로 pH를 7.2로 조정하여 콜로이드 상태의 키틴을 준비하였다. 이어서, 콜로이드 상태의 키틴을 65℃에서 30분간 저온 살균하고, 한천 배지(MgSO₄·7H₂0 0.1 g, CaCl₂·2H₂0 0.2 g, FeSO₄·7H₂O 0.04 g, NaCl 0.2 g, KH₂PO₄ 0.3 g, K₂HPO₄ 0.5 g, 효모 추출물 0.1 g, 사이클로헥스이미드(cycloheximide) 5 mg, 증류수 1ℓ)에 1% 첨가하여 키틴 배지를 준비하였다. A073 균주를 키틴 배지에 스트리킹하여, 30℃에서 3일간 배양한 후, 콜로니 주위에 클리어 존(clear zone) 생성 여부를 관찰하여 도 5에 나타내었다. 도 5를 통해, 콜로니 주위로 클리어 존이 관찰되고, A073 균주가 키티네이즈를 생성함을 확인하였다.

도 1은 A073 균주의 포자의 형태학적 특징을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.

도 2는 2006년도 포장시험에서 A073 균주의 고추 역병에 대한 방제효과를 도시한 그래프이다.

도 3은 2007년도 포장시험에서 A073 균주의 고추 역병에 대한 방제효과를 도시한 그래프이다.

도 4는 2006년도 포장시험 후에 A073 균주를 처리한 건전한 고추 뿌리로부터 A073 균주를 분리한 사진이다.

도 5는 A073 균주가 키틴 최소배지에서 키티네이즈를 생성한 것을 관찰한 사진이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> MICROBISPORA SP. A073 STRAIN, MICROORGANISM FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING THE SAME <130> FPD/200709-0043 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1403 <212> DNA <213> MICROBISPORA SP. A073 STRAIN 16S rDNA <400> 1 tacgcttaac atgcagtcga gcggaaggcc cttcggggta ctcgagcggc gaacgggtga 60 gtaacacgtg agtaacctgc ccctgactct gggataagcc tgggaaactg ggtctaatac 120 cggatatgac actcctccgc atggtgtggg tgtggaaagt tttttcggtt ggggatgggc 180 tcgcggccta tcagcttgtt ggtggggtga tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg 240 cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtgggga atattgcgca atgggcggaa gcctgacgca gcgacgccgc gtgggggatg 360 acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggacgaag ttgacgtgta cctgtagaag 420 aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcga gcgttgtccg 480 gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggtg gcttgtcgcg tctgccgtga aagcccgtgg 540 cttaactacg ggtctgcggt ggatacgggc aggctagagg ctggtagggg caagcggaat 600 tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggctt 660 gctgggccag ttctgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 720 tggtagtcca cgctgtaaac gttgggcgct aggtgtgggg gtcttccacg acttctgtgc 780 cgtagctaac gcattaagcg ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840 gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgttgct taattcgacg caacgcgaag 900 aaccttacca aggtttgaca tacaccggaa acactcagag atgggtgcct cctttggact 960 ggtgtacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020 gcaacgagcg caacccttgt tccatgttgc cagcacgcct ttcggggtgg tggggactca 1080 tgggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatgcccc 1140 ttatgtcttg ggctgcaaac atgctacaat ggtcggtaca gagggttgcg ataccgtgag 1200 gtggagcgaa tccctaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat 1260 gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1320 ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggcaacac ccgaagcccg tggcccaacc 1380 acttgtgggg ggagcggtcg aag 1403

Claims

마이크로비스포라 속(Microbispora sp.) A073 균주(KCTC 11170BP).
마이크로비스포라 속 A073 균주(KCTC 11170BP), 이의 배양물, 추출물, 포자 또는 균사를 포함하는, 식물병 방제용 미생물 제제.
제2항에 있어서,

상기 식물병이 고추 역병, 잿빛 곰팡이병 및 토마토 역병으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 미생물 제제.
제2항의 미생물 제제를 토양 또는 식물에 처리하는 것을 포함하는, 식물병의 방제 방법.
제4항에 있어서,

상기 식물병이 고추 역병, 잿빛 곰팡이병 및 토마토 역병으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물병의 방제 방법.
제4항에 있어서,

미생물 제제를 1.0×10³세포/㎖ 내지 1.0×10¹¹세포/㎖의 양으로 대상 토양 또는 대상 식물에 처리하는 것을 특징으로 하는, 식물병의 방제 방법.