KR101503916B1 - 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｉｃｉ ＹＳ１２１５를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제와 그 제조방법 - Google Patents

게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｉｃｉ ＹＳ１２１５를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제와 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 게껍질이 풍부하게 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제에 관한 것으로서, 화학적 방제법에 의한 살선충제의 남용으로 인하여 뿌리혹선충의 약제 저항성을 증가시킬 수 있는 부작용이나, 물리적, 시기적, 인적 제약이 있던 종래기술을 대체한 친환경적인 방제제로서, 선충의 유충 치사와 알 부화 억제가 가능할 뿐만 아니라 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시킬 수 있는 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제를 제공한다.

Description

게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｉｃｉ ＹＳ１２１５를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제와 그 제조방법{Plant growth substance and anti-root knot nematode compound and its composition using Lysobacter capsici YS1215 from crab shell amended soil and manufacturing method thereof}
본 발명은 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제에 관한 것으로서, 특히 게껍질이 풍부하게 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제와 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 농림수산식품부로부터 지원받아 수행된 연구(연구사업명: 생명산업기술개발, 연구과제명: 뿌리혹선충 방제를 위한 항선충 미생물 대량배양복합체 개발)의 일환으로 개발된 것이다.
뿌리혹선충(Meloidogyne)은 식물 기생선충으로서, 식물 기생선충류 중에 가장 많은 경제적 손실을 가져다 주는 해충이다. 기주식물은 잔디에서부터 나무에 이르기까지 2000여종에 이른다.
뿌리혹선충들 중 전 세계적으로 광범위하게 분포하고 있으며 피해를 주고 있는 종은 고구마뿌리혹선충(M. incognita)과 자바뿌리혹선충(M. javanica), 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria), 당근뿌리혹선충(M. hapla) 등이 있는데, 우리나라의 경우도 시설 재배지에서의 연작으로 인해 뿌리혹선충 발생이 증가하고 있으며 피해액과 피해 대상작물이 점차 확대되고 있는 실정이다.
뿌리혹선충은 식물체 뿌리에 2령 유충 시기에 침입하여 기생하면서 영양분을 흡즙하는 식물 내부 기생성 선충으로서, 식물 내부에서 3령, 4령을 거쳐 암수가 나누어지며 암컷은 뿌리 바깥쪽에 난낭을 만들어 500-600개의 알을 낳고, 수컷은 토양으로 나간다. 난낭에서 부화된 2령 유충은 재차 뿌리에 침입하여 세대를 반복한다.
이러한 뿌리혹선충은 주로 시설원예작물인 오이, 수박, 참외, 토마토, 멜론 등에 많은 피해를 주며, 뿌리혹선충에 감염된 식물은 선충이 대부분의 식물 양분을 흡즙함으로써, 식물체 생육이 지연되거나 감소하여 쉽게 시들거나 고사하는 증상이 나타난다. 또한, 각종 토양 병해와의 상호작용으로 2차 피해가 수반된다.
지금까지, 이러한 뿌리혹선충의 방제는 주로 화학적 방제에 의존해 오고 있다. 그러나 화학 살선충제는 고독성이고 토양 잔류기간이 길기 때문에, 토양 미생물에 영향을 미침으로써 토양생태계 불균형뿐만 아니라 지하수 오염과 같은 환경문제를 야기시키며, 살선충제의 남용으로 인하여 뿌리혹선충의 약제 저항성을 증가시킬 수 있는 부작용이 있다.
따라서 화학적 방제법을 대체할 방법으로 토양개량, 담수 온탕처리 및 태양열 소독 등을 이용한 물리적인 방제의 적용을 고려할 수 있으나, 비용이 많이 소요될 뿐만 아니라 작기 중에는 불가능하다.
또한, 윤작이나 전답윤환 등과 같은 경종적 방제법이 사용되고 있으나, 재배시기 조절 및 인력과 시간 등의 제약으로 실질적인 사용은 제한적일 수 밖에 없다.
최근, 친환경적인 방제에 관한 지속적인 연구와 관심이 높아지면서 곰팡이, 세균, 곤충, 포식성 선충 등 천적을 이용하여 생물학적으로 뿌리혹선충의 방제를 시도하고 있다. 대표적으로 미생물을 이용한 생물학적 선충방제에 Pseudomonas 속, Bacillus 속, Clostridium 속, Desulfovibrio 속, Serratia 속, Streptomyces 속 등이 이용되고 있다.
이러한 미생물을 이용한 생물학적 방제법은 뿌리혹선충 방제에 사용되고 있는 대부분의 미생물들이 생산한 특정 효소나 살선충 물질 등이 뿌리혹선충의 표피 성분인 콜라겐(Collagen), 난낭 성분인 젤라틴(Gelatin), 알 껍질 성분인 키틴(Chitin)을 분해하여 유충 치사와 알 부화를 억제하는 것으로 보고되고 있다.
Bacillus cereus가 생산한 단백질 분해효소인 protease는 M. javanica 유충의 표피를 분해했으며, B. ambifaria의 배양액 내의 protease와 키틴 분해효소인 chitinase에 의해 선충 유충 치사 및 알 부화가 억제되었다. 또한 Yoon et al. (2012)에 따르면 Streptomyces cacaoi GY525가 생성한 3-benzyl-1, 4-diaza-2, 5-dioxobicyclo[4.3.0]nonane가 M. incognita의 유충 치사 및 알 부화 억제에 활성을 보였다.
리소박터(Lysobacter sp.)는 대표적인 길항미생물로서 활성을 가진 그람 음성(Gram 陰性) 박테리아이며, 다양한 용균효소(Lytic Enzymes)와 항생물질을 분비하여 식물 병원성 곰팡이 및 식물 해충을 억제하고, 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.
L. antibioticus HS124는 다양한 2차 대사산물을 생성하며 Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum lycopesici , Pythium aphanidermatum 및 Rhizoctonia solani의 생장을 억제할 뿐만 아니라 배추좀나방 유충을 치사한다.
Chen et al. (2006)에 따르면 L. enzymogenes strain C3는 H. schachtii의 알 부화를 억제시키고 유충을 치사한다. 따라서 이러한 기능성 미생물을 이용한 친환경적인 선충방제제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
Abo-Elyousr, K.A., Z. Khan, M.E. Award, and M.F. Abedel-Moneim. 2010. Evaluation of plant extracts and Pseudomonas spp. for control of root-knot nematode, Meloidogyne incognita on tomato. Nematropica 40(2):289-299. Siddiqui, Z.A. and I. Mahmood. 1999. Role of bacteria in the management of plant parasitic nematodes: a review. Bioresource Technol. 69:167-179. Tunlid, A. and S. Janson. 1991. Proteases and their involvement in the infection and immobilization of nematode by the nematophagous fungus Arthrobotrys oligospora. App. Environ. Microbiol. 57:2868-2872. Park, M.H., J.K. Kim, W.H. Choi, and M.H. Yoon. 2001. Nematicidal effect of root-knot nematode (Meloidogyne incognita) by biological nematicide. Korean J. Soil Sci. Fert. 44(2):228-235. Kim, S.S., S.I. Kang, J.S. Kim, Y.S. Lee, S.H. Hong, W.N. Kyaw, and K.Y. Kim. 2011. Biological control of root-knot nematode by Streptomyces sampsonii KK1024. Korean J. Soil Sci. Fert. 44(6):1150-1157. Li, W., D.P. Roberts, P.D. Derby, S.L.F. Meyer, S. Lohrke, R.D. Lumsden, and K.P. Hebbar. 2002. Broad spectrum anti-biotic activity and disease suppression by the potential biocontrol agent Burkholderia ambifaria BC-F. Crop Prot. 21:129-135. Sela, S., H. Schickler, I. Chet, and Y. Spigel. 1998. Purification and characterization of Bacillus cereus collagenolytic/proteolytic enzyme and its effect on Meloidogyne javanica cuticular proteins. Eur. J. Plant. Pathol. 104:59-67. Christensen, P. and D. Cook. 1978. Lysobacter, a new genus of non-fruiting, gliding bacteria with a high base ratio (soil and water organisms). Int. J. Syst. Bacteriol. 28:367-393. Ko, H.S., R.D. Jin, B.H. Krishnan, S.B. Lee, and K.Y. Kim. 2009. Biocontrol Ability of Lysobacter antibioticus HS124 Against Phytophthora Blight Is Mediated by the Production of 4-Hydroxyphenylacetic Acid and Several Lytic Enzymes. CurrMicrobiol 59:608-615. Kang, S.J., Y.S. Lee, S.Y. Lee, G.Y. Yun, S.H. Hong, Y.S. Park, I.S. Kim, R.D. Park, and K.Y. Kim. 2010. Biological Control of Diamondback Moth (Plutella xylostella L.) by Lysobacter antibioticus HS124. Korean J. Soil Sci. Fert. 43(5):537-544 (2010) Chen, J., W.H. Moore, G.Y., Yuen, D. Kobayashi, and E.P. Caswell-Chen. 2006. Influence of Lysobacter enzymogenes Strain C3 on Nematodes. J Nematol 38(2):233-239. Yoon, G.Y., Y.S. Lee, S.Y. Lee, R.D. Park, H.N. Hyun, Y. Nam, and K.Y. Kim. 2012. Effects on Meloidogyne incognita of chitinase, glucanase and a secondary metabolite from Streptomyces cacaoi GY525. Nematology 14(2):175-184.
상술한 문제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 게껍질이 풍부한 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215의 생육 및 효소 활성 특성을 이용하여 선충의 유충 치사와 알 부화 억제가 가능한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 선충 방제제를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 게껍질이 풍부한 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215의 생육 및 효소 활성 특성을 이용하여 선충의 유충 치사와 알 부화 억제가 가능할 뿐만 아니라 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시킬 수 있는 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제를 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제는 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 것을 특징으로 한다.
이때, 본 발명에 따른 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215는, 게껍질이 풍부한 토양을 채취하고, 증류수에 현탁 및 멸균수로 희석하여 토양으로부터 분리하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215는, 키틴아제(Chitinase)의 활성을 측정하기 위한 키틴 아가 배지(Chitin agar medium)의 조성이, 0.5% colloidal chitin, 0.2% Na2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.05% MgSO4ㆍ7H2O, 0.05% CaCl2ㆍ2H2O, 0.05% 효모추출물(Yeast Extract) 및 2% agar 인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215는, 젤라틴아제(Gelatinase) 활성을 측정하기 위한 젤라틴 아가 배지(Gelatin agar medium) 조성이, 1.6 % gelatin, 2.5% Tryptic soy broth 및 2% agar 인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215는, 미생물 배양용 배지의 조성이, 0.1% 게껍질 분말, 0.1% 젤라틴 분말, 0.3% 복합비료(N:P:K; 21:17:17), 0.3% 설탕, 0.003% 효모추출물(Yeast Extract) 및 0.003% FeCl3ㆍ6H2O 인 것을 특징으로 한다.
또한, 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법은, 게껍질이 포함된 토양을 채취하고, 증류수에 현탁 및 멸균수로 희석하여 Lysobacter capsici YS1215를 토양으로부터 분리하는 단계; 상기 분리된 Lysobacter capsici YS1215이 포함된 희석액을 키틴 아가 배지(Chitin agar medium)에 도말 후 배양하는 단계; 미생물 배양용 배지를 만든 후 120℃에서 15분간 멸균하는 단계; 상기 멸균한 미생물 배양용 배지를 식힌 후, 상기 배양된 Lysobacter capsici YS1215를 접종하는 단계; 상기 Lysobacter capsici YS1215 접종 배지를 30℃에서 5일간 배양하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이때, 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법에 있어서 상기 키틴 아가 배지는, 0.5% colloidal chitin, 0.2% Na2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.05% MgSO4ㆍ7H2O, 0.05% CaCl2ㆍ2H2O, 0.05% 효모추출물(Yeast Extract) 및 2% agar를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법에 있어서 상기 미생물 배양용 배지는, 0.1% 게껍질 분말, 0.1% 젤라틴 분말, 0.3% 복합비료(N:P:K; 21:17:17), 0.3% 설탕, 0.003% 효모추출물(Yeast Extract) 및 0.003% FeCl3ㆍ6H2O 인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제에 있어서, 다양한 분해효소를 생성하는 Lysobacter capsici YS1215를 게껍질이 풍부하게 포함된 토양으로부터 분리하여 이용함으로써, 뿌리혹선충의 유충 치사와 알 부화 억제가 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 선충의 유충 치사와 알 부화 억제가 가능할 뿐만 아니라 식물생장 호르몬을 생성하여 작물의 생장을 촉진시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 L. capsici YS1215의 키틴아제 및 젤라틴아제 활성을 측정한 사진을 나타낸 도면,
도 2는 생육배지를 이용하여 측정한 L. capsici YS1215의 세포생장(Cell growth) 및 활성 측정 그래프,
도 3a 및 도 3b는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 지상부 생체중(Fresh shoot weight) 및 지상부 건조중(Dry shoot weight) 조사 그래프를 각각 나타낸 도면,
도 4는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 지상부 길이(Fresh shoot length) 조사 그래프,
도 5a 및 도 5b는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 난낭수(Egg mass number) 조사 그래프,
도 6은 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 토양내 유충수 조사 그래프.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 도면들 중 동일한 구성들은 가능한 한 어느 곳에서든지 동일한 부호들을 나타내고 있음을 유의하여야 한다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것이다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 효과에 대한 검증을 위하여, 게껍질이 풍부한 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215의 생육 및 효소 활성 특성과 식물체 실험을 다음과 같이 수행하였다.
1단계: 토양으로부터 Lysobacter capsici YS1215 분리
먼저, 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제는 토양으로부터 Lysobacter capsici YS1215 분리하기 위하여, 게껍질이 풍부한 순천 해안가 토양을 채취하여, 채취한 토양 10g을 증류수 90mL에 현탁하고, 이 현탁 액을 10-6까지 멸균수로 희석하였다.
2단계: 뿌리혹선충 증식 및 분리
2010년 전남 장성군의 뿌리혹선충 피해가 심한 농가에서 감염 토마토 뿌리를 가져와 토마토(Lycopersicon esculentum) 모종에 감염 및 증식시켜 실험에 사용하였다. 선충 알 및 유충 분리는 선충에 감염된 토마토 뿌리를 흐르는 물에 잘 씻어서 1 cm 크기로 잘라 0.5% NaOCl이 들어있는 병에 넣고 진탕배양기(140rpm)에 15분간 교반한 뒤 45μm 체와 25μm 체에 부어 흐르는 물에 세척하며 알을 수거하였다. 또한, 변형된 Bearman법을 이용하여 분리한 알을 25μm 체에 올린 후, 알을 부화시켜 2령 유충을 수거하였다. 수거한 알과 유충을 실험에 사용하였다.
3단계: YS1215의 효소 활성
L. capsici YS1215의 키틴아제(Chitinase) 및 젤라틴아제(Gelatinase) 활성을 측정하기 위해서 키틴 아가 배지(Chitin agar medium) 및 젤라틴 아가 배지(Gelatin agar medium) 100mL를 250mL 삼각플라스크에 넣고 120℃에서 15분간 멸균한 후 각각 페트리 접시(Petri-dish)에 분주하였다.
키틴 아가 배지 조성은 0.5% colloidal chitin, 0.2% Na2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.05% MgSO4ㆍ7H2O, 0.05% CaCl2ㆍ2H2O, 0.05% 효모추출물(Yeast Extract) 및 2% agar 로 하였고, 젤라틴 아가 배지 조성은 1.6 % gelatin, 2.5% Tryptic soy broth 및 2% agar 로 하였다.
배지를 완전히 굳힌 후 YS1215를 각각의 배지에 획선(Streaking)을 긋고 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양 3일 뒤 키틴아제 활성은 키틴 아가 배지에 투명환이 형성되었을 때 활성이 있는 것으로 간주하고, 젤라틴아제 활성은 젤라틴 아가 배지에 30% 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)을 3mL 첨가하여 투명환 형성으로 판단하였다.
도 1은 L. capsici YS1215의 키틴아제 및 젤라틴아제 활성을 측정한 사진을 나타낸 도면으로서, 키틴 아가 배지 및 젤라틴 아가 배지를 각각 사용하여 L. capsici YS1215의 키틴아제 및 젤라틴아제 활성을 조사한 결과, 도 1의 (a)에 보인 바와 같이, 키틴아제 활성은 키틴 아가 배지에서 투명환이 관찰됨으로 활성이 확인되었고, 젤라틴아제 활성은 도 1의 (b)에 보인 바와 같이, 젤라틴 아가 배지에 30% 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid)을 첨가한 후 투명환이 관찰되어 젤라틴아제 활성을 확인하였다. Park et al.(2008)에 따르면 Lysobacter capsici YS1215가 키틴 분해 활성이 있는 것으로 조사되었다.
4단계: YS1215의 세포생장(Cell growth)
L. capsici YS1215의 세포생장을 측정하기 위해 250mL 삼각플라스크에 생육배지를 넣고 120℃에서 15분간 멸균한 후 YS1215를 접종하고 이를 30℃에서 8일간 배양하면서, 24시간 간격으로 8일간 취하여 UV-spectrophotometer (Shimadzu)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포생장 관찰을 위한 생육배지(미생물 배양용 배지)의 조성은 0.1% 게껍질 분말(삼성키토산, 한국), 0.1% 젤라틴 분말(젤텍, 한국), 0.3% 복합비료(N:P:K; 21:17:17; 남해화학, 한국), 0.3% 설탕(백설, 한국), 0.003% 효모추출물(Yeast Extract) 및 0.003% FeCl3ㆍ6H2O 로 하였다.
도 2는 생육배지를 이용하여 측정한 L. capsici YS1215의 세포생장(Cell growth) 및 활성 측정 그래프로서, L. capsici YS1215의 세포생장을 측정하기 위해 생육배지를 이용하여 1일부터 8일까지 조사하였다. 조사결과, 도 2에 도시된 바와 같이 1일째부터 6일째까지 증가하다 7일째부터 서서히 감소하였다. 도 2의 (-○-)가 세포생장을 나타낸 그래프이다.
5단계: YS12154의 날짜별 효소활성
L. capsici YS1215의 배양 시간에 따른 키틴아제 및 젤라틴아제 활성을 측정하기 위하여 YS1215를 생육 배지에서 30℃에서 8일간 배양하면서 24시간 간격으로 시료를 채취하여 원심 분리(12,000rpm)한 배양 상등액을 사용하였다.
키틴아제 활성 측정을 위해 원심 분리한 상등액에 0.5% colloidal chitin을 넣고 37℃에서 한 시간 반응시킨다. 반응 후 1N NaOH를 가하고 반응을 정지시킨 후 12,000rpm으로 원심 분리하여 얻은 상등액을 취하여 Schales' reagent로 발색시켜 420 nm에서 측정하였다.
젤라틴아제 활성 측정은 gelatin(sigma)을 기질로 사용하여 37℃에서 1시간 반응시킨 다음 반응 전 후의 free α-amino group을 Ninhydrin법에 따라 570nm에서 흡광도를 측정한 후 L-leucine에 대한 표준 검량선으로부터 구하였다.
도 2의 (-■-) 및 (-▲-)로 표시된 그래프를 참조하면, YS1215의 배양 시간에 따른 키틴아제 활성은 3일째 4.0Unit/ml까지 급격히 증가하여 최고의 활성을 나타내었고, 4일과 5일째는 약간 감소하며, 6일째부터 2.5Unit/ml까지 급격히 감소하였다.
또한 젤라틴아제 활성은 2일째까지 빠르게 증가하다가, 3일부터 5일까지 조금씩 증가하여 5일째에 7.43Unit/ml로 최고활성을 보였으며, 6일째부터는 서서히 감소하였다.
이로부터, YS1215 균주는 배양액 내의 균체수가 어느 정도 증가할 때 키틴아제 활성이 증가하지만 일정 시간 경과 후에는 균체의 수와 상관없이 키틴아제 활성이 감소하는 것으로 보인다. 또한, 젤라틴아제 활성은 균체가 증가함에 따라 젤라틴아제 활성도 증가하는 것으로 보인다.
6단계: YS1215 배양액 처리가 식물생장에 미치는 영향
L. capsici YS1215 배양액의 식물생장 및 선충 감염 억제효과 조사를 위해 발아 후 4주된 토마토를 포트(10cm x 15cm)에 옮겨 심고 대략 253마리의 유충과 199여개의 알을 접종하였다. 선충 접종 후 1주 간격으로 8주차까지 시험구에 미생물 배양액(BM; bacterial medium), 미생물 배양액 반량(HBC; Half of bacterial culture, 미생물 배양액 : 물 = 1 : 1), 배지액(BC; bacterial culture) 및 살선충 농약을 각각 50ml씩 처리(CN; commercial nematicide)하고, 무처리구(TW; Tap water)는 물만 50ml 처리하였다. 이 때, 농약처리구(CN)는 테라노바(abamectin 1.68%, 신젠타 코리아(주))를 물에 녹여 선충 감염 직후 1회 처리하였다. 처리 5주 및 9주째, 각 처리구별로 식물 생장 조사항목인 지상부 길이, 지상부 생체중 및 건물중과 선충 억제 효과 조사 항목인 뿌리혹수, 난낭 수, 토양내 유충수를 측정하였다.
도 3a 및 도 3b는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 지상부 생체중(Fresh shoot weight) 및 지상부 건조중(Dry shoot weight) 조사 그래프를 각각 나타낸 도면으로서, L. capsici YS1215 배양액의 식물생장 및 선충 감염 억제효과를 조사하기 위해 발아 후 4주된 토마토를 이용하여 선충 접종 후 5주 및 9주째에 조사하였다.
먼저, 도 3a를 참조하면, 정식 후 5주 및 9주째 지상부 생체중과 지상부 건조중을 조사한 결과, 5주째 식물 지상부 생체중 및 건조중에서 미생물 배양액 반량구(HBC)에서 가장 높게 나타났다. 9주째 생체중은 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC), 배지액(BC), 물(TW) 및 농약처리구(CN)에서 각각 8.07g, 8.62g, 8.83g, 6.85g 및 7.82g을 나타냈다.
다음으로, 도 3b를 참조하면, 9주째 건물중은 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC), 배지액(BC), 물(TW) 및 농약처리구(CN)에서 각각 0.79g, 0.81g, 0.62g, 0.82g 및 0.72g을 나타냈다. 하지만 생체중 및 건물중의 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC) 및 배지액 처리구(BC) 간의 유의적 차이는 나타나지 않았고, 미생물 배양액 처리구(BM)와 물 처리구(TW)간의 유의성은 나타났다.
도 4는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 지상부 길이(Fresh shoot length) 조사 그래프로서 도 4를 참조하면, 9주째 지상부 길이(Fresh shoot length)는 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC), 배지액(BC), 물(TW) 및 농약처리구(CN)에서 각각 35.00cm, 43.06cm, 36.50cm, 37.66cm, 38.66cm로 나타났다.
이러한 결과는 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC) 및 배지액(BC) 등이 비료로서의 효과는 비슷한 것으로 보인다. Broadbent et al.(1977)에 따르면 미생물(Bacillus spp.)이 뿌리혹선충의 감염을 억제하였거나 생리활성 물질을 분비함으로써 식물이 생장하는 것으로 보고하였으나 본 실험결과와는 상반되었다.
도 5a 및 도 5b는 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 난낭수(Egg mass number) 조사 그래프로서, 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC), 배지액(BC), 물(TW) 및 농약처리구(CN)에 대한 뿌리혹선충에 미치는 영향을 조사한 결과, 도 5a를 참조하면 각 처리구별 난낭수는 39개, 116개, 160개, 275개, 24개로 나타났고, 도 5b를 참조하면 뿌리혹수는 47개, 84개, 137개, 216개, 35로 조사되었다.
도 6은 L. capsici YS1215 배양액 처리구별 토양내 유충수 조사 그래프로서, 도 6에 도시된 바와 같이, 토양내 유충수는 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC), 배지액(BC), 물(TW) 및 농약처리구(CN)에서 각각 731마리, 1063마리, 4314마리, 4879마리, 413마리로 조사되었다.
도 5a, 5b 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 난낭수, 뿌리혹수 및 토양내 유충수에 대한 조사결과, 농약처리구(CN)가 가장 선충억제에 효과가 좋은 것으로 조사되었지만, 미생물 배양액 처리구(BM)와의 유의적 차이는 보이지 않았다.
반면에, 미생물 배양액 처리구(BM)와 미생물 배양액 반량구 처리구(HBC)와 유의적 차이를 보였는데, 이는 배양액을 희석하여 사용하면 효과 또한 감소하는 것으로 보여진다.
미생물 배양액(BM) 및 반량구(HBC)가 대조구인 배지액 처리구(BC)와 물처리구(TW)보다 난낭수, 뿌리혹수 및 토양내 유충수에서 적게 나타났으며, 통계적 유의성에서도 차이를 보이는데, Devidas and Rehberger(1992)의 보고에 따르면 이러한 결과는 미생물 배양 시 배양액 속에 생성된 여러 2차 대사산물인 효소 및 항생물질이 선충 억제에 활성을 나타낸 것으로 보인다.
비슷한 예로는 Bacillus subtilis 배양액을 토마토에 처리하였을 때 M. incognita의 난낭수와 뿌리혹수가 감소된 것과, Gautam et al.(1995) 및 Dicklow et al.(1993)의 실험에서 나타난 Streptomyces sp. 배양액이 M. incognita의 뿌리혹 생성을 감소시킨 조사결과가 있다. 또한, S. sampsonii KK1024 배양액을 처리했을 때 토마토의 뿌리혹선충 감염 피해가 감소되었다는 보고도 있다.
결과적으로, L. capsici YS1215를 이용한 뿌리혹선충의 생물학적 방제는 가능하며, 미생물 배양액을 희석하지 않고 작물에 적용하였을 때 작물 생육저하를 일으키지 않고 높은 선충억제 효과를 보였으므로 선충 감염이 시작되는 작물 정식 초기 및 선충 번식이 활발한 작물 생육기에도 적용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 효과를 검증하기 위하여, Lysobacter capsici YS1215의 특성 및 뿌리혹선충 방제에 미치는 영향을 조사한 결과, YS1215의 생육은 배양 6일째 최고였으며, 생육에 따른 키틴아제와 젤라틴아제의 활성은 각각 3일째와 5일째에 가장 높은 활성을 보였다.
또한, YS1215 배양액이 선충 피해 방제와 식물 생장에 미치는 영향을 조사해 본 결과, 5주째 식물 지상부 생체중 및 건조중에서 배양액 반량구(HBC)에서 가장 높게 나타났지만, 9주째에는 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC) 및 배지액 처리구(BC)에서 차이를 보이지 않았다. 하지만 9주째 미생물 배양액(BM), 미생물 배양액 반량구(HBC) 및 배지액 처리구(BC)가 물처리구(TW) 보다 높게 나타났다. 한편, 지상부 길이에서는 미생물 배양액 반량구 처리구(HBC)가 가장 높았다.
선충 피해 방제에 있어서 난낭수, 뿌리혹수 및 토양내 유충수에서 각각 농약처리구(CN)에서 가장 낮게 나타났으나, 미생물 배양액 처리구(BM)와의 유의적 차이는 보이지 않았다. 미생물 배양액 처리구(BM)는 미생물 배양액 반량구(HBC) 및 물처리구(TW)와는 유의적 차이가 있는 것으로 조사되었다.
그러므로 다양한 분해효소를 생성하는 L. capsici YS1215의 뿌리혹선충 방제에 대한 충분한 가능성과 가치가 있으며, 본 발명에 따른 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 가치와 효과 또한 충분히 검증된다.
본 발명의 효과 검증을 위한 실험 데이터의 결과는 SAS프로그램 9.1 버전(2006)을 사용하여 5%의 유의수준(P≤0.05)에서 Turkey's Studentized Range Test(Tukey's HSD multiple comparison test)로 분석하였다.
한편, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.

Claims (8)

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  6. 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법에 있어서,
    게껍질이 포함된 토양을 채취하고, 증류수에 현탁 및 멸균수로 희석하여 Lysobacter capsici YS1215를 토양으로부터 분리하는 단계;
    상기 분리된 Lysobacter capsici YS1215이 포함된 희석액을 키틴 아가 배지(Chitin agar medium)에 도말 후 배양하는 단계;
    미생물 배양용 배지를 만든 후 120℃에서 15분간 멸균하는 단계;
    상기 멸균한 미생물 배양용 배지를 식힌 후, 상기 배양된 Lysobacter capsici YS1215를 접종하는 단계; 및
    상기 Lysobacter capsici YS1215 접종 배지를 30℃에서 5일간 배양하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 키틴 아가 배지는,
    0.5% colloidal chitin, 0.2% Na2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.5% NaCl, 0.1% NH4Cl, 0.05% MgSO4ㆍ7H2O, 0.05% CaCl2ㆍ2H2O, 0.05% 효모추출물(Yeast Extract) 및 2% agar를 포함하는 것을 특징으로 하는 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 미생물 배양용 배지는,
    0.1% 게껍질 분말, 0.1% 젤라틴 분말, 0.3% 복합비료(N:P:K; 21:17:17), 0.3% 설탕, 0.003% 효모추출물(Yeast Extract) 및 0.003% FeCl3ㆍ6H2O 인 것을 특징으로 하는 게껍질이 포함된 토양으로부터 분리한 Lysobacter capsici YS1215를 이용한 식물 생장 촉진제 및 선충 방제제의 제조방법.
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