CN110272854A - 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，所述枯草芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16568；保藏时间为：2018年10月10日。所述枯草芽孢杆菌菌株能够对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉进行有效抑制，产生较多的抗菌物质；含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液具有广谱抗菌能力，含有高成分的环脂肽，有广阔的应用前景。且枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中取得较好效果。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明实施例涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜热、好氧并产芽孢的G+杆状细菌，长期以来一直被用来发酵大豆食品、广泛用于工业酶和化学品的生产。它能产生多种抗菌素和酶，在生物防治方面，常用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病，近年来也应用到水果的病害中，例如草莓的白粉病，芒果的炭疽病等。
枯草芽孢杆菌拥有着广泛的抑菌谱，其主要原因在于它可以分泌多种拮抗类物质，其中有通过非核糖体合成的低分子抗菌肽以及通过核糖体合成的大分子蛋白类细菌素。研究发现，枯草芽孢杆菌的主要抑菌物质是通过非核糖途径产生的环脂肽类物质，主要分为表面活性素(Surfactins)、伊枯草菌素(Iturins)和芬芥素(Fengycins)，是由亲水的肽链和亲油的脂肪酸链(14～17个碳原子)组成。枯草芽孢杆菌分泌的抗菌物质可能通过以下几种途径来抑制病原菌：(1)阻碍病原菌的细胞壁合成，并损伤细胞膜；(2)作用于病原菌的蛋白质合成系统，阻碍蛋白质合成；(3)作用于能量代谢系统，使微生物无法生成孢子；(4)加速植物种子萌发，增强植物自身抗病能力。因此具有高抗真菌活性的枯草芽孢杆菌无论在生物防止方面还是在保障食品安全方面都有着重要作用。
但是现有的枯草芽孢杆菌罕有发现在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中取得较好效果的菌株，且代谢物质环脂肽含量较少。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中取得较好效果，并解决现有技术中抗菌环脂肽含量的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株于2018年10月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.16568。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种种子液制备：将所述枯草芽孢杆菌活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于培养基上，之后进行封胶并放入培养箱中培养，得到活化的菌株，将活化的菌株转入培养基中培养，即制得所述的菌种种子液；
步骤二、高密度发酵液的制备：将所述的菌种种子液接种在装有高密度培养基的容器中培养，制得菌悬液，将所述菌悬液离心后收集上清液，上清液过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
进一步的，所述菌种种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于NA培养基上，之后进行封胶并倒置于温度为33℃培养箱重培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在温度为33～50℃，转速为180～300r/min的条件下培养24～50h，制得所述的菌种种子液。
进一步的，所述的菌种种子液于温度为-1～4℃的环境下保存备用。
进一步的，所述NA平板培养基或NA培养基的原料包括：蒸馏水、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂；其中，每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；
所述LB培养基的原料包括：蒸馏水、氯化钠、酵母提取物和胰蛋白胨；其中，每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨。
进一步的，所述高密度发酵液的制备方法包括：将所述的菌种种子液以接种量为4～7％的体积比接种于装有高密度培养基的三角瓶中，在温度为33～50℃、转速为180～300r/min的条件下培养24～48h，获得菌悬液，所述菌悬液在转速为8000～10000r/min的离心机中离心后取上清液，上清液用微孔滤膜过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
进一步的，所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液于温度为4℃的环境下保存备用。
进一步的，所述高密度培养基的原料包括：蒸馏水、黄豆粉、玉米粉、淀粉、酵母膏、NaCl、CaCl2和MnSO4·H2O；其中，每1000mL蒸馏水对应25.0g黄豆粉，20.0g玉米粉，3.0g淀粉，10g酵母膏，3g NaCl，2g CaCl2，2g MnSO4·H2O。
根据本发明实施例的第四方面，提供一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中的应用。
本申请提供的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.16568；保藏时间为：2018年10月10日。
本发明实施例具有如下优点：本发明实施例提供一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用，所述枯草芽孢杆菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且能够对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉进行有效抑制，产生较多的抗菌物质；含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液具有广谱抗菌能力，含有高成分的环脂肽，有广阔的应用前景。且枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中取得较好效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Iturin A的质谱图；
图2为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Bacillomycin LB(C15)的质谱图；
图3为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Bacillomycin LC(C16)的质谱图；
图4为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Surfactin A(C13)的质谱图；
图5为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Surfactin B(C14)的质谱图；
图6为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Surfactin C(C15)的质谱图；
图7为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Fengycin A(C15/Ala-6)的质谱图；
图8为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Fengycin B(C16/Ala-6)的质谱图；
图9为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Fengycin C(C17/Ala-6)的质谱图；
图10为本发明提供的一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液中Fengycin D(C16/Val-6)的质谱图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株于2018年10月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16568。
此外，本实施例还提供一种含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
进一步的，本实施例提供一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中的应用。
本实施例中的枯草芽孢杆菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且能够对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉进行有效抑制，产生较多的抗菌物质；含有枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液具有广谱抗菌能力，含有高成分的环脂肽，有广阔的应用前景。且枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中取得较好效果。
实施例2
本实施例提供一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种种子液制备：将所述枯草芽孢杆菌活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于培养基上，之后进行封胶并放入培养箱中培养，得到活化的菌株，将活化的菌株转入培养基中培养，即制得所述的菌种种子液；
步骤二、高密度发酵液的制备：将所述的菌种种子液接种在装有高密度培养基的容器中培养，制得菌悬液，将所述菌悬液离心后收集上清液，上清液过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
优选的，所述菌种种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于NA培养基上，之后进行封胶并倒置于温度为33℃培养箱重培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在温度为33～50℃，转速为180～300r/min的条件下培养24～50h，制得所述的菌种种子液。
优选的，所述的菌种种子液于温度为-1～4℃的环境下保存备用。
优选的，所述NA平板培养基或NA培养基的原料包括：蒸馏水、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂；其中，每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；
所述LB培养基的原料包括：蒸馏水、氯化钠、酵母提取物和胰蛋白胨；其中，每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨。
优选的，所述高密度发酵液的制备方法包括：将所述的菌种种子液以接种量为4～7％的体积比接种于装有高密度培养基的三角瓶中，在温度为33～50℃、转速为180～300r/min的条件下培养24～48h，获得菌悬液，所述菌悬液在转速为8000～10000r/min的离心机中离心后取上清液，上清液用微孔滤膜过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
优选的，所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液于温度为4℃的环境下保存备用。
优选的，所述高密度培养基的原料包括：蒸馏水、黄豆粉、玉米粉、淀粉、酵母膏、NaCl、CaCl2和MnSO4·H2O；其中，每1000mL蒸馏水对应25.0g黄豆粉，20.0g玉米粉，3.0g淀粉，10g酵母膏，3g NaCl，2g CaCl2，2g MnSO4·H2O。
实施例3
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于37℃培养箱培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在37℃，170r/min的条件下，培养24h，制得的菌种种子液于4℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以5％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为37℃、170r/min条件下，培养24h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16568活菌数达到4.8×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经9000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例4
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于40℃培养箱培养28h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在40℃，210r/min的条件下，培养24h，制得的菌种种子液于-1℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以7％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为40℃、210r/min条件下，培养24h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16568活菌数达到3.9×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经8000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例5
本实施例提供了一种枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法包括如下步骤：
1)菌种种子液制备：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取单菌落划线于NA培养基上，封胶倒置于38℃培养箱培养30h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在45℃，280r/min的条件下，培养48h，制得的菌种种子液于4℃保存备用；
2)高密度发酵液的制备：将步骤1)备好的菌种种子液，以6％(V/V)的接种量接种于高密度培养基的三角瓶中，在温度为38℃、280r/min条件下，培养24h，枯草芽孢杆菌CGMCC NO.16568活菌数达到4.10×1011CFU/mL。获得菌悬液，将菌悬液经10000r/min离心后取上清液，用微孔滤膜过滤除菌，得到高密度发酵液于4℃保存备用。
实施例6
在采取实施例3—5中任一技术方案的情况下，NA平板培养基或NA培养基的组成为：每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；LB培养基的组成为：每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨；高密度培养基的组成为：每1000mL蒸馏水、25.0g黄豆粉，20.0g玉米粉，3.0g淀粉，10g酵母膏，3g NaCl，2g CaCl2，2g MnSO4·H2O。
应用例1枯草芽孢杆菌对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉的抗菌作用
为了进一步说明枯草芽孢杆菌对细菌、真菌的抗性作用，本发明研究了该菌种对于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抗菌作用并做了以下检验，方法如下：
首先活化大肠杆菌和金黄色沙门氏菌，在LB培养基中培养，沙门氏菌采用BPY培养基，经挑取单菌落于100mL培养基中37℃培养10h达到对数稳定期(菌落数为1×108～9×108CFU/mL)，稀释至1×106～9×106CFU/mL。
首先活化菌株并制备黑曲霉的菌悬液，将黑曲霉连续两次传代接种于PDA培养基平板，将黑曲霉培养物分别在PDA培养基上于25℃生长5天。挑取一环直径≥2mm的菌落接入5ml无菌生理盐水中，用接种环将其打碎并震荡5min，使其均匀分布于无菌生理盐水中形成菌悬液。移取少许菌悬液于血细胞计数板上，在显微镜下观察计数，调整浓度控制在1～5×106CFU/mL。
将三种细菌的稀释液以及黑曲霉的孢子悬浮液(100μL)分别涂抹在LB和PDA培养基上。使用牛津杯将200μL的枯草芽孢杆菌液体培养物的高密度上清液和无菌蒸馏水分别滴加到培养基上，并在37℃下孵育。使用交叉条纹法在5天后测量抑制区的直径。
如表1实验结果表明，培养液能够有效的抑制微生物的生长。大肠杆菌的抑菌圈为29.1mm、金黄色葡萄球菌的抑菌圈为25.4mm、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈为20.6mm，黑曲霉的抑菌圈为28.9mm。
表1.高密度发酵液对微生物的抑制作用
表2.LC-MS/MS高密度发酵液中环脂肽种类与含量
从表2中看出，高密度发酵液中总共有10种环脂肽，有3种Iturins，3种Surfactins和4种Fengycins，可从表1中获取环脂肽的液质信息。高密度发酵技术可以增加伊枯草菌素与表面活性素，但是减少了芬荠素的含量，抗菌成分总含量增加，说明此枯草芽孢杆菌经高密度发酵培养后可以分泌更多的环脂肽，从而有更强的抗菌活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述菌株于2018年10月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.16568。
2.一种含有如权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株代谢产物的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
3.一种如权利要求2所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、菌种种子液制备：将所述枯草芽孢杆菌活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于培养基上，之后进行封胶并放入培养箱中培养，得到活化的菌株，将活化的菌株转入培养基中培养，即制得所述的菌种种子液；
步骤二、高密度发酵液的制备：将所述的菌种种子液接种在装有高密度培养基的容器中培养，制得菌悬液，将所述菌悬液离心后收集上清液，上清液过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
4.根据权利要求3所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述菌种种子液的制备方法包括：将枯草芽孢杆菌在NA平板培养基上活化，取活化后的枯草芽孢杆菌单菌落划线于NA培养基上，之后进行封胶并倒置于温度为33℃培养箱重培养24h，得到活化的菌株，用移菌环将活化的菌株转移至LB培养基中，在温度为33～50℃，转速为180～300r/min的条件下培养24～50h，制得所述的菌种种子液。
5.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于；所述的菌种种子液于温度为-1～4℃的环境下保存备用。
6.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述NA平板培养基或NA培养基的原料包括蒸馏水、牛肉浸膏、蛋白胨、葡萄糖和琼脂；其中，每1000mL蒸馏水对应3.0g牛肉浸膏、7.0g蛋白胨、10.0g葡萄糖、15.0g琼脂；
所述LB培养基的原料包括蒸馏水、氯化钠、酵母提取物和胰蛋白胨；其中，每1000mL蒸馏水对应10.0g氯化钠、5.0g酵母提取物、10.0g胰蛋白胨。
7.根据权利要求3所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述高密度发酵液的制备方法包括：将所述的菌种种子液以接种量为4～7％的体积比接种于装有高密度培养基的三角瓶中，在温度为33～50℃、转速为180～300r/min的条件下培养24～48h，获得菌悬液，所述菌悬液在转速为8000～10000r/min的离心机中离心后取上清液，上清液用微孔滤膜过滤并除菌即制得所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
8.根据权利要求7所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌高密度发酵液于温度为4℃的环境下保存备用。
9.根据权利要求7所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液的制备方法，其特征在于，所述高密度培养基的原料包括：蒸馏水、黄豆粉、玉米粉、淀粉、酵母膏、NaCl、CaCl2和MnSO4·H2O；其中，每1000mL蒸馏水对应25.0g黄豆粉，20.0g玉米粉，3.0g淀粉，10g酵母膏，3g NaCl，2gCaCl2，2g MnSO4·H2O。
10.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌高密度发酵液在抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉中的应用。
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