CN116426403A - 一株具有抑菌及抑制螨虫活性的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YHX001J及其应用，该菌株具有较强的抑菌及抑螨的功效，具体体现在：（1）枯草芽孢杆菌YHX001J具有较强的抑菌活性，对常见病原微生物如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌与黑曲霉具有较强的抑制作用；（2）枯草芽孢杆菌YHX001J对屋尘螨具有抑制或杀灭作用。因此，枯草芽孢杆菌YHX001J可用于制备家居环境微生物清洁剂。

Description

一株具有抑菌及抑制螨虫活性的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地涉及一株枯草芽孢杆菌以及其在抑制常见病原微生物和抑制螨虫活性方面的应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对居家环境质量日益关注，不少消费者出于健康的考虑纷纷选购居家环境净化产品。然而，目前市场常用环境净化产品主要为含有化学成分的消毒剂。这些消毒剂在使用后能有效杀灭环境病原微生物，但其功能较为单一，且长久使用容易造成微生物的耐药性。相比之下，微生物清洁剂不仅能抑制环境中常见的病原微生物，还能降解过敏原甚至还具有抑制螨虫活性的能力，目前，基于微生物的清洁产品正越来越为大家所关注。目前在微生物清洁剂产品中，常用的微生物种类包括芽孢杆菌类、酵母类和乳杆菌类等，其中芽孢杆菌因可以形成耐热抗逆性的芽孢利于保持其活性，常被用作微生物的清洁剂组分之一。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种细菌，一般大小为0.7-0.8×2.0-3.0μm，为革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物，通常可通过营养竞争或占位效应形成优势菌群，有效地阻止病原微生物的繁殖，在抑菌领域有一定的作用。枯草芽孢杆菌还能产生多种小分子化合物，能抑制甚至杀灭家居环境中的螨虫，因此枯草芽孢杆菌可有效运用于微生物清洁剂的生产。

发明内容

本发明一方面保护枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YHX001J，该菌株于2022年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022266，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明另一方面保护枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YHX001J在抑制常见病原微生物中的应用，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及黑曲霉。

本发明还保护枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YHX001J在抑制屋尘螨活性或者杀灭屋尘螨中的应用。

本发明的有益效果包括以下几个方面:(1)枯草芽孢杆菌YHX001J对常见病原微生物具有较强的抑菌活性，包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉；(2)枯草芽孢杆菌YHX001J对屋尘螨具有较好的抑制作用，能抑制屋尘螨的活性甚至引起屋尘螨死亡，能有效降低屋尘螨带来的健康风险。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌YHX001J的菌落形态图。

图2为枯草芽孢杆菌YHX001J的营养细胞显微形态图。

图3为枯草芽孢杆菌YHX001J的芽孢显微形态图。

具体实施方式

实施例1枯草芽孢杆菌YHX001J的分离

所用培养基为营养琼脂培养基，配制方法如下：分别称取蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15.0g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液将pH值调节为7.2～7.4，分装到250ml三角瓶，121℃高压灭菌20min，冷却后倒制平板备用。

枯草芽孢杆菌YHX001J为发明人采用稀释平板涂布法从有机农场土壤中分离得到的，具体步骤如下：从有机农场采集土质肥沃，作物生长健康的土壤于无菌采样袋中，带回实验室后，称取5g土壤样品，放入装有适量玻璃珠的无菌250mL三角瓶中并加入45mL无菌水，制成土壤悬液，将其置于37℃恒温振荡器上振荡2h，随后80℃水浴热处理15min。用微量移液器吸取1mL土壤悬液于无菌试管中，加入9mL无菌水，混匀后从中吸取1mL稀释液加入第2根无菌试管中并加入9mL无菌水，以此类推，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、稀释梯度的土壤悬液。分别吸取100μL 10^-2、10^-3、10^-43个稀释梯度的土壤悬液均匀涂布在营养琼脂培养基上，置于37℃生化培养箱中倒置培养48小时。培养72小时后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌，该菌株的编号为YHX001J。

实施例2枯草芽孢杆菌YHX001J的菌株鉴定

菌体形态特征：在营养琼脂平板培养基上，菌落呈淡黄色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，边缘不规则(图1所示)，在显微镜下通过观察和检测发现，该菌为细杆状，革兰氏阳性菌，体长为0.6-1.0×1.5-2.0μm(图2所示)。培养48h后，显微镜下可看到芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽孢囊不膨大，中生到次端生(图3所示)。

菌株的分子生物学鉴定：将菌株交武汉金开瑞生物工程有限公司进行分子生物学鉴定，分别测定其16s rRNA和gyrA基因序列，测序结果如SEQ ID NO.1和2所示，根据序列比对，确定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，2022年3月15日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2022266。

实施例3枯草芽孢杆菌YHX001J对病原微生物的抑制作用

所用培养基如下：

营养琼脂培养基：同实施例1，用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活化及平板计数。

营养肉汤培养基：分别称取牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，用1mo/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.2～7.4，分装到500ml三角瓶，每瓶装98ml，塞上透气塞子。121℃高压灭菌20min备用，用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的单独液体培养以及大肠杆菌与枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌的共培养。

结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)：分别称取蛋白胨7.0g、酵母膏3.0g、乳糖10.0g、氯化钠5.0g、胆盐1.5g、中性红0.03g、结晶紫0.002g、琼脂粉15g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000mL使其溶解，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸将pH值调节为7.3～7.5，煮沸2min，将培养基融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3小时，用于大肠杆菌的计数。

金黄色葡萄球菌3M测试片：用于金黄色葡萄球菌的菌落计数。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：分别称取马铃薯浸出粉12g、葡萄糖20g，琼脂15g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，分装后，121℃高压灭菌20min，用于白色念珠菌和黑曲霉的活化及平板计数，使用前加入34μg/mL的卡那霉素。

沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨5g、葡萄糖20g置于1000ml烧杯中，加入纯化水1000ml使其溶解，煮沸，冷却至60℃，分装到500ml三角瓶，每瓶装98ml，塞上透气塞子，121℃高压灭菌20min备用，用于白色念珠菌、黑曲霉的单独液体培养以及白色念珠菌与枯草芽孢杆菌、黑曲霉与枯草芽孢杆菌的共培养。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌实验操作如下：

(1)菌悬液的制备：取枯草芽孢杆菌YHX001J、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌分别接种到已灭菌的100ml营养肉汤培养基中，置于37±1℃条件下培养24小时。用接种环将培养好的菌悬液划线于营养琼脂平板上，置于37±1℃条件下培养24小时。取各菌的单菌落至已灭菌的营养肉汤培养基中混合均匀，置于37±1℃条件下培养24小时。

(2)菌悬液的稀释计数：分别对培养后的菌液进行稀释计数，菌悬液先保存在4℃冰箱中备用，待计数结果出来后，分别将三种菌调整至10⁶-10⁷CFU/mL。

(3)共培养：在无菌操作下，实验组吸取大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌悬液1ml接种至98ml营养肉汤培养基，混合均匀后，再加入1mL枯草芽孢杆菌。对照组组吸取大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌悬液1ml接种至98ml营养肉汤培养基，混合均匀后，再加入1mL无菌水。将两组混合培养物放置于37±1℃条件下静置培养24小时。计数大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的数量。

(4)结果计算：

式中：

X——抑菌率％；

A——共培养后空白对照组的平板菌落数；

B——共培养后实验组的平板菌落数。

白色念珠菌和黑曲霉的抑菌实验操作如下：

(1)菌悬液的制备：取枯草芽孢杆菌YHX001J、白色念珠菌、黑曲霉，接种到已灭菌的100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，置于30±1℃条件下培养24小时。用接种环将培养好的菌悬液划线于PDA培养基平板上，置于30±1℃条件下培养24小时。取各菌单菌落至已灭菌的沙氏葡萄糖液体培养基中混合均匀，置于30±1℃条件下培养24小时。

(2)菌悬液的稀释计数：分别对培养后的菌液进行稀释计数，菌悬液先保存在4℃冰箱中备用，待计数结果出来后，分别将三种菌调整至10⁶-10⁷CFU/mL。

(3)共培养：在无菌操作下，实验组吸取白色念珠菌或黑曲霉菌悬液1ml接种至98ml沙氏葡萄糖液体培养基，混合均匀，再加入1mL枯草芽孢杆菌YHX001J。对照组取1ml白色念珠菌或黑曲霉菌悬液接种至98ml沙氏葡萄糖液体培养基，混合均匀后再加入1ml无菌水。将两组混合培养物放置于30±1℃条件下静置养48小时。计数白色念珠菌和黑曲霉的数量。

(4)结果计算：

式中：

X——抑菌率％；

A——共培养后空白对照组的平板菌落数；

B——共培养后实验组的平板菌落数。

表1枯草芽孢杆菌YHX001J的抑菌效果

从表1中可以看出，枯草芽孢杆菌YHX001J对常见的病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉具有较强的抑制作用。

实施例4枯草芽孢杆菌YHX001J对螨虫的抑制作用

通过显微镜观察螨虫的活力和杀灭情况来判断枯草芽孢杆菌YHX001J对螨虫的生长抑制作用，具体步骤如下：

(1)菌种活化：使用营养琼脂培养基对保存的枯草芽孢杆菌YHX001J进行划线活化，温度为37℃，培养时间24h，营养琼脂培养基配方为同实施例1。

(2)挑取健壮的单菌落接种于营养肉汤培养基中，37℃培养12～18小时备用。

(3)在显微镜下挑选活动活跃的屋尘螨120只，每组40只进行分组，分为3组。阴性对照组加入1600μL营养肉汤培养基，阳性对照组加入1600μL 70％二甲基亚砜溶液，试验组加入1600μL枯草芽孢杆菌YHX001J菌悬液(10⁸CFU/mL)。为保证各孔中的液体与虫体充分接触，把细胞培养板置于温度为25℃、相对湿度为75％的恒温培养箱中保育，每隔1小时取出，在显微镜下观察记录屋尘螨的活动和死亡情况。

屋尘螨活动程度判断标准如下：

+：活动迟缓，1～2只足爪和螯肢活动，且1分钟活动低于5次；

++：活动明显3～4只足爪和螯肢活动，且1分钟活动10～15次；

+++：活动活跃，5只及以上足爪和螯肢活动，且1分钟活动20次以上。

屋尘螨死亡判定标准如下：

在光学显微镜高倍镜下(×40)连续观察1分钟，足爪或螯肢不动者初步判定为死亡，继续观察5分钟，并用0号解剖针刺激，仍不动者确认死亡。

表2 4h处理后各组屋尘螨的活动和死亡状况

从表2中可以看出，处理4h后，阴性对照组屋尘螨死亡率为20％，阳性对照组屋尘螨已全部死亡，试验组螨虫死亡率为57.5％，高出阴性对照组37.5％。这表明枯草芽孢杆菌YHX001J可以抑制屋尘螨的活性，甚至具有一定的杀灭作用，因此枯草芽孢杆菌YHX001J对屋尘螨具有较好的抑制或者杀灭作用。

实施例5枯草芽孢杆菌YHX001J菌液制剂的制备方法

(1)菌种活化：使用营养琼脂培养基对保存的枯草芽孢杆菌YHX001J进行划线活化，温度为37℃，培养时间24h，营养琼脂培养基配方同实施例1。

(2)种子液的制备：将活化的单菌落接种于营养肉汤培养基中，置于37℃条件下振荡培养24-48h，取样进行染色等鉴定，防止污染。

(3)发酵：接种量为5％，37℃条件下发酵24h，在显微镜下观察芽孢率，当芽孢率达到90％以上时，停止发酵。发酵培养基具体组成如下：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，氯化钾2g/L，七水硫酸镁0.4g/L，氯化钙2mM，氯化锰0.4mM，硫酸亚铁0.005mM。

(4)膜过滤浓缩：发酵结束后将发酵液转移至膜过滤设备物料桶中，对菌体进行膜过滤和浓缩得到浓缩液并进行芽孢计数，滤膜孔径200nm。

(5)稀释与灌装：根据膜过滤浓缩液的芽孢计数结果及最终灌装终浓度(芽孢数含量2×10⁶CFU/mL)，确定合适的稀释倍数后，量取适量的浓缩液加入灭菌纯化水进行稀释并采用小型灌装机分装成小瓶(100mL/瓶或300mL/瓶)

综上所述，枯草芽孢杆菌YHX001J对常见病原微生物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉具有较强的抑制作用；对尘螨具有较好的抑制作用，能抑制尘螨的活动能力，甚至引起尘螨的死亡，因此该菌株在居家清洁产品中具有较大的应用潜力。

Claims (4)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YHX001J，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M2022266。

2.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YHX001J在抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉中的应用。

3.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YHX001J在抑制或杀灭屋尘螨中的应用。

4.一种枯草芽孢杆菌液体制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC NO：M 2022266。

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