CN108048373A - 一株枯草芽孢杆菌ah1005及其应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌ah1005及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，特别涉及一株枯草芽孢杆菌AH1005及其应用，所述枯草芽孢杆菌AH1005保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏名称：枯草芽孢杆菌AH1005，保藏编号：CCTCC NO:M2017481，保藏日期2017年9月8日。本发明的枯草芽孢杆菌AH1005是从金黄色葡萄球菌培养基上分离出来的，产生的细菌素具有较宽的抗菌谱，该细菌素具有抗菌活性高，有较广的抑菌谱，热稳定性较好，酸碱度对其影响不大。

Description

一株枯草芽孢杆菌AH1005及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，特别涉及一株枯草芽孢杆菌AH1005及其应用。
背景技术
人类和动物的细菌性疾病的防治过于依赖抗菌药物，致使抗菌药物不合理使用的现象普遍存在，病原菌对各种抗菌药物的耐药性越来越强，甚至出现了超级细菌。目前，已经不存在不耐药的细菌，也不存在对抗菌药物十分敏感的细菌，耐药性致病菌株的增多对疾病的防治产生了巨大的阻碍，使得对疾病的治疗越发的困难。因此，研究者们正在努力寻找不易产生耐药性且有抗菌活性物质来代替抗菌药物治疗细菌疾病。
细菌素由细菌或古细菌基因编码，是某些细菌在代谢过程中由核糖体合成并分泌到胞外的具有抗菌活性的多肽或前体多肽，细菌素的生产菌对自身分泌的细菌素具有免疫力，早期的研究认为细菌素只对同种或具有近缘关系的细菌起作用，通过在靶细胞上穿孔、抑制肽聚糖合成，与核糖体或tRNA相互作用抑制蛋白质合成，直接降解靶细胞DNA，从而起到抑菌效果。然而，近年来越来越多的研究结果表明，一种细菌素也可能对其他多种细菌起到抑杀作用。不同于抗生素，细菌素属于的蛋白质类物质，阻碍某些微生物的生长的同时不易产生抗药性，可以被一些酶类降解，对人体不会产生致病作用，具有替代抗菌药物的巨大潜力。
发明内容
本发明的枯草芽孢杆菌AH1005能够产生具有抑菌活性的细菌素，该细菌素具有抗菌活性高，有较广的抑菌谱，热稳定性较好，酸碱度对其影响不大，作为替代抗菌药物的物质有很大的研发潜力。
本发明提供了枯草芽孢杆菌AH1005，所述枯草芽孢杆菌AH1005保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.大学，保藏名称：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilisAH1005，保藏编号：CCTCC NO:M2017481，保藏日期2017 年9月8日。
优选的，所述枯草芽孢杆菌AH1005为革兰氏阳性芽孢链杆菌，能发酵葡萄糖只产酸，不能利用乳糖和麦芽糖，VP试验为阳性；吲哚形成和甲基红试验均为阴性；在固体培养基上生长时可见灰白色圆形、扁平干燥菌落，最适生长温度是28℃-38℃。
优选的，所述枯草芽孢杆菌AH1005在产细菌素中的应用。
优选的，所述枯草芽孢杆菌AH1005产生的细菌素对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、山羊大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、奶牛肠球菌、鸡沙门氏菌以及鸡大肠杆菌具有抑制生长作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的枯草芽孢杆菌AH1005能够产生具有抑菌活性的细菌素，该细菌素具有抗菌活性高，有较广的抑菌谱，对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、山羊大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、奶牛肠球菌、鸡沙门氏菌以及鸡大肠杆菌具有抑制生长作用，且该细菌素热稳定性较好，酸碱度对其影响不大，作为替代抗菌药物的物质有很大的研发潜力。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌AH1005菌落对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果图；
图2为本发明枯草芽孢杆菌AH1005革兰染色结果图；
图3为本发明枯草芽孢杆菌AH1005在血琼脂培养基上的生长效果图；
图4为本发明枯草芽孢杆菌AH1005在含5％小牛血清的TSA琼脂培养基上的生长效果图；
图5为本发明枯草芽孢杆菌AH1005在普通营养琼脂培养基上的生长效果图；
图6为本发明枯草芽孢杆菌AH1005在LB液体培养基中37℃培养24h的生长效果图，左管为震荡培养；右管为静置培养；
图7为本发明枯草芽孢杆菌AH1005PCR产物凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面结合附图1-7对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一株枯草芽孢杆菌AH1005，所述枯草芽孢杆菌AH1005保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏名称：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis AH1005，保藏编号：CCTCC NO:M2017481，保藏日期2017年9月8 日。
上述枯草芽孢杆菌AH1005是从培养金黄色葡萄球菌的营养琼脂培养基上分离培养得到，图1箭头指示菌落为本发明枯草芽孢杆菌菌落，从图1中可看出该菌落周围的金黄色葡萄球菌生长明显受到抑制。
该菌为革兰氏阳性芽孢链杆菌，图2为本发明枯草芽孢杆菌AH1005的革兰染色结果，从图2中可看出染色结果呈紫色。该菌能发酵葡萄糖只产酸，不能利用乳糖和麦芽糖，VP试验为阳性；吲哚形成和甲基红试验均为阴性；同源性分析表明该菌与枯草芽孢杆菌DQ198162.1同源性达99.4％。本发明枯草芽孢杆菌AH1005的16SrRNA基因序列如下：
5’-tgcagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctg cctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaag gtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgat gcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagta gggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctg ttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgt gccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttctta agtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagt ggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaact gacgctgaggagcgaaagcgtgggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgct aagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagact gaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacctt accaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgt cgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttggg cactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctggg ctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcag ttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacg ttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggag ccagccgccga-3’，如SEQ IDNO.1所示。
本发明枯草芽孢杆菌AH1005在多种培养基上均能生长，表1为本发明枯草芽孢杆菌在各种培养基上的生长表现：
表1枯草芽孢杆菌在各种培养基上的生长表现
其中，图3-图6为枯草芽孢杆菌AH1005在各种培养基上的生长表现图。结合图3-图6和上表可知本发明枯草芽孢杆菌AH1005在多种培养基上均能生长，扩大培养方便。
枯草芽孢杆菌AH1005最适生长温度是28℃-38℃，能应用于生产细菌素为证明本发明枯草芽孢杆菌AH1005细菌素的抑菌效果，对该菌液体培养基中提取的细菌素与发酵上清液做了抑菌试验：
发酵上清液制备：用接种环挑取该菌单个菌落接种于LB液体培养基内， 37℃/150r/min摇床震荡培养48h，将培养液6000r/min，4℃，离心10min除去该菌菌体，保留上清液即可。
提取细菌素制备：质量浓度为36.46％的盐酸溶液将上述发酵上清液的pH 值调至1.8-2.5，4℃过夜沉淀，10000r/min，4℃，离心20min，弃去上清，沉淀用pH为6.5的磷酸盐缓冲液溶解，即为提取的细菌素，-20℃保存备用。
表2为试验结果：
表2枯草芽孢杆菌发酵上清液和提取的细菌素的抑菌试验结果
从表2中可知：细菌素的含量影响抑菌圈的大小，细菌素含量越多抑菌效果越明显，即发酵上清液没有粗提细菌素的抑菌效果好，粗提细菌素对枯草芽孢杆菌AH1005自身没有抑菌作用，但对另一株枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、山羊大肠杆菌、黄牛肠球菌均具有较好的抑菌效果；同时也说明发酵上清液中的脂肪酸、氨等其他代谢物质没有明显的抑菌效果。
图7为本发明枯草芽孢杆菌PCR产物凝胶电泳结果图，图7中的M为分子量标准DL2000，1和2均为该菌的16SrRNA序列的PCR产物的1％琼脂糖电泳结果，为后续从分子水平鉴定菌种铺垫。
本发明中的枯草芽孢杆菌AH1005产生的细菌素对其他枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、山羊大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、奶牛肠球菌、鸡沙门氏菌具有抑制生长作用，作为替代抗菌药物的物质有很大的研发潜力。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一株枯草芽孢杆菌AH1005及其应用
<141> 2018-01-26
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1421
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌AH1005
<400> 1
tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420
ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720
cgtgggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960
tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200
caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260
gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg a 1421

Claims (4)

1.一株枯草芽孢杆菌AH1005，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌AH1005保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏名称：枯草芽孢杆菌AH1005，保藏编号：CCTCC NO:M2017481，保藏日期2017年9月8日。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌AH1005，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌AH1005为革兰氏阳性芽孢链杆菌，能发酵葡萄糖只产酸，不能利用乳糖和麦芽糖，VP试验为阳性；吲哚形成和甲基红试验均为阴性；在固体培养基上生长时可见灰白色圆形、扁平干燥菌落，最适生长温度是28℃-38℃。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌AH1005在产细菌素中的应用。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌AH1005在产细菌素中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌AH1005产生的细菌素对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、山羊大肠杆菌、奶牛大肠杆菌、奶牛肠球菌、鸡沙门氏菌以及鸡大肠杆菌具有抑制生长作用。
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