CN105385729A - 格氏乳球菌细菌素及其制备方法和应用 - Google Patents

格氏乳球菌细菌素及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)细菌素及其制备方法和应用。本发明利用格氏乳球菌进行发酵培养，再对其培养发酵液通过pH吸附法进行细菌素的提取，可获得高产量的格氏乳球菌细菌素，1L发酵液可制备800mg以上的格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)细菌素。该格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)细菌素具有很强的广谱抑菌能力，对引起人类疾病以及食物腐败的一些革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有很强的抑制作用。本发明的格氏乳球菌(Lactococcus？garviea)细菌素具有治疗与预防急慢性肠炎的作用。

Description

格氏乳球菌细菌素及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种格氏乳球菌细菌素及其制备方法和应用。
背景技术
细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的分泌到环境中的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽。细菌素与抗生素的根本差别是大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，而且无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不污染环境。因此细菌素可以部分减少甚至取代抗生素的使用。细菌素由于无毒、无副作用、无残留、无抗药性，并可以抑制或杀死一些食物腐败菌，具有一定的热稳定性，易被人体消化道的部分蛋白酶降解，因此不会在体内积蓄引起不良反应，也不会影响抗生素的活性，在食品中易扩散，使用较方便，同时也不污染环境，因而受到食品、医疗、饲料等行业的青睐。
细菌素的产量除了与菌株自身性质有关外，发酵条件对细菌素的产量有很大影响，如培养基成分、有机溶剂、培养温度、培养时间、培养方式、起始pH值、接种量和接种种龄等，其中以培养基成分、有机溶剂和培养温度影响较大。
目前只有Nisin和pediocinPA-1/AcH在工业中有应用，但由于这些细菌素只对大多数革兰氏阳性细菌有抑制作用，但对革兰氏阴性细菌无作用，而且在酸性环境下不稳定，这使得目前乳酸菌细菌的应用范围较窄，限制了其在食品中的应用。因此开发新型广谱、抗菌活性强，稳定性强的乳酸菌细菌素已成为目前的发展趋势。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，该细菌素由格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)的发酵培养液提取得到。
实现上述发明目的具体技术方案如下：
一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素由保藏编号为CCTCCNO:M2015633的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)的发酵液提取得到，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在营养肉汤中活化；
(2)格氏乳球菌的发酵培养：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接种于培养基中进行发酵培养，得发酵液；
(3)细菌素的提取：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8～9.6，放置1h～4h后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7～6.5，振荡1h～4h后离心，收集上清液；将上清液浓缩，冷冻干燥，即得到所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述培养基为改良的M17培养基，其成分为：L-阿拉伯糖0.1g～5g，植物蛋白胨5g～10g，酵母粉5g～10g，聚蛋白胨3g～7g，抗坏血酸0.3g～0.7g，牛肉膏1.0g～2.0g，MgSO4·7H2O0.005g～0.015g，β-甘油磷酸二钠5g-15g，蒸馏水1000mL。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖0.1g，植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，β-甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述活化的时间为12h～48h，活化的温度为32℃～45℃，活化的转速为100rpm～280rpm。
在其中一些实施例中，步骤(2)将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按体积比为0.5％～10.0％的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为12h～144h，温度为25℃～45℃，转速为100rpm～280rpm。
在其中一些实施例中，步骤(2)将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按体积比为10.0％的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为144h，温度为32℃，转速为240rpm。
在其中一些实施例中，步骤(3)的细菌素的提取方法为：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8，4℃下放置1h后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7，在4℃下振荡1h后离心，收集上清液；将上清液浓缩至原体积的1/2，冷冻干燥，即得到所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。
本发明的另一目的在于提供一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。
具体技术方案如下：
一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素，由上述制备方法制备而得。
本发明的另一目的在于提供上述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的应用。
具体技术方案如下：
上述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素在制备细菌抑制剂、真菌抑制剂以及生物防腐剂中的应用，所述细菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，所述真菌为酵母、霉菌。
上述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素在制备防治急性肠炎或慢性肠炎的药物中的应用。
本发明的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)已于2015年10月22号保藏于武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山)，保存期为三十年，保藏编号CCTCCM2015633。
本发明筛选得到一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)，其保藏编号为CCTCCM2015633，对该格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)的发酵液进行提取可获得抑菌范围广的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。本发明用含阿拉伯糖的培养基来诱导培养格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)，再对其培养发酵液通过pH吸附法进行细菌素的提取，可获得高产量的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素，1L发酵液可制备800mg以上的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。该格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素具有很强的广谱抑菌能力，对引起人类疾病以及食物腐败的一些革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母和霉菌均有很强的抑制作用。本发明的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素具有治疗与预防急慢性肠炎的作用。本发明制备的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素还可以用于制备食品、医药、化妆品、饲料等行业防腐剂。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，按本领域内常规方法和条件进行。格式乳球菌(Lactococcusgarviea)保藏在武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏编号CCTCCM2015633。
实施例1
本实施例的一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，包括以下步骤：
(1)格式乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在营养肉汤中活化48h，活化温度为32℃，转速为240rpm；
(2)格式乳球菌的发酵培养：活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按10％(v/v)的接种量接种于改良的M17培养基中，发酵培养144h，培养温度为32℃，转速为100rpm，得到发酵液；所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖0.1g，植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，β-甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL；
(3)细菌素的提取：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8，4℃下放置1h，使格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)充分吸附细菌素；在8000rpm下离心5min，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7，在4℃下振荡1h，在8000rpm下离心5min收集上清液；将上清液旋转蒸发浓缩至原体积的1/2后冷冻干燥，得到格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素837mg。
实施例2
本实施例的一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，包括以下步骤：
(1)格式乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在营养肉汤中活化12h，活化温度为37℃，转速为240rpm；
(2)格式乳球菌的发酵培养：活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按0.5％(v/v)的接种量接种于改良的M17培养基中，发酵培养12h，培养温度为37℃，转速为100rpm，得到发酵液；所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖5g，植物蛋白胨10g，酵母粉10g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，β-甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL；
(3)细菌素的提取：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8，4℃下放置1h，使格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)充分吸附细菌素；在8000rpm下离心5min，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7，在4℃下振荡1h，在8000rpm下离心5min收集上清液；将上清液旋转蒸发浓缩至原体积的1/2后冷冻干燥，得到格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素845mg。
实施例3
本实施例的一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，包括以下步骤：
(1)格式乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在营养肉汤中活化12h，活化温度为37℃，转速为240rpm；
(2)格式乳球菌的发酵培养：活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按0.5％(v/v)的接种量接种于改良的M17培养基中，发酵培养12h，培养温度为37℃，转速为240rpm，得到发酵液；所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖1g，植物蛋白胨10g，酵母粉10g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，β-甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL；
(3)细菌素的提取：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为9.6，4℃下放置1h，使格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)充分吸附细菌素；在8000rpm下离心5min，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为6.5，在4℃下振荡4h，在8000rpm下离心5min收集上清液；将上清液旋转蒸发浓缩至原体积的1/2后冷冻干燥，得到格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素889mg。
实施例4抑菌活性检测
将指示菌接入30mLLB液体培养基中，30℃下培养24h后测其OD600，用无水蒸馏水稀释OD600为0.2，取100μL指示菌菌液(OD600为0.2)涂布于LB琼脂培养基中，待其凝固后放入牛津杯。将实施例1所制备的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素配制成0.1mg/mL的溶液，吸取50μL加入到牛津杯中，30℃下培养24h。实验结果如表1所示。
格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有不同程度的抑制作用，绝大部分是致病菌或者条件致病菌，会直接或间接导致人类疾病或者使食物发生腐败；如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌是细菌性食物中毒的主要病原菌；食物腐败菌黄曲霉会产生1类致癌物黄曲霉毒素；加德纳杆菌会引起女性细菌性阴道炎。其中，格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素对金黄色葡萄球菌、嗜酸链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌圈超过20mm；只有对产气荚膜菌、黄曲霉的抑菌能力稍弱，只有5～10mm；对其他22株菌的抑菌效果也较佳，抑菌圈在10～20mm。因此，具有广谱抑菌作用的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素具有很大的潜力可以应用于食品、医药、饲料等行业。
表1格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素抑菌谱
实施例5防治急慢性肠炎的效果实验
把10周大的BALB/C小鼠分成8组：1组空白对照组、1组50％酒精(v/v)对照组、3组2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的急性肠炎模型组，3组TNBS诱导的慢性肠炎模型组，每组24只，分组及每组的处理方式以及实验结果如表2所示。结果表明：格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素可以预防和治疗小鼠急慢性肠炎。
表2BALB/C小鼠分组、处理方式及实验结果
注：表中细菌素为实施例1制备的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素用生理盐水配置的溶液，浓度为0.1mg/mL；TNBS/50％酒精的浓度为1.0mg/mL。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素由保藏编号为CCTCCM2015633的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)的发酵液提取得到，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)在营养肉汤中活化；
(2)格氏乳球菌的发酵培养：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)接种于培养基中进行发酵培养，得发酵液；
(3)细菌素的提取：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8～9.6，放置1h～4h后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7～6.5，振荡1h～4h后离心，收集上清液；将上清液浓缩，冷冻干燥，即得到所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。
2.根据权利要求1所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基为改良的M17培养基，其成分为：L-阿拉伯糖0.1g～5g，植物蛋白胨5g～10g，酵母粉5g～10g，聚蛋白胨3g～7g，抗坏血酸0.3g～0.7g，牛肉膏1.0g～2.0g，MgSO4·7H2O0.005g～0.015g，β-甘油磷酸二钠5g-15g，蒸馏水1000mL。
3.根据权利要求2所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述改良的M17培养基的成分为：L-阿拉伯糖0.1g，植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏1.5g，MgSO4·7H2O0.01g，β-甘油磷酸二钠10g，蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述活化的时间为12h～48h，活化的温度为32℃～45℃，活化的转速为100rpm～280rpm。
5.根据权利要求1-3任一项所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(2)将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按体积比为0.5％～10.0％的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为12h～144h，温度为25℃～45℃，转速为100rpm～280rpm。
6.根据权利要求5所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(2)将活化后的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)按体积比为10.0％的接种量接种于培养基中进行发酵培养，发酵培养的时间为144h，温度为32℃，转速为240rpm。
7.根据权利要求1-3任一项所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述细菌素的提取的方法为：调节步骤(2)得到的发酵液的pH值为8.8，4℃下放置1h后离心，收集菌体；将菌体悬浮于蒸馏水中，调节pH为4.7，在4℃下振荡1h后离心，收集上清液；将上清液浓缩至原体积的1/2，冷冻干燥，即得到所述格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素。
8.一种格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备而得。
9.权利要求8所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素在制备细菌抑制剂、真菌抑制剂以及生物防腐剂中的应用，所述细菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，所述真菌为酵母、霉菌。
10.权利要求8所述的格氏乳球菌(Lactococcusgarviea)细菌素在制备防治急性肠炎或慢性肠炎的药物中的应用。
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