CN111690566A - 一株特基拉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株特基拉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)D5‑8，保藏编号为CGMCC No.15973，并提供了特基拉芽孢杆菌D5‑8在防止粮食霉变中的应用，具体步骤为：将特基拉芽孢杆菌D5‑8菌液均匀喷洒至粮食表面。本发明提供的特基拉芽孢杆菌D5‑8用于防止粮食霉变，效果良好，成本低廉。

Description

一株特基拉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一株特基拉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
粮食霉变是由微生物作用引起的粮食品质的劣变，由于微生物的作用程度不同或种类不同，在粮食霉变过程中，出现的表征也不同，如发热、变色、变味、生霉及霉烂等。根据联合国粮农组织的调查，全球每年约有25％的粮食受到真菌毒素污染，约有2％的农作物因污染严重而失去利用价值。引起粮食霉变的微生物主要是真菌，如曲霉菌、青霉菌、镰刀菌等。在粮食霉变过程中，真菌不仅可以引起粮食变质，还可产生真菌毒素，黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素等。真菌毒素对人和禽畜均存在巨大威胁，同时，饲料中的真菌毒素还可在禽畜产品中累积，威胁人类食品安全。
目前，对于已经受到真菌污染的粮食或食品，主要通过物理去除及吸附、化学处理、生物降解等技术降低其危害，但是仍缺少高效的降解或处理方式。
因此，研发一种将防止粮食霉变的关口前置，将粮食在贮存入库时进行处理，防止贮藏过程中产生霉变的方法是本领域人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)D5-8，保藏编号为CGMCCNo.15973，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年6月20日，分类命名：特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。
本发明提供的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)D5-8的生物学特性为：
LB培养基(LB Medium)培养的菌落呈现典型芽孢杆菌特征，菌落形态为圆形或不规则形，菌落直径2-4mm，边缘粗糙。菌落表面粗糙褶皱，白色不透明；可在4-54℃生长，革兰氏染色为阳性。
本发明提供的特基拉芽孢杆菌D5-8有产蛋白酶活性，分离自德国小蠊(Blattellagermanica)消化道。本发明特基拉芽孢杆菌D5-8有拮抗假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)功能。
进一步，上述特基拉芽孢杆菌在防止粮食霉变中的应用。
进一步，上述粮食包括小麦、玉米、谷子、稻谷。
进一步，上述特基拉芽孢杆菌在防止粮食霉变中的应用，具体步骤为：将上述特基拉芽孢杆菌D5-8制成特基拉芽孢杆菌D5-8菌液均匀喷洒至粮食表面。
进一步，将上述特基拉芽孢杆菌D5-8菌液均匀喷洒至粮食表面至表面湿润而无液体滴下。
进一步，上述特基拉芽孢杆菌D5-8菌液的制备方法包括以下步骤：
(1)选用标准固体LB培养基，调节pH值至6.5-8.5，待平板培养皿冷却至室温后，接种菌株特基拉芽孢杆菌D5-8，在温度为25℃-35℃的条件下培养1-3天，得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落；
(2)选用标准液体LB培养基，调节pH值至6.5-8.5，接种步骤(1)所得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落，在温度为25℃-35℃的条件下，转速为220rpm的摇床上培养1-3天，得培养液；
(3)将步骤(2)所得培养液在温度为8℃的条件下冷藏8小时，取出后静置至常温，然后加水稀释，得特基拉芽孢杆菌D5-8菌液。
进一步，上述调节pH值所用pH值调节剂为NaOH溶液。
进一步，步骤(2)接种比例为：每1L标准液体LB培养基接种1cm2步骤(1)扩繁后的的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落。
进一步，步骤(3)培养液与水的体积比为1:100-10000。
本发明的有益效果：本发明提供的特基拉芽孢杆菌D5-8用于防止粮食霉变，效果良好，成本低廉。
附图说明
图1为喷洒实施例3特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对小麦的的霉变率；
图2为喷洒实施例3特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对玉米的的霉变率；
图3为喷洒实施例3特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对谷子的的霉变率；
图4为喷洒实施例4特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对小麦的的霉变率；
图5为喷洒实施例4特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对玉米的的霉变率；
图6为喷洒实施例4特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对谷子的的霉变率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
特基拉芽孢杆菌D5-8分离纯化
德国小蠊是山东第一医科大学病媒生物与虫媒病实验室饲养的品系，已在实验室内连续传代饲养15年。在分离特基拉芽孢杆菌时，首先将德国小蠊成虫体表以75％酒精漂洗3次，每次2分钟，再用无菌水漂洗3次后解剖，获得完整的德国小蠊消化首。
1.灭菌
所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。
2.研磨
将德国小蠊消化道剪碎后放入无菌离心管中，加入1ml无菌水，用研磨棒充分研磨。
3.梯度稀释
取研磨后的汁液1ml，放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-1稀释度的菌液，再从10-1稀释度的菌液中取1ml放入盛有9ml无菌水的试管中，即为10-2稀释度的菌液，以此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的菌液。
4.培养基的配置
细菌的分离常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，纯化常用LB培养基。
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；PH7.0，121℃灭菌20min。
倒平板，每个培养皿倒大约15ml的培养基，平放静置，待冷却备用。
5.涂布
将稀释菌液10-4、10-5、10-6、10-7分别涂布于平板上，每个梯度涂3皿，并在皿底做上标记。
6.培养
倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。
7.菌的纯化
在无菌条件下用挑针将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养。纯化3-4次可得纯化后的单菌落。
实施例2
特基拉芽孢杆菌D5-8培养条件研究
1.温度
将特基拉芽孢杆菌D5-8接种于pH7.0的LB培养基，分别在15℃、25℃、30℃、35℃、40℃温度条件下，转速为220r/min的摇床培养，培养了24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。见表1，比较各温度条件下特基拉芽孢杆菌培养液的OD600值可知，特基拉芽孢杆菌D5-8的最适培养温度为30℃，较适宜的生长范围在25℃-35℃之间。
表1温度对特基拉芽孢杆菌生长的影响
温度 OD<sub>600</sub>
15℃ 1.056±0.055d
20℃ 1.227±0.099c
25℃ 1.397±0.058b
30℃ 1.597±0.054a
35℃ 1.514±0.119ab
40℃ 1.270±0.114c
2.pH值
特基拉芽孢杆菌分别接种于pH为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5的LB培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。见表2，比较各pH条件下特基拉芽孢杆菌培养液的OD600值可知，在5.5-8.5pH范围之间特基拉芽孢杆菌均能较好地生长，其中pH为7.5时生长最好。
表2pH对特基拉芽孢杆菌生长的影响
pH OD<sub>600</sub>
5.5 1.156±0.055c
6 1.284±0.116c
6.5 1.46±0.032b
7 1.659±0.099a
7.5 1.554±0.137a
8 1.502±0.0765ab
8.5 1.326±0.044b
3.培养基
特基拉芽孢杆菌分别接种于pH7.0的LB培养基、TSB培养基和NA培养基，在摇床(转速为220r/min，温度为25℃)培养，在24h时取样测定在波长600nm处的光吸收值(OD600)。见表3，在三种培养基中，LB和TSB均适合特基拉芽孢杆菌的生长。
表3培养基对特基拉芽孢杆菌生长的影响
培养基 OD<sub>600</sub>
LB 1.694±0.073a
TSB 1.639±0.015a
NA 1.377±0.049b
注：LB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。
TSB培养基：胰蛋白胨15g；大豆蛋白胨5g；氯化钠5g；琼脂15g；蒸馏水1L；121℃灭菌20min。
NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂18g，水1000ml，121℃灭菌20min。
实施例3
制备特基拉芽孢杆菌D5-8菌液，具体包括以下步骤：
(1)选用标准固体LB培养基，调节pH值至6.5，待平板培养皿冷却至室温后，接种特基拉芽孢杆菌D5-8菌株，在温度为25℃的条件下培养1天，得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落；
(2)选用标准液体LB培养基，调节pH值至6.5，每1L标准液体LB培养基接种1cm2步骤(1)标准固体LB培养基上扩繁后的的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落，在温度为25℃的条件下，转速为220rpm的摇床上培养1天，得培养液；
(3)将步骤(2)所得培养液在温度为8℃的条件下冷藏8小时，取出后静置至常温，然后加水稀释，培养液与水的体积比为1:100，得特基拉芽孢杆菌D5-8菌液。
实施例4
制备特基拉芽孢杆菌D5-8菌液，具体包括以下步骤：
(1)选用标准固体LB培养基，调节pH值至8.5，待平板培养皿冷却至室温后，接种特基拉芽孢杆菌D5-8菌株，在温度为35℃的条件下培养3天，得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落；
(2)选用标准液体LB培养基，调节pH值至8.5，每1L标准液体LB培养基接种1cm2步骤(1)扩繁后的的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落，在温度为35℃的条件下，转速为220rpm的摇床上培养3天，得培养液；
(3)将步骤(2)所得培养液在温度为8℃的条件下冷藏8小时，取出后静置至常温，然后加水稀释，培养液与水的体积比为1:1000，得特基拉芽孢杆菌D5-8菌液。
实施例5
制备特基拉芽孢杆菌D5-8菌液，具体包括以下步骤：
(1)选用标准固体LB培养基，调节pH值至7，待平板培养皿冷却至室温后，接种特基拉芽孢杆菌D5-8菌株，在温度为30℃的条件下培养2天，得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落；
(2)选用标准液体LB培养基，调节pH值至7，每1L标准液体LB培养基接种1cm2步骤(1)扩繁后的的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落，在温度为30℃的条件下，转速为220rpm的摇床上培养2天，得培养液；
(3)将步骤(2)所得培养液在温度为8℃的条件下冷藏8小时，取出后静置至常温，然后加水稀释，培养液与水的体积比为1:10000，得特基拉芽孢杆菌D5-8菌液。
实施例6
测定特基拉芽孢杆菌D5-8菌液对小麦、玉米、谷子的霉变保护作用
小麦、玉米、谷子每种粮食选择100粒用于测试，设置3次重复。对照组粮食籽粒不做任何处理，处理组粮食籽粒表面分别喷洒实施例3和实施例5制备的特基拉芽孢杆菌D5-8菌液，自然风干或以吹风机快速烘干，然后将粮食分别置于玻璃瓶内，表面喷洒清水，模拟粮食淋雨受潮，置于开放环境中，任其霉变，分别于1，3，6，9周，计数粮食霉变籽粒数。图1-图6结果表明，喷洒实施例3制备的特基拉芽孢杆菌D5-8菌液的粮食霉变率均在10％以下，喷洒实施例4制备的特基拉芽孢杆菌D5-8菌液的粮食霉变率均在15％以下，而对照组粮食霉变率均达60％以上。因此未经特基拉芽孢杆菌D5-8菌液保护的粮食已基本失去任何利用价值，而喷洒特基拉芽孢杆菌D5-8菌液的粮食得到良好保护。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一株特基拉芽孢杆菌，其特征在于，该菌是特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)D5-8，保藏编号为CGMCC No.15973，保藏日期为2018年6月20日。
2.根据权利要求1所述的一株特基拉芽孢杆菌在防止粮食霉变中的应用。
3.根据权利要求2所述的一株特基拉芽孢杆菌在防止粮食霉变中的应用，其特征在于，具体步骤为：将所述特基拉芽孢杆菌D5-8制成特基拉芽孢杆菌D5-8菌液均匀喷洒至粮食表面。
4.根据权利要求3所述的一株特基拉芽孢杆菌在防止粮食霉变中的应用，其特征在于，所述特基拉芽孢杆菌D5-8菌液的制备方法包括以下步骤：
(1)选用标准固体LB培养基，调节pH值至6.5-8.5，待平板培养皿冷却至室温后，接种菌株特基拉芽孢杆菌D5-8，在温度为25℃-35℃的条件下培养1-3天，得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落；
(2)选用标准液体LB培养基，调节pH值至6.5-8.5，接种步骤(1)所得扩繁后的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落，在温度为25℃-35℃的条件下，转速为220rpm的摇床上培养1-3天，得培养液；
(3)将步骤(2)所得培养液在温度为8℃的条件下冷藏8小时，取出后静置至室温，然后加水稀释，得特基拉芽孢杆菌D5-8菌液。
5.根据权利要求4所述的一株特基拉芽孢杆菌D5-8在防止粮食霉变中的应用，其特征在于，步骤(2)所述接种比例为：每1L标准液体LB培养基接种1cm2步骤(1)扩繁后的的特基拉芽孢杆菌D5-8菌落。
6.根据权利要求4所述的一株特基拉芽孢杆菌D5-8在防止粮食霉变中的应用，其特征在于，步骤(3)所述培养液与水的体积比为1:100-10000。
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