CN114703096B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 - Google Patents
一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114703096B CN114703096B CN202210335855.4A CN202210335855A CN114703096B CN 114703096 B CN114703096 B CN 114703096B CN 202210335855 A CN202210335855 A CN 202210335855A CN 114703096 B CN114703096 B CN 114703096B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vomitoxin
- strain
- bacillus
- feed
- cgmcc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 45
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title description 28
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title description 28
- 231100000757 Microbial toxin Toxicity 0.000 title description 5
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 claims abstract description 100
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 100
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 22
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 22
- MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N trans-Zearalenon Natural products O=C1OC(C)CCCC(=O)CCCC=CC2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 claims abstract description 11
- MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N zearalenone Chemical compound O=C1O[C@@H](C)CCCC(=O)CCC\C=C\C2=CC(O)=CC(O)=C21 MBMQEIFVQACCCH-QBODLPLBSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims abstract description 8
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 claims abstract description 8
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 15
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 15
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 claims description 8
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 7
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 5
- OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N aflatoxin B1 Chemical compound C=1([C@@H]2C=CO[C@@H]2OC=1C=C(C1=2)OC)C=2OC(=O)C2=C1CCC2=O OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002115 aflatoxin B1 Substances 0.000 claims description 4
- 229930020125 aflatoxin-B1 Natural products 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 27
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 22
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 14
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 14
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 abstract description 10
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 abstract description 10
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 abstract description 8
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 abstract description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 abstract description 4
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 abstract description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 abstract description 4
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 abstract description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 28
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 27
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 19
- 229930002954 deoxynivalenol Natural products 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 7
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 5
- AWMVMTVKBNGEAK-UHFFFAOYSA-N Styrene oxide Chemical compound C1OC1C1=CC=CC=C1 AWMVMTVKBNGEAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001393 triammonium citrate Substances 0.000 description 3
- 235000011046 triammonium citrate Nutrition 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011378 shotcrete Substances 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000008953 bacterial degradation Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229930013292 trichothecene Natural products 0.000 description 1
- LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N trichothecene Chemical compound C12([C@@]3(CC[C@H]2OC2C=C(CCC23C)C)C)CO1 LZAJKCZTKKKZNT-PMNGPLLRSA-N 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
- A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/169—Plantarum
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
- Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及诱变筛选的一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BL‑14及其高效降解饲料原料中呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的液体混合菌液。该菌株BL‑14（CGMCC No.22083）具有丰富的水解酶体系，可产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等，与植物乳杆菌1.2158（CGMCC）、凝结芽孢杆菌1.6565（CGMCC）组合而成的混合菌剂，进行饲料原料发酵，可将原料中呕吐毒素降解83.25%，降解黄曲霉毒素（AFB1）降解90.09%，玉米赤霉烯酮降解80.76%，发酵后的饲料中乳酸含量达到36.5g/Kg，饲料品质优良。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及多种微生物发酵降解呕吐毒素的方法与应用。更具体的说是一株降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素的应用。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又名呕吐毒素（DON），是由镰刀菌属所产生的一种单端胞霉烯族毒素,在禾本科作物生长过程中极易感染的镰刀菌属病害，导致采收后各主要粮食籽粒被毒素污染。同时,在饲料的加工和储存中，粮食类原料极易由于霉变而产生各种霉菌毒素，其中以呕吐毒素污染最为广泛。呕吐毒素是饲料及饲料原料中污染最普遍的霉菌毒素，有报导调查分析2019年山东、河南、江苏、东北等地区，呕吐毒素在饲料及原料中检出率高达93.22%，超标率达27.42%，在检测的毒素中污染最严重。呕吐毒素具有较强的耐热和耐酸能力，在pH10.0下170℃加热15分钟才能完全破坏，因此在以粮食作物为原料制作的食物和饲料的加工过程中DON基本不被破坏或降解，故广泛的在食物链中流通。呕吐毒素具有较强的毒性，猪摄入0.1~0.2mg/kg的呕吐毒素就会引起呕吐，进而引起食欲下降、生长迟缓、抵抗力下降等危害，若长期给动物喂食含有呕吐毒素的饲料，更是会给养殖业特别是养猪业造成极其巨大的损失。若人体长期食用含呕吐毒素的粮食作物或喂食了呕吐毒素污染饲料的动物及其畜产品，会造成如免疫力下降、软骨组织坏死等极大的危害。此外，在粮食作物贮运加工过程中还存在黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的污染，同样危害我们人类的食品安全，尤其是饲料安全。
上述三种微生物导致的毒素的脱除方法有物理法、化学法和生物法。物理方法会对粮食造成营养流失，同时可能产生新的有害物质，且成本大；化学法去除呕吐毒素，污染大，可能增加新的未知物质；生物处理过程温和且利于大规模使用，特别是微生物法脱除呕吐毒素是目前最经济有效的方法。而在饲料生产中，最常用的是物理剔除和吸附法，剔除法主要指的是将受霉菌污染的颗粒、种皮等剔除，消减霉变粒从而显著降低毒素含量。剔除法只适合前期的脱除和预防处理，对原料中已产生的呕吐毒素作用不大。吸附法是处理霉变饲料最常用的物理方法，指在饲料中添加具有吸附毒素功能的吸附剂，通过吸附剂与毒素的稳定结合来去除毒素。但是大部分吸附剂不具有选择性，饲料中的维生素、微量元素等营养物质也会被吸附，同时，吸附剂与呕吐毒素的结合在动物肠道中在消化酶或肠道微生物的影响下并不稳定，从而可能导致呕吐毒素在动物肠道内重新释放，有时甚至会使局部毒素浓度剧增导致危害。
所以，为方便、快捷、低成本且有效地减少饲料原料中污染的呕吐毒素，筛选可高效降解呕吐毒素、安全无害的饲料发酵用菌种，研发出一种可用于饲料添加的微生物菌剂，脱除原料中的呕吐毒素并生产优质的发酵饲料，以此减少养殖业中由于呕吐毒素带来的风险和成本，增加其经济效益。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
本发明通过筛选获得高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BL-14菌株，本发明自行从自然界土壤中分离，可降解呕吐毒素菌株，然后对其进行诱变筛选，获得高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌BL-1，其特征在于，所述BL-14菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(GCMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.22083。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年3月29日，
本发明所述菌株是以苯基环氧乙烷为唯一碳源筛选得到的;
初筛培养基配方（g/L）:(NH4)Cl0.5~1.5g、K2HPO45~10g、MgSO4·7H2O 0.3~0.6g、NaCl 0.2~0.5g、酵母粉0.02~0.04 g、琼脂 20g、pH值6.0~7.0。灭菌后加入过滤除菌的苯基环氧乙烷，使终浓度为10~30 mmol/L。
以含呕吐毒素的液体培养基复筛，最终获得可降解呕吐毒素的菌株；
复筛培养基配方（g/L）:(NH4)Cl0.5~1.5g、K2HPO45~10g、MgSO4·7H2O 0.3~0.6g、NaCl 0.2~0.5g、CuSO4·5H2O 0.02~0.04g,蛋白胨 0.05~0.2 g，葡萄糖0.5~1.0g pH值7.0115℃ 15分钟灭菌。培养基降温到30℃后加入呕吐毒素使其终浓度到1~3ug/mL。所述贝莱斯芽孢杆菌BL-14具有产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力。
本发明进一步公开了所述高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BL-14菌株用于发酵降解饲料原料，特别是玉米淀粉加工副产品中呕吐毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的液体混合菌液，其特征在于它是由芽孢菌和乳酸菌中的一种或两种的组合而成；主要包含贝莱斯芽孢杆菌一株和乳酸菌两株，其中贝莱斯芽孢杆菌和乳酸菌的比例为3:2（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2的接种比例为1:1（v/v）；混合菌液按6%（w/w）的接种量加入物料中进行发酵；
所述乳酸菌R1指的是植物乳杆菌1.2158（CGMCC），乳酸菌R2指的是凝结芽孢杆菌1.6565（CGMCC）。所述乳酸菌R1和乳酸菌R2具有呕吐毒素脱除能力。
本发明同时也公开了高效降解饲料原料中呕吐毒素液体菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BL-14菌株和乳酸菌R1、R2分别在LB固体培养基和MRS固体培养基上活化；
LB固体培养基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、琼脂 20 g、蒸馏水1L，pH值7.0~7.4。
MRS培养基（g/L）：蛋白胨 10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、吐温80 1 g、K2HPO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO35 g、蒸馏水1 L、琼脂18 g，pH值6.2~6.6，115 ℃高压灭菌15 min。
（2）将步骤（1）活化的单菌落分别接种到LB液体培养基和MRS液体培养基中培养，得到种子液；
LB液体培养基（g/L）：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH值7.0~7.4。
MRS液体培养基（g/L）：蛋白胨 10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2 g、吐温80 1 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO35g、蒸馏水1 L，pH值6.2~6.6，115 ℃高压灭菌15 min。
（3）将步骤（2）得到的种子液按比例混合，得到混合菌液；
所述的混合菌液的比例指的是：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BL-14菌株和乳酸菌的比例为3:2（v/v），乳酸菌R1和乳酸菌R2的接种比例为1:1（v/v）。
本发明同时还公开了贝莱斯芽孢杆菌BL-14液体菌剂在用于降解呕吐毒素或者发酵饲料中的应用。特别是用于去除发酵饲料的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮方面的应用。
实验结果显示：将混合菌液按6%（w/w）的接种量加入物料中进行发酵，降解其中的呕吐毒素或者制备发酵饲料。呕吐毒素（DON）降解率可达83.25%，黄曲霉毒素（AFB1）降解率可达90.09%（ZEN）降解率可达80.76%。
本发明更加详细的描述如下：
1、降解呕吐毒素菌株初步筛选：
（1）取天津官港森林公园湿地区域多处芦苇根部土壤，均匀混合，取1克土壤于LB液体培养基中37℃摇床震荡培养24h；
（2）将富集的菌液分别稀释100倍、1000倍，取200微升稀释后菌液涂布于初筛培养基平板上，于培养箱中37℃培养24h；
其中初筛培养基配方（g/L）:
(NH4)Cl0.5~1.5g、K2HPO45~10g、MgSO4·7H2O 0.3~0.6g、NaCl 0.2~0.5g、酵母粉0.02~0.04 g、琼脂 20g、pH值6.0~7.0。灭菌后加入过滤除菌的苯基环氧乙烷，使终浓度为10~30 mmol/L。
（3）挑选生长良好的菌株，接种到LB斜面保藏试管，得到待复筛选的呕吐毒素降解菌株。
2、降解呕吐毒素（DON）菌株复筛过程
（1）将待复筛的呕吐毒素降解菌株在LB平板上划线活化，挑取单菌落接种至LB液体培养基37℃、180rpm振荡培养12小时。
（2）将上述菌液按2%接种量接种到含有1ug/mL呕吐毒素的复筛液体培养基中，37℃、180rpm条件下培养16小时。
复筛液体培养基(g/L):(NH4)Cl0.5~1.5g、K2HPO45~10g、MgSO4·7H2O 0.3~0.6g、NaCl 0.2~0.5g、CuSO4·5H2O0.02~0.04g,蛋白胨0.05~0.2 g，葡萄糖0.5~1.0g pH值7.0115℃ 15分钟灭菌。培养基降温到30℃后加入呕吐毒素使其终浓度到1~3ug/mL；
（3）将上述培养液以8000r/min转速离心10分钟，取上清液，稀释一定倍数后使用ELISA呕吐毒素酶联免疫试剂盒检测呕吐毒素残余量；以未接菌的相同培养基做呕吐毒素检测的对照。计算得到菌株对呕吐毒素的降解率，选取降解率最高的菌株。
通过上述筛选步骤，得到一株呕吐毒素降解效率最高的菌株FBL-4，其DON降解率达到36.7%。
3、诱变降解呕吐毒素（DON）菌株FBL-4获得高降解呕吐毒素的菌株BL-14
以菌株FBL-4为出发菌株，对其进行等离子体诱变处理，将FBL-4活化后培养到对数生长前中期后，分别设置5mm、7mm、9mm、11mm、13mm、15mm几个不同的处理距离，设置ARTP诱变处理时间20s，之后立即将诱变处理菌液涂布在初筛平板（使苯基环氧乙烷30 mmol/L）。37℃培养48h后观察菌落萌发和菌落直径，分别计算不同距离ARTP处理下的致死率和正突变率，结果见图1和图2。
从图2中可知，选择ARTP处理距离9mm，20s进行FBL-4菌株诱变，诱变处理之后涂布到初筛平板上培养48h，观察平板菌落直径，挑选直径大的菌落进行后续筛选。
呕吐毒素降解菌株筛选结果如表1所示，从表1可以看出，本发明最终筛选得到一株可以高效降解呕吐毒素的菌株BL-14，其在含3ug/ml呕吐毒素浓度的培养基中培养16小时，可将呕吐毒素降解92.46%；
表1呕吐毒素降解菌的复筛结果
4、降解呕吐毒素（DON）菌株BL-14的鉴定
菌株BL-14接种于LB培养基上观察其生长，菌株BL-14菌落呈淡黄色圆形，不透明，表面光滑、有光泽，微微隆起，中心有放射状褶皱，易挑起，与培养基结合不紧密，用接种针挑取菌落有粘稠感且湿润见图3。在光学显微镜下染色观察BL-14菌株细胞形态为短杆状革兰氏阳性菌，有部分细胞中心有椭圆形透明未染色部分，判断为芽孢，见图4。通过PCR扩增BL-14菌株的gyrB基因的测序结果如Seq ID No.1所示，在NCBI上进行Blast比对该序列，并进行系统发育分析，见图5，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
5、菌株BL-14的产酶性能
（1）将菌株BL-14从斜面保藏试管接到LB固体培养基37℃培养12小时活化。
（2）挑取单菌落分别点种到可溶性淀粉培养基、酪蛋白培养基和纤维素培养基平板上，37℃培养54小时。
可溶性淀粉培养基(g/L)：牛肉膏5g、蛋白胨5g、NaCl 5g、可溶性淀粉10g、琼脂18g、蒸馏水1L，pH值7.0~7.4。
酪蛋白培养基(g/L)：KH2PO40.36g、MgSO4·7H2O 0.5g、ZnCl20.014g、K2HPO4·7H2O1.07g、NaCl 0.16g、CaCl20.002g、FeSO40.002g、酪蛋白4g、胰蛋白胨0.05g、琼脂20g、蒸馏水1L，pH值7.0~7.4。
纤维素培养基(g/L)：NaNO31g、K2HPO41.2g、KH2PO40.9g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl0.5g、酵母浸出粉0.5g、酸水解酪蛋白0.5g、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5g、琼脂20g、蒸馏水1L，pH值7.0~7.4。
（3）在可溶性淀粉平板上滴加碘液显色；在纤维素平板上滴加1g/L的刚果红溶液染色15分钟后倒去，用1mol/L浓度的NaCl溶液漂洗。
（4）观察平板上透明圈直径（D）菌落直径（d），计算圈径比D/d。
菌株BL-14培养54h时在可溶性淀粉平板、酪蛋白平板和纤维素平板上菌落产透明圈的圈径比分别为1.49、5.46和3.41（图6）。
所述贝莱斯芽孢杆菌BL-14进行产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力检测，菌株BL-14在可溶性淀粉、酪蛋白和羧甲基纤维素钠培养基平板上菌落可生成透明圈，见图6。
6、BL-14菌株专利保藏
贝莱斯芽孢杆菌BL-14 LB固体培养物送达中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(GCMCC)进行专利保藏。贝莱斯芽孢杆菌BL-14，保藏编号为CGMCC No. 22083，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年3月29日。
7、可降解呕吐毒素（DON）的乳酸菌筛选
（1）将实验室保藏的12株产酸乳酸菌从斜面保藏试管接到MRS培养基平板，42℃厌氧培养1d。
其中，MRS培养基（g/L）：蛋白胨 10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、吐温80 1 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO35 g、蒸馏水1 L、琼脂18 g，pH值6.2~6.6，115 ℃高压灭菌15 min。
（2）挑取活化单菌落接种到含有1ug/ml 呕吐毒素的MRS液体培养基中，42℃静置培养48h，以不接菌的含1ug/ml 呕吐毒素的MRS液体培养基为对照，分别取1ml培养液8000r/min离心10min，取上清液并通过0.22um微孔滤膜过滤，稀释一定的倍数，使用ELISA试剂盒检测呕吐毒素残留量，计算呕吐毒素脱除率。
筛选出两株呕吐毒素脱除率较高的乳酸菌RS-1（植物乳杆菌 GCMCC No.1.2158）和RS-10（凝结芽孢杆菌 GCMCC No.1.6565），发酵48h对呕吐毒素的脱除率分别达28.50%和30.29%（图7）。
8、BL-14菌株与乳酸菌共同发酵饲料去除有毒物质
本发明还提供一种用于降解饲料原料（优选玉米淀粉加工副产物）中呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFB1）和呕吐毒素（ZEN）的液体混合菌液，其特征在于它是由一种贝莱斯芽孢杆菌BL-14和两种乳酸菌RS-1和RS-10 组合而成；其中芽孢菌和乳酸菌的比例为3:2（v/v），乳酸菌RS-1和乳酸菌RS-10的接种比例为1:1（v/v）；
所述芽孢菌指的是贝莱斯芽孢杆菌No. 22083（GCMCC），乳酸菌RS-1指的是植物乳杆菌1.2158（CGMCC），乳酸菌RS-10指的是凝结芽孢杆菌1.6565（CGMCC）。
进一步地，降解饲料原料（优选玉米淀粉加工副产物）中呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFB1）和呕吐毒素（ZEN）的液体混合菌液的制备方法，包括以下步骤：
（1）将保藏编号为CGMCC No. 22083的贝莱斯芽孢杆菌BL-14在LB固体培养基上活化；
（2）将保藏编号为GCMCC No. 1.2158的植物乳杆菌和保藏编号为GCMCC No.1.6565的凝结芽孢杆菌在MRS固体培养基上活化；
（3）将步骤（1）和（2）活化后的芽孢菌单菌落和乳酸菌单菌落分别接种到LB或MRS液体培养基中培养。其中，芽孢菌以37℃、180rpm震荡培养12h，乳酸菌以42℃静置培养24h。
（4）将步骤（3）培养的种子液按照比例混合得到液体菌液。
所述的比例指的是芽孢菌和乳酸菌的比例为3:2（v/v），乳酸菌RS-1和乳酸菌RS-10的接种比例为1:1（v/v）。
进一步地，所述的液体混合菌液对饲料原料中呕吐毒素的降解步骤为：将混合菌液按比例加入水中混匀，再按比例倒入预先混合好的饲料原料中搅拌均匀，装入密封容器中压实并密封，放置于室温3-7天，发酵结束后呕吐毒素（DON）降解率可达83.25%，黄曲霉毒素（AFB1）降解率可达90.09%（ZEN）降解率可达80.76%。
所述的饲料原料优选为玉米淀粉加工副产物的玉米胚芽粕、玉米淀粉渣和喷浆玉米皮，其中玉米胚芽粕、玉米淀粉渣和喷浆玉米皮的比例为1:1:1（w/w/w）。所述的水和原料的比例具体为：水和固态原料的比例为5:4（w/w），菌液与混合发酵料的比例为6%（w/w）；
表2发酵饲料应用实验效果检测
本发明公开的一株降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素的应用具有以下优势：
（1）本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌可高效降解呕吐毒素，可在液体培养16h后将1ug/ml呕吐毒素降解90%以上。
（2）本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌可分泌淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，可将饲料原料中的淀粉、蛋白质和纤维素水解成利于动物消化吸收的小分子营养物质。
（3）本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌可与乳酸菌配合进行饲料发酵，将饲料原料中的呕吐毒素去除的同时提高饲料的风味和适口性以及动物对饲料的利用率。
（4）本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌与两株乳酸菌配合进行耗氧发酵时不仅可将饲料原料中的呕吐毒素含量降到国家限量标准以下，还可在一定程度上去除原料中的黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮，对三种毒素的降解率：呕吐毒素（DON）降解率可达83.25%，黄曲霉毒素（AFB1）降解率可达90.09%（ZEN）降解率可达80.76%。
附图说明
图1 FBL-4等离子体诱变致死率；
图2 FBL-4等离子体诱变不同距离的正突变率致死率；
图3 BL-4 菌落形态；
图4 BL-4革兰氏染色后显微镜观察菌体形态；
图5 BL-4菌株 gyrB序列进化树；
图6 BL-4 产水解酶所形成的水解透明圈；
图7 乳酸菌降解DON的筛选；
图8筛选获得高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BL-14菌株的工艺流程。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
植物乳杆菌1.2158（CGMCC），为已知菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间1997年8月14日
凝结芽孢杆菌1.6565（CGMCC）为已知菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2007年1月4日
实施例1
降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌BL-14的诱变筛选与鉴定
1.菌株的筛选
（1）ARTP诱变的步骤
①将菌株FBL-4从斜面接种到LB培养基上活化，挑取单菌落接到5ml LB液体培养基试管中，37℃、180rpm摇床培养12h，再转接到50ml LB液体摇瓶，37℃、180rpm振荡培养6-8h。
②吸取1ml菌液到2ml EP管中，8000rpm离心10min，倒去培养基留下菌体沉淀，加入无菌蒸馏水，振荡EP管使菌体重悬，再次8000rpm离心10min，倒去上清，重复2~3次，往沉淀加入无菌蒸馏水，重悬成菌悬液，用无菌蒸馏水调整菌悬液浓度，使其OD值在0.8左右。
③每一个处理包括空白对照均准备一个金属载片，吸取10ul菌悬，均匀涂在载片上。
④设置ARTP诱变的辐射功率为100W，气体流速为10L/min，将涂有菌液的小载片放置在ARTP诱变仪的托盘上，调整托盘与等离子发射口的距离，分别设置距离为5mm、7mm、9mm、11mm、13mm、15mm，处理20s后立即取出载片放入装有1ml无菌生理盐水的EP管内，EP管提前用锡箔纸包好以避光，其中0s为空白对照，不进行紫外照射处理。
⑤将EP管充分振荡，使菌体全部被洗下，制成菌悬液，此时菌悬液稀释倍数为10-2，再用无菌生理盐水梯度稀释至10-6，每一个处理分别从10-4~10-6稀释倍数菌悬液中吸取100ul涂布到LB培养基和诱变初筛培养基上，37℃培养12h~48h，观察平板上菌落及其直径计数，分别计算不同处理的致死率和正突变率。将初筛平板上菌落直径较大看做正突变菌株，正突变率=初筛平板上正突变菌落数/初筛平板菌落总数，致死率=初筛平板菌落总数/LB平板菌落总数。
初筛培养基（g/L）:(NH4)Cl 1.5g、K2HPO410g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.5g、酵母粉0.04 g、琼脂 20g、pH值6.0~7.0。灭菌后加入过滤除菌的苯基环氧乙烷，使终浓度为20mmol/L。
（2）诱变菌株的复筛
取初筛菌株中生长良好的菌株接种于 LB液体培养基（5mL），37℃、180rpm摇床培养12h。按2%的接种量将菌液接种到添加有3ug/ml呕吐毒素的复筛液体培养基中，37℃、180rpm摇床培养16h。以未接菌的培养基为对照。取培养液1ml，以8000r/min转速离心10分钟，取上清液，通过0.22um微孔滤膜过滤，稀释一定的倍数后使用ELISA酶联免疫试剂盒检测呕吐毒素残余量，计算菌株对呕吐毒素的降解率。
复筛液体培养基(g/L):(NH4)Cl 1.5g、K2HPO410g、MgSO4·7H2O 0.6g、NaCl 0.5g、CuSO4·5H2O 0.04g,蛋白胨 0.2 g，葡萄糖 1.0g pH值7.0 115℃ 15分钟灭菌。培养基降温到30℃后加入呕吐毒素使其终浓度到3ug/mL
最终筛选出一株呕吐毒素降解率最高的菌株BL-14，在含有3ug/ml 呕吐毒素的LB培养基中发酵16h的呕吐毒素降解率可达92.46%（表1）。
2.菌株的鉴定
（1）菌株BL-14在LB培养基平板上生长，呈淡黄色圆形菌落，不透明，表面光滑、有光泽，微微隆起，中心有放射状褶皱，易挑起，与培养基结合不紧密，用接种针挑取菌落有粘稠感且湿润（图2）。在光学显微镜下观察BL-14菌株细胞形态为短杆状革兰氏阳性菌，有部分细胞中心有椭圆形透明未染色部分（图3），判断为芽孢。符合芽孢杆菌属特征。
（2）对菌株BL-14进行PCR扩增其gyrB基因，得到全长约1200的gyrB基因序列，将序列通过NCBI进行比对，并与比对结果中相似度较高的序列构建系统发育树（图4）。基因测序，序列见Seq ID No.1。
实施例2
厌氧发酵降解饲料原料中呕吐毒素、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解
（1）将贝莱斯芽孢杆菌BL-14（CGMCC No. 22083）从斜面保藏试管接到LB培养基平板上，37℃培养12小时；将植物乳杆菌RS-1（GCMCC No.1.2158）和凝结芽孢杆菌RS-10（GCMCC No.1.6565）从斜面保藏试管接到MRS培养基平板上。
（2）挑取BL-14菌株单菌落到LB液体培养基（50mL）中，37℃、180rpm摇床培养12小时；挑取RS-1和RS-10菌株单菌落到MRS液体培养基（50mL）中，42℃、恒温生化培养箱静置培养24小时。
（3）取玉米胚芽粕、玉米淀粉渣、喷浆玉米皮和水预先混匀，比例为：三种固料比例为1:1:1，固料和水的比例为5:4。
（4）将菌株BL-14、RS-1和RS-10的菌液按3:1:1的比例混合，按6%的接种量加入到预先混合好的发酵料中，混匀后装入密封螺口瓶中，压实并密封，室温放置7d,以不接菌的发酵料为对照。
（5）发酵结束后，取10g发酵饲料研磨粉碎后，倒入90ml无菌蒸馏水中，180rpm震荡2小时，取1ml混合液8000r/min离心10min，吸取上清液并稀释一定的倍数，用磷酸氢二钾调节pH到6-8，用ELISA试剂盒检测呕吐毒素含量，计算呕吐毒素脱除率。
（6）取10g发酵饲料与90mL无菌蒸馏水混匀，再用无菌生理盐水梯度稀释菌液到108，取适当稀释倍数的菌液100uL涂布到LB培养基平板或MRS培养基平板上，培养24小时，计平板菌落数，计算芽孢菌和乳酸菌的数目。
（7）取5g发酵饲料均匀平铺在预先烘干的培养皿（无盖）上，放入真空干燥箱中，以80℃、13kPa的条件加热4小时，取出（盖上盖），放入干燥器冷却，称重，再放回真空干燥箱干燥2小时，重复称重，两次称重质量差小于0.1%为止。计算含水量(%)。
（8）取10g发酵饲料倒入90ml无菌蒸馏水中，漩涡混合，以10000转/分钟离心5分钟，取上清液，稀释50~200倍，使用生物传感分析仪（SBA-40E）检测乳酸含量。
结果显示：以筛选出的呕吐毒素降解菌BL-14与乳酸菌RS-1、RS-10协同发酵饲料时，随着芽孢菌的数目增加，三种毒素的降解率较好：呕吐毒素（DON）降解率可达83.25%，黄曲霉毒素（AFB1）降解率可达90.09%（ZEN）降解率可达80.76%。同时，发酵结束后乳酸菌数目可达109，并产生36.5g/L的乳酸，发酵得到的发酵饲料品质高，有明显的酸甜气味，改善了饲料风味，提高了适口性。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tagaggcagc atcgacgagc ggaataagta tccggcggtc ttcacggtgt aggggcgtct 60
gtcgtaaacg ccttgtcgac cactcttgac gttacggttc atcgtgacgg aaaaatccac 120
tatcaggcgt acgagcgcgg tgtacctgtg gccgatcttg aagtgatcgg tgatactgat 180
aagaccggaa cgattacgca cttcgttccg gatccggaaa ttttcaaaga aacaaccgaa 240
tacgactatg acctgctttc aaaccgtgtc cgggaattgg ccttcctgac aaaaggtgta 300
aacatcacga ttgaagacaa acgtgaagga caagaacgga aaaacgagta ccactacgaa 360
ggcggaatca aaagctatgt tgagtactta aaccgttcca aagaagtcgt tcatgaagag 420
ccgatttata tcgaaggcga gaaagacggc ataacggttg aagttgcatt gcaatacaac 480
gacagctata caagcaatat ttattctttc acaaataata tcaacacata cgaaggcggc 540
acgcacgaag ccggatttaa aaccggtctg acccgtgtta taaacgacta tgcaagaaga 600
aaagggattt tcaaagaaaa tgatccgaat ttaagcgggg atgatgtgag ggaagggctg 660
actgccatta tttcaattaa gcaccctgat ccgcaattcg aagggcagac gaaaacgaag 720
ctcggcaact ccgaagcgag aacgatcact gatacgctgt tttcttctgc gctggaaaca 780
ttccttcttg aaaatccgga ctcagcccgc aaaatcgttg aaaaaggttt aatggccgca 840
agagcgcgga tggcagcgaa aaaagcgcgg gaattgaccc gccgcaaaag tgcgcttgag 900
atttccaatc tgccgggcaa actggcggac tgttcttcta aagatccgag catttccgag 960
ctgtatatcg tagagggtga ctctgcgggc ggatcagcga aacagggacg ggaccgtcat 1020
ttccaagcca ttctgccgct gcgcggtaag attctgaacg ttgagaaagc cagacttgat 1080
aagattctct caaacaatga ggtcagatca atgatcacgg ccctcggaac aggaatcgga 1140
gaagatttta atcttgaaaa agcgcgttat cataaagtgt catcagacga tccatacaga 1200
Claims (5)
1.一株高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BL-14菌株，其特征在于，所述BL-14菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No. 22083。
2.采用权利要求1所述高效降解呕吐毒素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BL-14菌株用于发酵降解玉米淀粉加工副产品中呕吐毒素的液体混合菌液，其特征在于它是由权利要求1所述BL-14菌株与RS-1和RS-10组合而成；其中BL-14与RS-1和RS-10的比例为3:1:1（v/v），所述RS-1指的是植物乳杆菌CGMCC 1.2158，RS-10指的是凝结芽孢杆菌CGMCC 1.6565。
3.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌BL-14或权利要求2所述混合菌液在用于降解呕吐毒素或者发酵饲料中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于将混合菌液按6%（w/w）的接种量加入物料中进行发酵，降解其中的呕吐毒素、黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮并制备发酵饲料。
5.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌BL-14或权利要求2所述混合菌液用于发酵饲料同时去除其中毒素物质，所述的毒素物质为呕吐毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210335855.4A CN114703096B (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210335855.4A CN114703096B (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114703096A CN114703096A (zh) | 2022-07-05 |
| CN114703096B true CN114703096B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=82170755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210335855.4A Active CN114703096B (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114703096B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116083296A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-05-09 | 吉林中粮生化有限公司 | 植物乳杆菌、含有该菌的菌剂及降解呕吐毒素的方法 |
| CN115948305B (zh) * | 2023-01-16 | 2023-08-15 | 焦作市佰役安生物工程有限公司 | 一株高效降解多种霉菌毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 |
| CN116676302A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-01 | 康彤(上海)生物研发有限公司 | 一种高产CGTase的毕赤酵母突变株的诱变与筛选方法 |
| CN117106640B (zh) * | 2023-08-08 | 2024-02-02 | 大连三仪动物药品有限公司 | 一种高效降解霉菌毒素的生物制剂及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108813289A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-16 | 湖北华大瑞尔科技有限公司 | 一种高效生物降解霉菌毒素的制剂及其制备方法与应用 |
| CN110804570A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-18 | 中国农业大学 | 一种同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
| CN111394285A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-07-10 | 山东省科学院生态研究所 | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用 |
| CN111534460A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-14 | 湖北大学 | 一株高效拮抗禾谷镰刀菌的贝莱斯芽孢杆菌的制备方法及应用 |
| CN113278550A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-20 | 科润生科技发展有限公司 | 改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌 |
| CN114231432A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-03-25 | 河南工业大学 | 一种同时降解呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的贝莱斯芽孢杆菌及应用 |
-
2022
- 2022-04-01 CN CN202210335855.4A patent/CN114703096B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108813289A (zh) * | 2018-06-01 | 2018-11-16 | 湖北华大瑞尔科技有限公司 | 一种高效生物降解霉菌毒素的制剂及其制备方法与应用 |
| CN110804570A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-18 | 中国农业大学 | 一种同时降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 |
| CN111394285A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-07-10 | 山东省科学院生态研究所 | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用 |
| CN111534460A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-08-14 | 湖北大学 | 一株高效拮抗禾谷镰刀菌的贝莱斯芽孢杆菌的制备方法及应用 |
| CN113278550A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-20 | 科润生科技发展有限公司 | 改善肠道降解黄曲霉毒素玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌 |
| CN114231432A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-03-25 | 河南工业大学 | 一种同时降解呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的贝莱斯芽孢杆菌及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 一株降解DON 芽孢菌的筛选鉴定及其发酵饲料应用;赖根生 等;饲料工业;第42卷(第24期);第22页第2.4、2.6节，第23页右栏第1段，第19页第1.1.3节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114703096A (zh) | 2022-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114703096B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其发酵饲料降解微生物毒素与应用 | |
| CN114921385B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在饲料添加和无抗养殖中的应用 | |
| CN110878265B (zh) | 一株降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112625952B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用 | |
| CN113215018A (zh) | 一株植物乳杆菌植物亚种及其在豆粕和北艾混合发酵中的应用 | |
| CN111808765A (zh) | 一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN112314782A (zh) | 一种用于发酵饲料的复合微生物制剂及发酵膨化颗粒饲料 | |
| CN117070427B (zh) | 一株布氏乳杆菌及其青贮饲料发酵剂 | |
| CN117070428B (zh) | 枯草芽孢杆菌bs-22株在改善养殖环境中的应用 | |
| CN113367232A (zh) | 一株黄曲霉拮抗菌的应用 | |
| CN116064281B (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用 | |
| CN112175871A (zh) | 一种万寿菊鲜花复合发酵剂及其应用 | |
| CN114540232B (zh) | 有水产病原菌拮抗特性的鼠李糖乳杆菌及其制剂的制备及应用 | |
| CN111040969B (zh) | 一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用 | |
| CN111944729B (zh) | 一种耐高温植物乳杆菌菌剂及其制备方法与应用 | |
| CN114456990A (zh) | 一种ddgs的制备方法及其发酵菌种和培养基 | |
| CN113684158A (zh) | 一种暹罗芽孢杆菌jy-1及其制剂和应用 | |
| CN117343883B (zh) | 一株植物乳植杆菌及其应用 | |
| CN117106676B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在饲料生产中的应用 | |
| CN112940998B (zh) | 一种用于预防细菌性疾病的菌株及应用 | |
| CN116064279B (zh) | 一株暹罗芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用 | |
| CN116004424B (zh) | 一株特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用 | |
| CN114107127B (zh) | 一株能降解脂多糖并高产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌d1及其应用 | |
| CN113943667B (zh) | 一株分离自骆驼瘤胃的植物乳杆菌及其在青贮中的应用 | |
| CN116396883B (zh) | 一株耐高温高效降解玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的枯草芽孢杆菌及其菌剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |