CN116004424B - 一株特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用，属于食品生物技术领域。本发明提供一株特基拉芽孢杆菌DL‑GBS01，保藏编号：CGMCC No.23533。所述特基拉芽孢杆菌DL‑GBS01的生长速度快、可抑制病原菌生长，具有优良的发酵性能，同时耐受胃肠道环境，具有良好的益生性能。该菌株作为发酵剂可保证低盐发酵豆瓣酱、豆酱等食品的食用安全性和风味品质，并显著提高发酵食品的营养价值，也可以用于制备饲料以提高营养物质。本申请提供的特基拉芽孢杆菌DL‑GBS01具有广泛的应用场景，且是具有巨大潜力的未来益生菌之一。
Description
技术领域
本发明涉及一株特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用，属于食品生物技术领域。
背景技术
豆瓣酱、大酱等发酵食品具有独特的“色、香、味、形”，深受消费者喜爱。豆瓣酱、大酱等发酵食品多为自然发酵，日晒夜露，为了保证食用安全性，这些发酵食品生产中的氯化钠添加量通常高达18-20%。较高的氯化钠含量容易引发消费者高血压和心血管病等，不利于健康。随着减糖减盐和食品安全的宣传，人们对健康的日益关注，低盐发酵食品受到越来越多消费者的青睐。
芽孢菌对低盐发酵豆制品的安全、风味和营养品质具有重要影响。研究表明，芽孢菌能通过产脂肽、抗菌肽和细菌素来抑制低盐发酵豆制品中有害菌生长，保证低盐发酵豆制品的微生物安全性；芽孢菌可以代谢碳水化合物、蛋白质和脂肪，产生酸类、酯类、肽等风味物质，从而提高低盐发酵豆制品的感官和风味品质。近年来，可用于低盐发酵豆制品的芽孢菌的研究与应用逐渐受到关注。
中国专利CN111248409A公开了一种一种低盐豆瓣酱及其制作方法，其在豆瓣酱醅发酵阶段添加肉葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、融合魏斯氏乳杆菌和鲁氏结合酵母作为核心菌混合发酵剂，进行低盐豆瓣酱的制作；中国专利CN108967904A则使用米曲霉、嗜盐片球菌、雅致放射毛霉、欧芹、莳萝、牛至的豆瓣进行发酵；利用嗜盐片球菌、嗜盐四联球菌对辣椒进行发酵郁；将发酵好的豆瓣及酱醅与发酵好的辣椒酱混合后，巴斯德毕赤酵母菌、肠膜明串珠菌进行后发酵，从而进行低盐豆瓣酱的制作。目前的低盐发酵是一种多菌种协同、功能性物质混合发酵制备低盐豆瓣酱的复配菌剂的发酵策略，是通过多菌种大剂量接种优先达到种群优势，从而防止有害菌的过度繁殖。但并未完全消除有害菌污染威胁。
在多篇文献和专利中利用特基拉芽孢杆菌制备发酵食品，是具有发展潜力的未来益生菌之一，在专利CN107751800A中利用特基拉芽孢杆菌和融合乳杆菌、鲁氏酵、戊糖片球菌用于制备菊花蚕豆酱，缩短发酵周期，增加有益活性成分；在专利CN112195125A中，利用特基拉芽孢杆菌制备酱油，以提高酿造酱油的氨基酸态氮和还原糖含量；在专利CN107734972A中，利用特基拉芽孢杆菌和乳酸菌共同发酵制备发酵奶制品；利用特基拉芽孢杆菌制备印度南部的日常食物Adhirasam（Noorul A ,Rangasamy A ,Woo K S , et al.Evaluation of Bacillus spp. as dough starters for Adhirasam - A traditionalrice based fermented food of Southern India[J]. Brazilian Journal ofMicrobiology, 2015.）；利用特基拉芽孢杆菌制备泰国传统发酵茶Miang（Unban K ,Kodchasee P ,Shetty K , et al. Tannin-tolerant and Extracellular TannaseProducing Bacillus Isolated from Traditional Fermented Tea Leaves and TheirProbiotic Functional Properties[J]. Foods, 2020, 9(4).）
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种可产抗菌物质的益生特基拉芽孢杆菌及其在食品低盐发酵中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明提供一株分离自发酵食品的特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01，保藏编号CGMCC No. 23533。本发明涉及的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01采集自辽宁省农家大酱中，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明提供一种组合物，所述组合物包含特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01、发酵液和/或发酵上清液。
在一种实施方式中，所述发酵液的将特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01接种于培养基中发酵培养得到的菌液。
在一种实施方式中，所述发酵上清液是指将发酵液离心收集得到的上清液。
本发明提供一种菌剂，其含有特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01。
本发明还提供一种发酵剂，其含有特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01。
在一种实施方式中，上述菌剂、发酵剂中特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01以活菌形式存在。
在一种实施方式中，上述菌剂、发酵剂还可含有冻干保护剂。
上述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01菌剂或发酵剂可以为液体菌剂、发酵剂或固体菌剂、发酵剂。
本发明提供所述菌剂或所述发酵剂的制备方法，所述方法包括将特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01经培养获得菌液的步骤：挑取特基拉芽孢杆菌DL-GBS01单菌落接种至10 mLLB培养基，并于30-37℃、200-250 rpm条件下好氧培养24 h，得菌液A；随后取500 μL所述菌液A接种至50 mL LB培养基中，30-37℃、200-250 rpm条件下好氧培养24 h，得菌液B；随后取10 mL所述菌液B接种至1000 mL LB培养基中，30-37℃、200-250 rpm条件下好氧培养24h，得菌液C；将所述菌液C置于8000 rpm离心10min后收集菌体，将特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌体用质量分数为0.9%氯化钠水溶液稀释，制备成1010-1012CFU/mL的菌悬液。
优选地，所述培养为在37℃条件下进行。培养使用的培养基包括但不限于LB培养和营养肉汤培养基等芽孢菌常用的培养基。
上述获得的菌液可直接或加入微生物制剂领域允许的辅料制备为液体菌剂或发酵剂，也可收集菌液中的菌体与冻干保护剂等微生物制剂领域允许的辅料混合后经真空冷冻干燥制备为干粉菌剂或发酵剂。
在一种实施方式中，所述菌剂或发酵剂中，特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01的活菌含量为1012CFU/g。
本发明还提供了一种发酵食品，所述发酵食品为利用所述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或所述菌剂或发酵剂发酵制备得到的发酵食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括固态发酵食品、液态发酵食品或半固态发酵食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品或果蔬制品。
在一种实施方式中，所述豆制品包括低盐发酵豆制品。
在一种实施方式中，所述豆制品包括大酱、豆瓣酱、酱油。
本发明提供特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或所述菌剂或所述发酵剂在提高产品中的氨基酸态氮含量的应用。
在一种实施方式中，所述产品包括食品和饲料。
在一种实施方式中，所述食品包括发酵食品。
在一种实施方式中，所述发酵食品优选为发酵豆制品；更优选为低盐发酵豆制品；最优选为低盐发酵豆瓣酱、大酱和酱油。
基于特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01的功能和特性，本发明提供特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或所述菌剂或所述发酵剂在制备抑制病原微生物的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述病原微生物包括金黄色葡萄球菌、致病大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、粪肠球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌。
在一种实施方式中，所述产品包括但不限于饲料、饲料添加剂、生物抑菌剂、益生菌制剂或药物。
在一种实施方式中，所述药物含有上述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01、药物载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述药物载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述药品的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在一种实施方式中，所述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01的添加量为107-1010CFU/kg。
在一种实施方式中，所述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01的添加量为1010CFU/kg。
本发明还提供了一种饲料，含有所述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或所述菌剂或所述发酵剂或所述组合物，或利用所述特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或所述菌剂或所述发酵剂发酵制备得到的饲料。
有益效果：
本发明提供一株特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01，该菌株从传统自然发酵东北大酱中分离获得，生长速度快，对于致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌具有明显的抑制作用，同时还具有优良的淀粉酶、蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性，能够较好地保证发酵产品的风味品质。而且，特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01能够耐受胃肠道环境，具有优异的益生性能。该菌株作为发酵剂可保证低盐发酵食品的食用安全性和风味品质，缩短发酵周期，并显著提高低盐发酵豆制品的营养价值。
生物材料保藏
本发明所提供的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）DL-GBS01，分类学命名为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23533，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的LB培养物照片；
图2为特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对抑菌效果检测；（A）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对金黄色葡萄球菌的抑制效果，（B）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对7种病原微生物的抑制效果。
图3为特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的蛋白酶活性筛选照片。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；或参照产品说明书。
本发明使用的培养基的配制如下：
（1）普通营养肉汤固体培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水补至1000mL，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。
（2）LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min。
（3）LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，15g琼脂，蒸馏水补至1L，调pH至7 .0，高压灭菌20min，然后倒平板。
（4）蛋白酶活性筛选培养基：酪素培养基，分别配制A液和B液。
A液：称取Na2HPO4•7 H2O 1.07g、干酪素5 g，加适量蒸馏水，并加热溶解。B液：称取KH2PO40.36 g，加水溶解。A、B液混合后，加琼脂20 g，最后用蒸馏水定容至1 L。121℃灭菌15min，然后倒平板或制作牛津杯平板。
（5）淀粉酶活性筛选培养基：可溶性淀粉2.5g，蛋白胨5g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾3g，六水氯化钙0.25g，琼脂20g，水1000ml。121℃灭菌15 min，然后倒平板或制作牛津杯平板。
实施例1 菌株DL-GBS01的分离和鉴定
1、菌株DL-GBS01的分离和纯化：
（1）样品：采集自辽宁省农家大酱。
（2）分离筛选方法采用富集-筛选培养法，具体如下：
取成品生大酱1 g，加入到10 mL LB液体培养基，移入均质袋，拍打30 min，500 g离心5 min去除酱渣，无菌条件下移取含菌的浑浊液体部分至50 mL离心管中，补充LB培养基至10 mL，在37℃，200 rpm条件下培养3 h。将培养液适当稀释后涂布在蛋白酶活性筛选培养基上，待液体吸收干净后，37℃倒置培养24-48 h。选择透明圈比较明显的菌株，划线到LB固体培养基，分离单菌落（图3）。连续纯化三代，挑取单菌落进行镜检，确定未污染后，进行牛津杯法蛋白酶活性分析，发现具有较好的蛋白酶活性，将菌株冻存保藏，命名为DL-GBS01。DL-GBS01菌株先用10 mL LB液体培养24 h，然后以1％（v/v）接种量转接至含50 mLLB培养基的250 mL三角瓶中，继续以200-250 rpm、37℃振荡培养48 h。然后8000 rpm离心10 min后收集培养上清，进行以下分析。
（3）淀粉酶活性分析。利用淀粉牛津杯平板进行菌株DL-GBS01的淀粉酶活性分析。将牛津杯置于含有淀粉酶活性筛选培养基的平板上，将菌株DL-GBS01的培养上清加入牛津杯中，37℃温育24 h，发现在DL-GBS01上清液牛津杯周围出现透明圈，则明DL-GBS01菌株具有淀粉酶活性。
（4）抑菌活性分析。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923）、致病大肠杆菌（Escherichia coliATCC 25922）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC 19115）、粪肠球菌（Enterococcus faecalisATCC 29212）、沙门氏菌（Salmonella entericasubsp. enterica serovar Typhi CMCC(B) 50071）、志贺氏菌（Shigella flexneriCMCC(B) 51572）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC27853）等7种有害菌为指示菌，通过牛津杯法分析DL-GBS01菌株培养上清的抑菌活性（牛津杯法参考文献：Khan M N, Lin H, Li M, et al. Identification and growthoptimization of a Marine Bacillus DK1-SA11 having potential of producingbroad spectrum antimicrobial compounds. Pakistan Journal of PharmaceuticalSciences, 2017, 30(3):839-853.）。37℃温育24 h，牛津杯周围出现透明圈，分别测定抑制菌圈直径，汇总分析。发现，DL-GBS01菌株所产的抗菌物质这7株指标菌都具有很好的抑菌活性，尤其是金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，抑菌圈直径可达25.2 mm和23.1 mm（图2）。
2、菌株DL-GBS01的鉴定：
（1）菌株DL-GBS01在LB固体平板上生长良好，37℃培养24-48 h，如图1所示，形成圆形、稍扁平、边缘齐整、乳白色菌落；镜检发现菌体呈杆状，长大于宽，大小为 0.5~1×1.5~4 μm。
（2）菌体样品直接用煮沸法处理获得PCR模板，具体如下：将纯化后的菌种接种于LB固体培养基上，28℃培养24 h，然后使用灭菌牙签挑取单菌落，然后置于装有10 μL的16S-free H2O 的Microtube中，99℃热变性 10 分钟后进行离心分离，取5 μL上清液作模板进行PCR反应。
PCR反应体系50 μL：2×PCR Mix 25 μL，引物Forward Primer 1 μL，引物ReversePrimer 1 μL，上述模板上清液5 μL，ddH2O补齐到50 μL。引物序列Forward Primer：GGTTACCTTGTTACGACTT；Reverse Primer： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR结束后，PCR产物直接送上海生工测序，测序结果显示具有序列表中SEQ ID No .1的核苷酸序列。
菌株DL-GBS01 16s rRNA序列如下：
ACCCGGTTCCAATCGGCGGCTGGCTCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTTGAAACGGCACTTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCGAAAACCTTTCATCACTCACGCGACGGTTGGCTCGTCAGACTTTCGTCCATGCCGAGGATTTCCCTACCTGCTGTCTCCGTAGAAGTCTGGATGTGATCTCAGTCCCCAGGTTGGTGTGGACCGA
测序结果显示具有序列表中SEQ ID No .1的核苷酸序列，将其进行Blastn分析，发现该菌与特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）的同源性最高，达到99.6％。
经形态学和16s rRNA鉴定，该菌株DL-GBS01为Bacillus tequilensis，并于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.23533。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例2 特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的生物活性测定和益生性评价
（1）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的氨肽酶、羧肽酶活性测定：
从-80℃冰箱取出特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株的保藏甘油管，接取含菌冰渣一环至含10 mL LB培养基中，于200-250 rpm、37℃振荡培养24 h；然后以1％（v/v）接种量转接至含50 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，继续以200-250 rpm、37℃振荡培养48 h。然后8000 rpm离心10min后收集培养基上清，进行氨肽酶、羧肽酶活性分析。
参考文献（中国酿造, 2017,36(2):99-101; 中国酿造, 2010, 216(3): 30-33）所述方法，进行特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的氨肽酶、羧肽酶活性测定，结果显示，摇瓶水平下，37℃，200 rpm条件下培养48 h的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01培养液上清，以Leu-pNA (L-亮氨酸-4-硝基苯胺)为底物时酶活为870 U/mL；以Cbz-Glu-Tyr（N-苄氧羰酰基-L-谷氨酰-L酪氨酸）为底物时酶活为280 U/mL。说明特基拉芽孢杆菌DL-GBS01同时具有氨肽酶和羧肽酶活性。
（2）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的菌株耐酸性检测：
将活菌数量为3×108CFU/mL的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌悬液，按5%（V/V）的比例接种于pH 3.0的LB培养基中，37℃孵育，取0 h、2 h样品进行平板计数计算菌株存活率。结果显示，pH为3.0的LB培养基中培养2 h后，特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01活菌数由108CFU/mL降至107CFU/mL。说明特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对酸性环境的耐受性良好。
（3）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的胆盐耐受性试验：
耐酸试验（pH3.0）中，特基拉芽孢杆菌DL-GBS01在2 h后通过胃到达肠道，活菌数降至3×107CFU/mL。所以，胆盐耐受试验的起始活菌数调整为3×107CFU/mL。将活化好的特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01离心收集菌体，LB培养基洗涤2次，重悬于含有0.3%（W/V）牛胆酸钠的LB培养基中，调整活菌浓度至3×107CFU/mL，37℃孵育，取0 h，3 h样品进行菌落计数计算菌株存活率。结果显示，特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01在0.3%（W/V）胆盐环境下活菌数有所下降，但3 h后活菌数仍在106CFU/mL以上，高于活菌发挥功能特性的菌数临界值。说明特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对小肠环境的耐受性良好。
（4）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的抗氧化实验
（1）DPPH自由基清除率试验：0.2 mmol/L DPPH：0.0078 g DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，避光放置，现配现用。将108CFU/mL的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌液与0.2mM DPPH溶液按体积比1:1混合，在25℃的黑暗中培养30 min。单独使用108CFU/mL的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌液和无水乙醇作为空白，而PBS和0.2 mmol/L DPPH作为对照。在2330×g（4120 rpm）下离心10分钟后收集上清液。在517 nm处测量吸光度一式三份。
DPPH自由基清除率的计算：
Ai为 1 mL 待测菌液加 1 mL DPPH乙醇溶液的吸光值；
Aj为 1 mL 待测菌液加 1 mL 无水乙醇的吸光值；
Ac为 1 mL PBS 加 1 mL DPPH 乙醇溶液的吸光值。
ABTS自由基清除率试验：将ABTS（14 mM）和过硫酸钾（5 mM）溶解在0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中，以1:1的比例混合，并在25°C下反应12–16 h，获得ABTS工作液。将100 μL菌株DL-GBS01（108CFU/mL）添加到900 μL ABTS工作液中，并在25°C下黑暗中培养15 min。离心（14000 g，1分钟）后，在734 nm处测量上清液的吸光度。
ABTS自由基清除率的计算：
As为100 μL待测菌液加 900 μL ABTS工作液的吸光值；
Ac为 1 mL ABTS工作液；
结果显示，特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的DPPH清除活性为89.73%，ABTS清除活性为92.77%，说明菌株DL-GBS01具有很好的抗氧化活性。
实施例3 特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的安全性测定
（1）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的抗生素敏感性实验：
使用纸片扩散法对特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的抗生素敏感性谱进行了表征。将活化好的菌制成1×108CFU/mL的菌悬液，取200 μL菌液涂布于LB平板上，小心放置庆大霉素（10μg）、链霉素（10μg）、红霉素（15μg）、四环素（30μg）、头孢氨苄（30μg）、万古霉素（30μg）、头孢唑林（30μg）、氨苄西林（10μg）、青霉素（10μg）、米诺环素（30μg）、阿米卡星（30μg）11种抗生素药敏纸片，每个纸片的间距不小于24 mm。37℃培养24 h后以测量并统计抑菌圈直径， 分析其耐药性抗性R（≤14毫米），中期I（14-20毫米）或敏感S（≥20毫米），做三个平行。结果显示，特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对11种抗生素均敏感，不存在这些抗生素抗性，菌株安全性较好。
（2）特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的溶血实验
培养基配置：哥伦比亚琼脂，5%脱纤维羊血。
取特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌（约1× 08cfu /mL）划线于含有5%脱纤维羊血的哥伦比亚平板中，在37℃培养24 h，之后观察是否有透明圈。以金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为阳性对照。
结果发现，金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性对照组菌株周围出现宽大（6-8 mm）、界限分明、完全透明的溶血环，为典型的β溶血。而本发明提供的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌落周围无溶血，菌株安全性好。
实施例4 特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌液的制备：
1) LB培养基的分装：灭菌的LB培养基无菌分装至50 mL离心管(装液量10 mL)、250mL三角瓶(装液量50 mL)和5L三角瓶(装液量1000 mL)。
2) 从-80℃冰箱取出特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株的保藏甘油管，接取含菌冰渣一环至含10 mL LB培养基中，于200-250 rpm、37℃振荡培养24 h；然后以1％（v/v）接种量转接至含50 mL LB培养基的250mL三角瓶中，继续以200-250 rpm、37℃振荡培养24 h；最后以1％（v/v）接种量转接至含750mL LB培养基的3 L三角瓶中，于200-250 rpm、37℃振荡培养24 h。将所述菌液C置于8000 rpm离心10 min后收集菌体，将特基拉芽孢杆菌菌体用质量分数为0.9%氯化钠水溶液稀释，制备成109CFU/mL的菌悬液。备用。
实施例5 特基拉芽孢杆菌DL-GBS01发酵剂菌粉的制备：
将特基拉芽孢杆菌DL-GBS01接种于LB培养基中，37℃培养16 h后离心，将菌体与等质量的冻干保护剂（每100 mL质量浓度为10%的脱脂乳中添加有2g甘油和3g蔗糖）混合，-20℃预冻2 h后，置于真空冷冻干燥机中真空干燥（冷阱温度-45℃，真空度10-20Pa）22 h-24 h，菌粉含水量降至2.5%-3%时停止干燥，即得到干粉形式的菌剂，菌剂中特基拉芽孢杆菌DL-GBS01活菌含量为1012CFU/g。
实施例6 特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的应用：
（1）DL-GBS01菌株在酱油发酵中的应用
按照SB/T 10312-1999 高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程，进行酱油发酵，原料豆粕∶麸皮=7∶3进行混合，经润水处理、蒸煮处理、冷却处理和接种处理，接种沪酿3.042米曲霉，然后在制曲24 h按109CFU/mL（g）的比例接种入特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株，30℃恒温制曲42 h，松散、秤重，加入盐和水（最终14%盐度），30℃恒温进行发酵6个月，压榨、灭菌、过滤、分装等工序获得成品酱油，对照组和实验组分别进行氨基酸态氮含量测定和大肠杆菌检测。
氨氮含量测试方法参照GB 18186-2000，大肠杆菌检测通过Real-time PCR方法。
（2）DL-GBS01菌株在郫县豆瓣酱发酵中的应用
按照GB/T 20560-2006 地理标志产品 郫县豆瓣 标准，进行郫县豆瓣酱发酵，在甜瓣子阶段，豆瓣曲装入发酵容器中时，控制3-5％的食盐和15-25％的水，按108CFU/mL比例接种特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株，发酵30天；并在辣椒胚和甜瓣子混合后，盐度控制在12%，按108CFU/mL的比例再次接种入特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株，继续进行后续发酵。实验组和对照组的氨基酸态氮(以氮计)/(g/100 g) 都大于0.18后结束发酵。成品进行氨基酸态氮含量测定和大肠杆菌检测。
氨氮含量测试方法参照GB/T 20560-2006，大肠杆菌检测通过Real-time PCR方法。
（3）DL-GBS01菌株在黄豆酱发酵中的应用
按照GB/T 24399-2009 黄豆酱，进行黄豆酱发酵。工艺流程：黄豆泡发→蒸煮→冷却→沥水→捣碎→接种米曲霉沪酿3.042→制酱块→制曲→成曲→清洗酱块→切小块→加入终浓度10%的食盐→搅打、撇浮沫→按1010CFU/mL的比例接种入特基拉芽孢杆菌DL-GBS01菌株，发酵→包装→杀菌→成品。发酵结束后，成品进行氨基酸态氮含量测定和大肠杆菌检测。
氨氮含量测试方法参照GB/T 24399-2009，大肠杆菌检测通过Real-time PCR方法。
结果显示，发酵过程接种了特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的低盐发酵样品，和不添加特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的对照样品，均没有大肠杆菌污染。同时，发酵过程接种了特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的低盐发酵样品的氨基酸态氮含量，远高于发酵过程中未接种特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的发酵样品(对照组)的氨基酸态氮含量。说明特基拉芽孢杆菌DL-GBS01作为发酵剂时的低盐发酵条件下更有利于发酵体系中酶活的发挥，发酵更彻底（表1）。但，低盐发酵中，不添加特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的对照样品的气味、色泽均低于接种了特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的实验组。
表1 各发酵食品中氨基酸态氮含量分析
注：每个发酵食品组1为加入特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的实验组，组2为对照组。
综上所述，特基拉芽孢杆菌DL-GBS01对于致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌具有明显的抑制作用，同时还具有优良的淀粉酶、蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性，能够较好地保证低盐发酵产品的风味品质。而且，特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01能够耐受胃肠道环境，具有优异的益生性能。该菌株作为发酵剂可保证低盐发酵食品的食用安全性和风味品质，缩短发酵周期，并显著提高低盐发酵豆制品的营养价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (7)
1.一株特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）DL-GBS01，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 23533，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01、权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01的发酵液和/或其发酵上清液。
3.一种发酵剂，其特征在于，含有权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01。
4.一种发酵食品，其特征在于，所述发酵食品为利用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌菌株DL-GBS01或权利要求3所述的发酵剂发酵制备得到的发酵食品；所述发酵食品为发酵豆制品。
5.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01或权利要求3所述的发酵剂在提高低盐发酵豆制品中氨基酸态氮含量的应用。
6.权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01或权利要求3所述的发酵剂在制备抑制病原微生物的产品中的应用；所述病原微生物为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、肠沙门氏菌肠亚种伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）、福氏志贺菌（Shigella flexneri）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；所述产品为饲料、饲料添加剂、生物抑菌剂、益生菌制剂或药物。
7.一种饲料，其特征在于，所述饲料含有权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01或权利要求2所述组合物或权利要求3所述的发酵剂；或所述饲料为利用权利要求1所述的特基拉芽孢杆菌DL-GBS01或权利要求3所述的发酵剂发酵制备得到的。
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