CN116004423B

CN116004423B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN116004423B
Application number: CN202210971615.3A
Authority: CN
Inventors: 张素芳; 鲍捷; 卫晓涵; 董亮; 陈映羲; 梁会朋; 林心萍; 纪超凡; 李冬梅; 代艺伟
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2042-08-12
Also published as: CN116004423A

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，属于食品生物技术领域。本发明从农家大酱中筛选到一株可同时生产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的贝莱斯芽孢杆菌DL‑BJ01。经过试验验证并结合现有技术，认定贝莱斯芽孢杆菌DL‑BJ01是一株食品级的安全菌株。将贝莱斯芽孢杆菌DL‑BJ01添加至发酵食品的发酵过程中，可提高大分子蛋白质的降解程度，通过发酵增加传统发酵食品中氨基酸(态氮)的含量，满足消费者的风味需求，具有重要的工业应用价值。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，具体涉及一种兼具蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

在发酵食品行业，氨基酸作为微生物和酶的代谢产物，不仅能赋予最终的发酵食品以鲜、甜、苦、涩、咸等多种味觉特征，同时，还作为含氮物质，可以为发酵过程中的功能微生物生长代谢提供优质氮源，维持微生物的生长和生理生化活动同，促进发酵，因此，产品中最终的氨基酸含量水平，是发酵食品生产中的一个重要评价指标(化学通报,1998,8:1-9)。

实际应用中，氨基酸水平的分析通常以氨基酸态氮进行测量。氨基酸态氮，也称为氨基氮或氨态氮，是指由发酵食品中的蛋白质基质经蛋白酶、内肽酶和外肽酶等逐步分解而成的氨基酸或小肽的含量，不仅能大致上反映氨基酸总量的水平，而且也可以衡量食品原料的发酵程度，同时，氨基酸态氮含量的高低还直接决定了发酵食品的质量等级和整体风味。比如，GB/T 20560-2006地理标志产品郫县豆瓣中，规定氨基酸氮态≥0.25g/100g的产品为特级品，氨基酸氮态≥0.20g/100g的产品为一级品。基于产品要求，部分不良厂商为缩短发酵周期铤而走险，通过外加味精(谷氨酸钠)而提高发酵食品的氨基酸态氮含量。但这将可能会影响消费者健康，并且，外加的谷氨酸钠可以通过氨基酸谱的测定而检控到(食品与发酵工业,2018,44(4):198-203)。

在目前发酵食品生产过程中，在发酵周期缩短的情况下，氨基酸态氮含量以及风味物质仍然有较大的改良空间，在国家和行业提质减害、零添加等消费要求下，如何在不外加氨基酸或味精的前提下提高酱油、豆瓣、大酱等发酵食品中的氨基酸含量，是目前亟需解决的问题。

因此，本发明对发酵食品中可天然具有外肽酶活性(外肽酶包括氨肽酶和羧肽酶)的微生物进行筛选、分离、鉴定和应用表征，可以构建发酵食品来源的外肽酶活性菌株资源库，为提高发酵食品中氨基酸含量提供有效手段，为发酵食品提质减害提供技术支持。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种提高发酵食品氨基酸含量的发酵方法，采用食品生物技术将贝莱斯芽孢杆菌菌株DL-BJ01应用于发酵食品的发酵过程中，可以进一步提高发酵食品发酵过程中大分子质的降解程度，在不添加味精的前提下提高游离氨基酸的含量，有助于丰富发酵食品的风味，并提高其品质。

本申请中所使用的贝莱斯芽孢杆菌已在国际上被广泛应用于食品、药品的制备中；例如，在日本、韩国的一种用于辅助治疗胃肠道疾病和提高免疫力的商用益生菌，近期经过全基因组测序和比较基因组分析，认定为是一种贝莱斯芽孢杆菌(Jeong H,Kim J,Choi SK,Pan JG.Genome Sequence of the Probiotic Strain Bacillus velezensisVariant polyfermenticus GF423.Microbiol Resour Announc.2018,7(10):e01000-18.)。韩国分离自泡菜的一株贝莱斯芽孢杆菌也具有很好益生功能，并因显著的益生功能进行了全基因组测序(Heo,S.；Kim,J.-H.；Kwak,M.-S.；Sung,M.-H.；Jeong,D.-W.Functional Annotation Genome Unravels Potential ProbioticBacillusvelezensis Strain KMU01 from Traditional Korean Fermented Kimchi.Foods 2021,10,563)。同时，也有研究也证明，添加了贝莱斯芽孢杆菌的发酵豆制品具有较强的抗氧化和抗疲劳活性(Cui J,Xia P,Zhang L,Hu Yu,Xie Q,Xiang H.A novel fermentedsoybean,inoculated with selected Bacillus,Lactobacillus and Hansenulastrains,showed strong antioxidant and anti-fatigue potential activity.FoodChem.2020,333:127527.)。在上述基础上，发明人对本申请中的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01也做了安全性检测。综合结果表明，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01是一株可用于食品、药品的安全菌株。

本发明通过下述技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一株分离自发酵食品的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01，分类学命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23531，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

在一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01具有如下性质：

(1)采集自辽宁省农家大酱中；

(2)可同时产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶；

(3)抗生素敏感型；

(4)无溶血作用；

(5)对胃肠道具有良好耐受性；

(6)具备良好的抗氧化性能。

本发明的第二个目的是提供含有所述贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法为：

将贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01接种至含10mL LB培养基中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；然后以1％接种量转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，继续以200-250rpm、37℃振荡培养24h；最后以1％接种量转接至含750mL LB培养基的3L三角瓶中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；将所述菌液置于8000rpm离心10min后收集菌体，将贝莱斯芽孢杆菌菌体用质量分数为0.9％氯化钠水溶液稀释，制备成10⁹CFU/mL的菌悬液，即为液体微生物制剂；将菌悬液离心、取沉淀，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15～20g/100mL的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于10⁷cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体微生物菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种同时生产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的方法，所述方法是利用所述贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01、液体微生物制剂或固体微生物制剂发酵生产。

在一种实施方式中，将所述贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01活化后添加至LB培养基，在200-250rpm、35～40℃振荡培养。

本发明的第四个目的是提供所述贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01在制备发酵食品中的应用。

在一种实施方式中，所述食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。

在一种实施方式中，在小米醋制备过程中，在糖化和酒精发酵结束后，按不少于10⁵CFU/mL的比例接种入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01进行发酵，至总酸≥3.5。

在一种实施方式中，在黄酒制备过程中，在“添加酒曲糖化、酵母发酵”的步骤中按不少于10²CFU/mL的比例接种入发酵体系中。

在一种实施方式中，酱油制备的过程中，在发酵前添加至发酵原料中10⁵CFU/mL或10⁵CFU/g的比例接种，进行发酵。

在一种实施方式中，在豆瓣酱的制备过程中，在辣椒胚和甜瓣子混合后，按10⁶CFU/mL的比例接种入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01，进行发酵。

在一种实施方式中，在豆乳发酵前向原料中添加糖和植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌等发酵菌株，并按10²CFU/mL比例加入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01进行发酵。

在一种实施方式中，在腐乳制备过程中，向毛坯中添加按10⁴CFU/mL(g)的比例接种入DL-BJ01菌株。

在一种实施方式中，在黄豆酱制备过程中的发酵步骤中按10⁶CFU/mL的比例加入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01。

本发明的第五个目的是提供一种提高发酵食品中游离氨基酸含量的方法，所述方法是将贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01或所述微生物制剂添加至发酵食品的制备中。

在一种实施方式中，所述发酵食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。

本发明具有以下的优点和有益效果：

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01具有良好的分泌蛋白酶和外肽酶能力，经过验证并结合现有技术，其是一株食品级的安全菌株。将贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01添加至发酵食品的发酵过程中，可提高大分子蛋白质的降解程度，通过发酵增加传统发酵食品中氨基酸(态氮)的含量，满足消费者的风味需求，具有重要的工业应用价值。

生物材料保藏

本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01，分类学命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23531，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的LB平板培养菌落图片；

图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的蛋白酶活性筛选照片；两个平行孔。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；或参照产品说明书。

本发明使用的培养基的配制如下：

(1)普通固体培养基(1L)：蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水补至1000mL，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。

(2)LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min。

(3)LB固体培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，15g琼脂，蒸馏水补至1L，调pH至7.0，高压灭菌20min，然后倒平板。

(4)蛋白酶菌株筛选培养基(1L)：酪素培养基，分别配制A液和B液。

A液：称取Na₂HPO₄·7H₂O 1.07g、干酪素5g，加适量蒸馏水，并加热溶解。B液：称取KH₂PO₄ 0.36g，加水溶解。A、B液混合后，加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1L。121℃灭菌15min，然后倒平板。

(5)氨肽酶菌株筛选培养基：葡萄糖30g/L，牛肉膏5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0。121℃灭菌15min，加入过滤除菌的L-亮氨酸-4-硝基苯胺(Leu-pNA)至终浓度0.5g/L。然后倒平板。

(6)羧肽酶菌株筛选培养基：葡萄糖30g/L，牛肉膏5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 1.0g/L，琼脂粉20g/L，pH 7.0。121℃灭菌15min，加入过滤除菌的苯甲酰-L-酪氨酸-对硝基苯胺(Bz-Tyr-pNA)至终浓度0.5g/L。然后倒平板。

实施例1：菌株DL-BJ01的筛选

1、菌株DL-BJ01的分离和纯化

(1)样品：采集自辽宁省农家大酱。

(2)蛋白酶活性菌株筛选。分离筛选方法采用富集-筛选培养法，具体如下：

取成品生大酱1g，加入到10mL LB液体培养基，移入均质袋，拍打30min，500g离心5min去除酱渣，无菌条件下移取含菌的浑浊液体部分至50mL离心管中，补充LB培养基至10mL，在37℃，200rpm条件下培养3h。将培养液适当稀释后涂布在筛选培养基上，待液体吸收干净后，37℃倒置培养24-48h。选择透明圈比较明显的菌株，划线到LB固体培养基，分离单菌落。连续纯化三代，挑取单菌落进行镜检，确定未污染后，进行牛津杯法蛋白酶活性分析，根据生成的水解圈直径大小筛选出蛋白酶活性菌株72株。

(3)淀粉酶活性验证。上述步骤(3)所初筛出的具有蛋白酶活性的72株菌株，分别进行10mL LB液体培养48h，离心分离培养上清，利用淀粉牛津杯平板进行淀粉酶活性分析。37℃温育24h，分别观察不同样品牛津杯周围是否出现透明圈，并记录透明圈直径大小。通过这一步筛选，获得同时具有较好蛋白酶活性和淀粉酶活性的菌株27株。其中1株具有最好蛋白酶活性和淀粉酶活性的菌株，命名为DL-BJ01。

(4)氨肽酶活性菌株筛选。将上述筛选出的DL-BJ01在内的27株兼具有蛋白酶活性和淀粉酶活性菌株分别点样在以Leu-pNA为底物的氨肽酶筛选平板表面。在氨肽酶降解作用下，无色的Leu-pNA底物分解生成黄色产物对硝基苯胺(pNA)，根据生成的黄色水解圈和菌落直径比值的大小筛选出高活力的目的菌株。结果表明，27株蛋白酶活性菌株中，有DL-BJ01在内的11株黄色水解圈直径和菌落直径比值在2.5-3之间，具有良好氨肽酶活性的菌株。

(5)羧肽酶活性菌株筛选。将上述筛选出的11株同时具有蛋白酶活性和氨肽酶活性的菌株分别点样在以Leu-pNA为底物的羧肽酶筛选平板表面。在羧肽酶降解作用下，无色的Bz-Tyr-pNA底物分解出黄色产物对硝基苯胺(pNA)，根据生成的黄色水解圈和菌落直径比值的大小筛选出高活力的目的菌株。结果，从11株同时具有蛋白酶活性和氨肽酶活性的菌株中筛选出DL-BJ01在内的3株具有良好羧肽酶活性的菌株，Bz-Tyr-pNA底物平板上的黄色水解圈和菌落直径比值在2-3之间。将这3株同时具有蛋白酶活性、氨肽酶和羧肽酶活性的菌株冻存保藏。

2、菌株DL-BJ01的鉴定

(1)菌株DL-BJ01在LB固体平板上生长良好，37℃培养24-48h，如图1所示，形成圆形、稍扁平中间突起、边缘齐整、稍有皱褶、乳白色或浅黄色菌落；镜检发现菌体呈杆状，长大于宽，大小为0.5～1μm×1.5～4μm。

(2)菌体样品直接用煮沸法处理获得PCR模板，具体如下：将纯化后的该菌种接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，然后使用灭菌牙签挑取单菌落，然后置于装有10μL的16S-free H₂O的离心管中，99℃热变性10分钟后进行离心分离，取5μL上清液作模板进行PCR反应。

PCR反应体系50μL：2×PCR Mix 25μL，引物Forward Primer 1μL，引物ReversePrimer 1μL，上述模板上清液5μL，ddH₂O补齐到50μL。

引物序列：

Forward Primer：GGTTACCTTGTTACGACTT；

Reverse Primer：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。

PCR程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。PCR结束后，PCR产物直接送上海生工测序，测序结果显示具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。

菌株DL-BJ01 16s rRNA序列如下：

CTGGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACT

GAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCGTCAGACTTCGTCATGCGAGATTCCTACTGCCTGCCTCCGTAGAGTCTGGTCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGTCGATCCACCCCTCCTCAGGGTCGGCCTACGCTATCGATTC

测序结果显示具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列，将其进行Blast分析，发现该菌与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的同源性最高，达到99.6％。

经形态学和16s rRNA鉴定，该EC降解菌株DL-BJ01为Bacillus velezensis。并已于2021年10月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No.23531。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的蛋白酶活性和外肽酶活性测定

从-80℃冰箱取出贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌株的保藏甘油管，接取含菌冰渣一环至含10mL LB培养基中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；然后以1％接种量转接至含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，继续以200-250rpm、37℃振荡培养48h。然后8000rpm离心10min后收集培养基上清，进行蛋白酶活性和外肽酶活性分析。

中性蛋白酶活力的测定参照GB/T 23527-2009规定的方法。酶活单位的定义：1mL酶液在40℃、pH7.0的条件下，1min水解底物酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸所需要的酶量。贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01蛋白酶活性为452U/mL。

参考文献(中国酿造,2017,36(2):99-101；中国酿造,2010,216(3):30-33)所述方法，进行贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的外肽酶(氨肽酶和羧肽酶)活性测定，结果显示，摇瓶水平下，37℃，200rpm条件下培养48h的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01培养液上清，以Leu-pNA(L-亮氨酸-4-硝基苯胺)为底物时酶活为820U/mL；以Cbz-Glu-Tyr(N-苄氧羰酰基-L-谷氨酰-L酪氨酸)为底物时酶活为230U/mL。进一步验证了贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01同时具有氨肽酶和羧肽酶活性。

实施例3：贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌液的制备

1)LB培养基的分装：灭菌的LB培养基无菌分装至50mL离心管(装液量10mL)、250mL三角瓶(装液量50mL)和5L三角瓶(装液量1000mL)。

2)从-80℃冰箱取出贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌株的保藏甘油管，接取含菌冰渣一环至含10mL LB培养基中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h；然后以1％接种量转接至含50mL LB培养基的250mL三角瓶中，继续以200-250rpm、37℃振荡培养24h；最后以1％接种量转接至含750mL LB培养基的3L三角瓶中，于200-250rpm、37℃振荡培养24h。将所述菌液C置于8000rpm离心10min后收集菌体，将贝莱斯芽孢杆菌菌体用质量分数为0.9％氯化钠水溶液稀释，制备成10⁹CFU/mL的菌悬液。备用。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的应用

(1)DL-BJ01菌株在小米醋发酵中的应用

以山西小米为原料，参考SB/T 10306-1999香醋酿制工艺规程、GB/T 18187-2000酿造食醋和T/QGCML288-2022制作小米醋，在糖化和酒精发酵结束后，按10⁵CFU/mL的比例接种入DL-BJ01菌株，以正常发酵组为对照。实验组比对照组提前20天总酸达到3.5。实验组和对照组总酸均≥3.5后，发酵结束，分别进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(2)DL-BJ01菌株在黄酒发酵中的应用

根据参考文献(酿酒科技,2013,3:65-66；中国酿造,2021,40(3):54-63)，按如下工艺：小米、糯米→除杂→浸渍36h→沥水→蒸煮1h→冷却→添加酒曲糖化60h、酵母发酵5-6天→压榨→澄清→过滤→成品，进行小米黄酒的酿造，并在“添加酒曲糖化、酵母发酵”这一步，按10²CFU/mL的比例接种入DL-BJ01菌株，以正常发酵组为对照，实验组和对照组发酵时间分别为5天和6天，酒精度均在11％vol以上。过滤后的成品，分别进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(3)DL-BJ01菌株在酱油发酵中的应用

按照SB/T 10311-1999低盐固态发酵酱油酿造工艺规程，进行酱油发酵，原料豆粕∶麸皮＝7∶3进行混合，经润水处理、蒸煮处理、冷却处理和接种处理，再进行制曲、松散、秤重，加入盐和水，按10⁵CFU/mL(g)的比例接种入DL-BJ01菌株，进行发酵处理，淋油，进行调配、灭菌即为成品，过滤后的成品，分别进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(4)DL-BJ01菌株在郫县豆瓣酱发酵中的应用

按照GB/T 20560-2006地理标志产品郫县豆瓣标准，进行郫县豆瓣酱发酵，并在辣椒胚和甜瓣子混合后，按10⁶CFU/mL的比例接种入DL-BJ01菌株，继续进行后续发酵，实验组和对照组的氨基酸态氮(以氮计)/(g/100g)都大于1.8后结束发酵。成品进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(5)DL-BJ01菌株在发酵豆乳发酵中的应用

按照如下工艺流程：黄豆泡发→发芽→脱皮→磨浆→煮沸→过滤→加入糖和植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌等菌种→按10²CFU/mL比例加入DL-BJ01菌株，发酵→4℃成形→成品。发酵结束后，成品进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(6)DL-BJ01菌株在腐乳发酵中的应用

参考SB/T 10170-2007腐乳标准，进行腐乳发酵，工艺流程：黄豆泡发→磨浆→豆乳→煮浆→滤浆→点浆→上榨→豆腐→切块→白坯→蒸坯→腌制→腌坯→接种→前期发酵→毛坯→按10⁴CFU/g(若为液态，就按10⁴CFU/mL)的比例接种入DL-BJ01菌株→装缸→后期发酵→腐乳→调味汤汁→成品。发酵结束后，成品进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(7)DL-BJ01菌株在黄豆酱发酵中的应用

按照GB/T 24399-2009黄豆酱，进行黄豆酱发酵。工艺流程：黄豆泡发→蒸煮→冷却→沥水→捣碎→接种米曲霉→制酱块→制曲→成曲→清洗酱块→切小块→加食盐→搅打、撇浮沫→按10⁶CFU/mL的比例加入DL-BJ01菌株，发酵→包装→杀菌→成品。发酵结束后，成品进行氨基酸含量测定和氨基酸态氮含量测定。

(8)氨基酸含量测定和氨基酸态氮测定

发酵食品样品中氨基酸含量的测定，则是利用氨基酸测定仪LA8080进行分析。氨基酸态氮的测定方法参考国家标准GB 5009.235-2016和GB/T5009.39-2003中的方法进行。

结果显示，接种贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的发酵食品样品的总氨基酸含量，和未接种菌株样品相比均有提高，说明贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01在发酵食品发酵过程中能够通过分泌蛋白酶和外肽酶等方式加快蛋白质的降解速度，从而提高生酱油的氨基酸含量。(表1)。

表1发酵食品中氨基酸含量分析(单位mg/mL或mg/g，豆乳除外)

注：每个发酵食品组1为加入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的实验组，组2为对照组。-,表示低于0.05；*,该组单位为mg/100mL.

同时，测定了发酵食品样品中氨基酸态氮含量。发酵过程接种了贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的发酵样品的氨基酸态氮含量，远高于发酵过程中未接种贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的发酵样品(对照组)的氨基酸态氮含量。和对照组相比，本发明发酵过程制得的发酵食品中的氨基酸态氮含量均得到提高(表2)。

表2各发酵食品中氨基酸态氮含量分析

注：每个发酵食品组1为加入贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的实验组，组2为对照组。

综上所述，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01具有很好的蛋白酶活性和外肽酶活性，可显著增加发酵食品中游离氨基酸和氨基酸态氮的含量。

实施例5：贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01安全性验证

(1)贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的抗生素敏感性实验：

使用纸片扩散法对贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的抗生素敏感性谱进行了表征。将活化好的菌制成1×10⁸CFU/mL的菌悬液，取200μL菌液涂布于LB平板上，小心放置庆大霉素(10μg)、链霉素(10μg)、红霉素(15μg)、四环素(30μg)、头孢氨苄(30μg)、万古霉素(30μg)、头孢唑林(30μg)、氨苄西林(10μg)、青霉素(10μg)、米诺环素(30μg)、阿米卡星(30μg)11种抗生素药敏纸片，每个纸片的间距不小于24mm。37℃培养24h后以测量并统计抑菌圈直径，分析其耐药性抗性R(≤14毫米)，中期I(14-20毫米)或敏感S(≥20毫米)，做三个平行。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01对11种抗生素均敏感，不存在这些抗生素抗性，菌株安全性较好。

(2)贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的溶血实验

培养基配置：哥伦比亚琼脂+5％脱纤维羊血将制备。分离菌株菌液(约1×10⁸cfu/mL)，取贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌划线于含有5％脱纤维羊血的哥伦比亚平板中，在37℃培养24h，之后观察是否有透明圈。金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为阳性对照。

结果发现，金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性对照组菌株周围出现宽大(6-8mm)、界限分明、完全透明的溶血环，为典型的β溶血。而本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌落周围无溶血，菌株安全性好。

实施例6：贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的菌株的益生性评价

(1)贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的菌株耐酸性检测：

将活菌数量为3×10⁸CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01菌悬液，按5％(V/V)的比例接种于pH 3.0的LB培养基中，37℃孵育，取0h、2h样品进行平板计数计算菌株存活率。结果显示，pH为3.0的LB培养基中培养2h后，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01活菌数由10⁸CFU/mL降至10⁷CFU/mL，存活率达到了90％。说明贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01对酸性环境的耐受性良好。

(2)贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的胆盐耐受性试验：

耐酸试验(pH3.0)中，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01在2h后通过胃到达肠道，活菌数降至3×10⁷CFU/mL。所以，胆盐耐受试验的起始活菌数调整为3×10⁷CFU/mL。将活化好的贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01离心收集菌体，LB培养基洗涤2次，重悬于含有0.3％(W/V)牛胆酸钠的LB培养基中，调整活菌浓度至3×10⁷CFU/mL，37℃孵育，取0h，3h样品进行菌落计数计算菌株存活率。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01在0.3％(W/V)胆盐环境下活菌数有所下降，但3h后活菌数仍在10⁶CFU/mL以上，高于活菌发挥功能特性的菌数临界值。说明贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01对小肠环境的耐受性良好。

(3)贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的抗氧化实验

DPPH自由基清除率试验：0.2mmol/L DPPH：0.0078g DPPH，用无水乙醇溶解，定容至100ml。避光放置，现配现用。将10⁸CFU/mL的DL-BJ01菌株悬浮液(1:1，v/v)与100％乙醇DPPH溶液(0.2mM)混合，在25℃的黑暗中培养30min。单独使用细菌悬浮液和乙醇作为空白，而PBS和DPPH乙醇溶液作为对照。在2330×g(4120rpm)下离心10分钟后收集上清液。在517nm处测量吸光度一式三份。

ABTS自由基清除率试验：将ABTS(14mM)和过硫酸钾(5mM)溶解在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中，以1:1的比例混合，并在25℃下反应12–16h。将100μL菌株DL-BJ01(10⁸CFU/mL)添加到900μL ABTS溶液中，并在25℃下黑暗中培养15min。离心(14000g，1分钟)后，在734nm处测量上清液的吸光度。

结果显示，贝莱斯芽孢杆菌DL-BJ01的DPPH清除活性为90.13％，ABTS清除活性为92.89％，说明菌株DL-BJ01具有很好的抗氧化活性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1. 含有贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的微生物制剂；所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23531。

2.根据权利要求1所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括固体微生物制剂或液体微生物制剂。

3. 一种同时生产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的方法，其特征在于，所述方法是利用贝莱斯芽孢杆菌或权利要求1或2所述的微生物制剂发酵生产；所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23531。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述贝莱斯芽孢杆菌在LB培养基中培养，即可同时生产蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶。

5. 贝莱斯芽孢杆菌或权利要求1或2所述的微生物制剂在制备发酵食品中的应用；所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23531。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述贝莱斯芽孢杆菌或微生物制剂添加至食品发酵阶段进行发酵。

8. 一种提高发酵食品中游离氨基酸含量的方法，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌或权利要求1或2所述的微生物制剂添加至发酵食品的制备中；所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23531。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵食品包括小米醋、黄酒、酱油、豆瓣酱、发酵豆乳、腐乳和/或黄豆酱。