CN114292790B

CN114292790B - 一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备出的纳豆与应用

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Publication number: CN114292790B
Application number: CN202111677500.5A
Authority: CN
Inventors: 王秀伶; 曹伶俐; 刘艳春; 郭霞; 臧瑄; 王东昀; 刘晨
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114292790A

Abstract

本发明涉及微生物及发酵技术领域，具体公开一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备的纳豆与应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HAU‑SDZ6，其保藏编号为CGMCC NO.24151。本发明所提供的枯草芽孢杆菌HAU‑SDZ6用于发酵生产纳豆激酶时，无论是在发酵液中还是在发酵的大豆中均有高纳豆激酶酶活性，纳豆中纳豆激酶的酶活性可达4413.25U/g，发酵得到的纳豆黏液少、拉丝短，纳豆的其他感官品质，如口感、豆粒完整性、色泽、硬度均有较高得分，氨臭味低，有利于提高纳豆被广泛人群的接受度，因此，该枯草芽孢杆菌的发现对带动大豆产业发展具有极其重要的作用。

Description

一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备出的纳豆与应用

技术领域

本发明涉及微生物及发酵技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备的纳豆与应用。

背景技术

发酵豆制品最早起源于我国，其中豆豉的制作历史可以追溯到先秦时期。唐朝初期，鉴真东渡时将豆豉传至日本，之后，大豆发酵技术在日本不断进行改良。日本传统的纳豆制作方法是将煮熟的黄豆冷却后用稻草包裹，放在温度和湿度均较高的地方自然发酵，发酵1-2天后就会在大豆表面出现一层白色黏液状物质，经搅拌会出现黏丝，即为纳豆。日本学者Sawamura首次将纳豆中筛选得到的杆状细菌命名纳豆杆菌，之后日本学者Muto又将纳豆杆菌鉴定为枯草芽孢杆菌。用于纳豆发酵用枯草芽孢杆菌纯种的获得让纳豆生产首次在日本实现了工业化、商品化。迄今，纳豆在日本已有1000多年的食用历史。据史料记载，纳豆在古代一直是日本皇室贵族和僧侣的营养品，是日本“国宝”级食品。

大豆经纳豆枯草芽孢杆菌发酵后，不仅保留了大豆所有的营养成分，同时还产生了纳豆激酶、超氧化物歧化酶、不饱和脂肪酸、生物多糖、游离型大豆异黄酮等多种生物活性成分，这些活性成分集合体使纳豆具有溶血栓、降血压、抗氧化、提高免疫力等多种功能。在纳豆的所有生理活性物质中，人们关注最多的是纳豆激酶。1987年，日本的须见洋行博士在著名的“两点半实验”中偶然发现了纳豆中含有可以溶解血栓的酵素，并将这种酵素命名为“纳豆激酶”。目前已知纳豆激酶为丝氨酸蛋白酶，具有极强的纤维蛋白溶解特性，其溶血栓活性是纤溶酶的4倍。

1998年日本生物科学研究所利用其筛选的菌株和发酵技术研制了被称为NSK-SD的第一代产品纳豆激酶制品，实现了纳豆激酶的产业化生产。虽然纳豆具有诸多保健功能，但因纳豆还具有独特的氨臭味以及发酵过程中产生的大量黏液且有苦味等缺点，目前纳豆尚不能被除日本以外其他国家的人群广泛接受，且目前纳豆中纳豆激酶的活性较低。因此，研发一种可有效改善纳豆感官品质，提高纳豆中纳豆激酶的酶活性，以提高纳豆的保健功能和被广泛人群的接受度，对于提高纳豆的应用市场具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有纳豆具有氨臭味，具有大量黏液不能被人群广泛接受，以及纳豆中纳豆激酶酶活性较低的问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备的纳豆与应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HAU-SDZ6，其保藏编号为CGMCCNO.24151。

所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6是从自制发酵酸豆汁中分离得到，对该菌株进行分离鉴定，该菌株分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其16S rRNA的基因序列如SEQ ID NO.3，已于2021年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.24151，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所提供的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6用于发酵生产纳豆时，无论是在发酵液中还是在发酵的大豆中均有高纳豆激酶酶活性，纳豆中纳豆激酶的酶活性可达4413.25U/g，发酵得到的纳豆的黏液少、拉丝短，纳豆的其他感官品质，如口感、豆粒完整性、色泽、硬度均有较高得分，氨臭味低，气味得到明显改善，有利于提高纳豆被广泛人群的接受度，因此，该枯草芽孢杆菌的发现对延长大豆产业链、带动大豆产业发展具有极其重要的作用。

本发明中枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的分类学特征为：

革兰氏阳性，接触酶阴性，菌落圆形边缘不整齐，在LB固体培养基上呈白色，菌落直径2.5mm～4.5mm，在LB液体培养基中，菌体为杆状，有单个芽孢，芽孢端生。

在糖发酵方面，能发酵利用葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖和麦芽糖，不能发酵利用乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、甘露糖和纤维二糖。另外，该菌株过氧化氢酶阳性、V.P.试验阳性，明胶液化阳性，酪蛋白水解酶阳性，硝酸盐还原试验阳性；产吲哚能力阴性、淀粉水解酶阴性、M.R.阴性、亚硝酸盐还原试验阴性、H₂S试验阴性。

本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6在制备纳豆中的应用。

本发明提供的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6用于发酵生产纳豆时，其产纳豆激酶水平显著提高，纳豆中纳豆激酶的酶活性为4413.25U/g，同时可有效改善纳豆的口感和外观，纳豆黏液明显减少，氨臭味显著降低，在制备纳豆领域具有较好的实用价值。

本发明还提供了一种纳豆，利用所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6制备而成。

本发明还提供了一种纳豆的制备方法，包括如下步骤：将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液接种至蒸熟大豆中，37℃～44℃发酵18h～22h，得纳豆。

本发明中上述对数生长期的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液的OD值为4.0以上。

优选的，所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的培养液的接种量与蒸熟大豆质量体积比为(6～10)mL:100g。

优选的，所述蒸熟大豆是由大豆与水按照重量体积比为1:2.5～1:3.5在18℃～20℃浸泡12h～14h，然后于115℃～125℃蒸制30min～35min得到的；其中，重量的单位是克，体积的单位是毫升。

优选的，所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液的制备方法包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的活化菌液按1％～2％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，37℃～40℃培养12h～15h，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的培养液；将所述培养液离心所得菌泥重悬在灭菌后的蒸馏水中，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液。

本发明中上述对数生长期的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的培养液的OD值为4.0以上。

上述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的活化菌液是将枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的甘油管冷冻保藏菌种融化，并按1％～2％(v/v)接种量接种到LB液体培养基中，37℃下培养48h得到的。

本发明还提供了上述纳豆在制备抗氧化、提高免疫力保健食品中的应用。

本发明还提供了上述纳豆在制备溶血栓、降血压药品中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例中采用脱脂牛奶平板法和纤维蛋白平板法筛选高产纳豆激酶的菌株的照片，其中，图1(A)脱脂牛奶平板法，图1(B)纤维蛋白平板法；

图2为1号菌株和2号菌株的基于16S rRNA基因序列的系统发育树；

图3为3号菌株、6号菌株和7号菌株的基于16S rRNA基因序列的系统发育树；

图4为1号和2号菌株基于gyrb基因序列的系统发育树；

图5为1号菌株、2号菌株和7号菌株的耐胆盐性试验的结果对比图；

图6为1号菌株、2号菌株和7号菌株的耐人工胃液试验的结果对比图；

图7为1号菌株、2号菌株和7号菌株的耐人工肠液试验的结果对比图；

图8为不同枯草芽孢杆菌发酵大豆所得纳豆的外观照片；

图9为采用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6制作的纳豆与市售纳豆的纳豆激酶酶活性对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

1.枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的筛选

(1)自制发酵酸豆汁中枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的分离

①自制发酵酸豆汁的制作

绿豆除去杂质，流洗干净后用清水浸泡至豆粒无硬芯，用手可轻易捻碎为准，以质量体积比1g:8mL的豆水比例加入清水打浆，用滤网将豆渣过滤除去，过滤后的液体沉淀2h～3h，去除底部沉淀的淀粉，将上层的浆水和中层的豆汁转移至新的容器中，32℃发酵1.5天～2.5天，直到液体有浓郁的酸臭味，除去上层浮沫，得到自制酸豆汁。

②梯度稀释

将自制的发酵酸豆汁使用LB液体培养基进行10倍梯度稀释，稀释至10^-5，取50μL稀释度为10^-3、10^-4、10^-5的稀释液分别涂布于LB固体培养基上，置于普通恒温培养箱中37℃培养24h，观察并记录菌落形态，进行后续的初筛。

③高产纳豆激酶菌株的分离筛选

初筛：将上述单菌落接种LB液体培养基中培养24h，在常温下8000rpm/min离心10min，除去上清液，使用无菌水将菌泥重悬后再次离心，除去上清液，得到的菌泥加入20μL的LB液体培养基，混匀，取5μL涂布于脱脂牛奶平板(脱脂牛奶平板：A液：脱脂奶粉0.4g/L，115℃灭菌15min；B液：琼脂粉0.4g/L，121℃灭菌15min；混合均匀后倒平板中)，于37℃倒置培养2d，筛选产溶解圈的菌株。从139株菌株中共筛选出83株产蛋白酶的菌株，如图1A所示。

复筛：将初筛得到的产蛋白酶的菌株接种于液体发酵培养基(液体发酵培养基：葡萄糖0.2g/L，大豆蛋白胨0.2g/L，CaCl₂ 2mg/L，MgSO₄ 5mg/L，KH₂PO₄ 10mg/L，K₂HPO₄ 25mg/L，121℃灭菌15min)中37℃、180rpm/min培养48h，8000rpm/min离心10min，上清液即为粗酶液。纤维蛋白平板打孔，在每个孔中注入10μL的粗酶液，以无菌水为阴性对照，于37℃倒置培养18h，筛选出产溶解圈的菌株，即为产纤溶酶的菌株。从83株产蛋白酶菌株中筛选出36株产纤溶酶的菌株，如图1B所示。

初筛和复筛均以平板内产生溶解圈为准。

④发酵液纳豆激酶酶活性测定

将复筛得到的36株产纤溶酶的菌株接种于液体发酵培养基(液体发酵培养基：葡萄糖0.2g/L，大豆蛋白胨0.2g/L，CaCl₂ 2mg/L，MgSO₄ 5mg/L，KH₂PO₄ 10mg/L，K₂HPO₄ 25mg/L，121℃灭菌15min)中37℃、180rpm/min培养48h，8000rpm/min离心10min，上清液即为粗酶液。纤维蛋白平板打孔，在每个孔中注入10μL的粗酶液，以无菌水为阴性对照，于37℃倒置培养18h，测定其溶解圈的面积，根据尿激酶标准曲线和纤维蛋白平板的溶解圈面积计算发酵液中纳豆激酶的酶活。从36株产纤溶酶的菌株中筛选出10株发酵液中纳豆激酶酶活性高于1000U/mL的菌株，结果如表1所示。

表1不同菌株发酵液中的纳豆激酶酶活性

⑤纳豆中的纳豆激酶酶活性的测定

以筛出的10株高产纳豆激酶的菌株发酵蒸熟大豆，测定所得纳豆的纳豆激酶酶活性，从而筛选出适合发酵蒸熟大豆制作纳豆的菌株。

A.发酵大豆的制备

选取颗粒饱满、品相好的大豆20g，清洗干净，将大豆置于玻璃瓶中，加入大豆体积3倍的水，浸泡10h，将浸泡好的大豆于高温蒸汽灭菌锅中121℃蒸煮30min，灭菌结束后将大豆冷却至50℃，按照每100g蒸熟大豆接种生长至对数生长期中后期的菌液(OD值4.0以上)10mL进行接种，搅拌均匀，搅拌时用力要轻，避免戳破大豆，将接种后的大豆于42℃培养箱发酵18h，发酵结束后将发酵大豆放入4℃冰箱后熟24h。

B.发酵大豆粗酶液的制备

取上述发酵大豆2g于研钵中，研磨，研磨过程中按照发酵大豆与生理盐水的质量体积比为1g:5mL加入生理盐水，研磨中逐渐加入生理盐水，最终加入生理盐水体积总共10mL，4℃充分浸提6h，取2mL上清液于8000rpm/min离心10min，上清液即为粗酶液。

C.发酵大豆酶活测定

取上述粗酶液10μL点样于纤维蛋白平板中，将点样后的纤维蛋白平板于37℃培养箱中反应18h后测定其溶解圈的面积，根据尿激酶标准曲线和纤维蛋白平板的溶解圈面积计算发酵大豆中纳豆激酶的酶活。

其中，单位为U/mL的尿激酶标准曲线的测定方法为(琼脂糖、凝血酶、牛纤维蛋白原购自索莱宝生物科技有限公司)：

溶液配制：使用生理盐水15mL配制1％的琼脂糖溶液；并使用生理盐水2mL溶解20mg牛纤维蛋白原，配制纤维蛋白原溶液；

将1000U凝血酶粉末溶解于1mL生理盐水中，分装至200μL EP管中，每管10μL，使用生理盐水定容至100μL，配制成每管10U，体积100μL的凝血酶溶液；

混合：取15mL 1％的琼脂糖溶液，加热完全溶解，降温，加入2mL的纤维蛋白原溶液和100μL的凝血酶溶液，轻微震荡混匀避免产生气泡，迅速倒入9cm×9cm的平皿中，制成纤维蛋白平板；

打孔：将制备好的纤维蛋白平板于4℃放置1h，使用打孔器在纤维蛋白平板上打直径为2mm的孔；

绘制单位为U/mL的尿激酶的标准曲线：尿激酶粉末为50000U/g，配制100U/mL的母液，按比例使用生理盐水进行稀释，配制成100U/mL、200U/mL、400U/mL、600U/mL、800U/mL、1000U/mL的尿激酶溶液，每个浓度的尿激酶溶液取10μL点样于纤维蛋白平板中，设置3个平行，在37℃培养箱保温18h后取出，用游标卡尺测定溶圈的直径，测量后计算溶解圈面积，去除点样孔面积后，取其平均值，以尿激酶酶活(U/mL)为横坐标、以溶解圈面积(mm²)为纵坐标绘图，得出尿激酶的标准曲线：y＝0.2393x+170.88，R²＝0.9996；其中x为尿激酶酶活，y为溶解圈面积。

取上述B制得的发酵大豆粗酶液10μL，点样于纤维蛋白平板中，用与尿激酶溶解圈测定相同的方法，计算粗酶液的溶解圈面积，带入上述公式，得出的酶活即为粗酶液中的纳豆激酶酶活(U/mL)。

为便于对比分析，本发明还绘制了单位为IU/mL的尿激酶的标准曲线。尿激酶(10000IU/mg，10mg)、凝血酶(1000U)、纤维蛋白原(1.0g)，均为Sigma公司产品；琼脂粉，购于国药集团化学试剂有限公司。

其中，单位为IU/mL的尿激酶标准曲线的测定方法为：

纤维蛋白平板制作：称取1g琼脂粉加到250mL三角瓶中，量取100mL PBS(10mmol/LpH7.2)缓冲液溶解琼脂，置于微波炉中加热溶解；待琼脂冷却至50℃时取25mL于灭菌的离心管中，向离心管中加入800μL浓度为50mg/mL的纤维蛋白原溶液及120μL浓度为10U/mL的凝血酶，混合均匀后迅速倒入平皿中，37℃生化培养箱反应105min，以形成纤维蛋白凝块。

标准曲线的制作：将尿激酶样品(200IU/mL、400IU/mL、600IU/mL、800IU/mL、1000IU/mL、1200IU/mL、1400IU/mL、1600IU/mL、1800IU/mL和2000IU/mL)，各10μL点样于新配制的纤维蛋白平板上，放置10min，移入37℃培养箱，保温18h后取出，测定溶解圈的直径，上述操作设定3个平行组，测量后计算溶解圈面积，去除点样孔面积后，取其平均值，以尿激酶酶活(IU/mL)为横坐标、以溶解圈面积(mm²)为纵坐标绘图，得出尿激酶的标准曲线：y＝0.1024x+448.74，R²＝0.9991；其中x为尿激酶酶活，y为溶解圈面积。

取B制备的发酵大豆粗酶液，加入等体积量的生理盐水稀释一倍后，取10μL点样于纤维蛋白平板中，用与尿激酶溶解圈测定相同的方法，计算粗酶液的溶解圈面积，带入上述公式，得出的酶活即为粗酶液中的纳豆激酶酶活(IU/mL)。

用筛出的10株发酵液中高产纳豆激酶的菌株发酵蒸熟大豆，结合纳豆感官评价，挑选出5株纳豆中纳豆激酶酶活性较高的菌株，其纳豆中纳豆激酶平均酶活性如表2所示。

表2不同菌株发酵的纳豆中的纳豆激酶酶活性

⑥产纳豆激酶菌株的纯化与保藏

生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》进行分析。

将分离得到的5株纳豆激酶酶活性较高的菌株分别在LB固体培养基中划线培养，长出单菌落后，再分别对长出的单菌落重新进行划线，重复至少3次以上，确保生长的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到4mL LB液体培养基种，培养12h后取菌液200μL，加入到盛有200μL已灭菌的50％(v/v)甘油水溶液的冻存管中，混匀再将其保藏在-80℃的超低温冰箱中，对低温保藏的菌株定期进行定期复壮培养和转化活性测定。

⑦菌种鉴定

对上述得到的5株纳豆中纳豆激酶酶活性较高的菌株进行生理生化指标测定，结果如表3所示。

表3产纳豆激酶菌株生理生化特性

以上述5株高产纳豆激酶菌株的总DNA为模板，以通用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.1)；1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ IDNO.2))为引物，对16S rRNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行测序，测序结果经Blast比对发现，表2中的1号菌株和2号菌株与枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌亚种的16S rRNA基因序列的相似性均高于99％；3号菌株、6号菌株和7号菌株则与耐盐芽孢杆菌的相似性高于99％。因此，将1号菌株和2号菌株一起构建了基于16S rRNA基因序列的系统发育树，如图2所示；将3号菌株、6号菌株和7号菌株一起构建了基于16SrRNA基因序列的系统发育树，如图3所示。

根据菌株16S rRNA基因序列Blast比对结果，结合上述系统发育树和生理生化特性，初步将3号菌株、6号菌株和7号菌株鉴定为耐盐芽孢杆菌；将1号和2号菌株鉴定为枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌亚种。

为进一步分析1号和2号菌株究竟为枯草芽孢杆菌还是枯草芽孢杆菌亚种，又分别克隆了gyrb基因，构建了基于gyrb基因的系统发育树，如图4所示。引物设计：使用gyrb基因引物UP1-F和UP-2R；DNA提取：使用CTAB法提取DNA作为DNA模板；PCR扩增。根据基于gyrb基因的系统发育树，发现两株枯草芽孢杆菌聚在枯草芽孢杆菌属中，而与枯草芽孢杆菌亚种亲缘关系相对较远。因此将1号菌株和2号菌株均鉴定为枯草芽孢杆菌。

⑦菌株安全性和益生性评价

为了了解菌株的安全性，选用纳豆中纳豆激酶含量最高的7号菌株以及1号和2号枯草芽孢杆菌进行小鼠灌胃试验。

A.产纳豆激酶菌株冻干粉的制备

将冻存菌株于-20℃取出，使用LB液体培养基进行活化，经过两次传代后进行菌株冻干粉的制备。

保护剂溶液的配制：蔗糖7.5％，脱脂奶粉10％，余量蒸馏水，115℃灭菌15min；麦芽糊精12.5％，余量蒸馏水，121℃灭菌15min，混匀使用。

将菌株进行扩大培养(100mL菌液加入250mL三角瓶中)，培养至稳定期(OD值7.0以上)，然后全部分装至2mL离心管中，8000rpm离心10min，去除上清液，向菌泥中加入1mL保护剂溶液，混合均匀，放入-80℃冰箱预冻2h，提前打开冻干机预冷30min，将预冻好的保护剂与菌泥的混合溶液于冻干机中冷冻干燥24h，得菌株冻干粉。

将制作好的菌株冻干粉加无菌水1mL，室温下复苏30min后进行平板菌落计数。用生理盐水将菌粉调整为低剂量组(2×10⁷CFU/mL)和高剂量组(2×10⁹CFU/mL)的菌悬液，用于后续动物实验。

B.小鼠急性经口毒性试验

本实验参照GB15193.3-2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》限量法进行。选择体重在43～47g的ICR雄性小鼠进行试验，适应性喂养结束后，随机选取10只小鼠为一组，共分为4组，分别为生理盐水对照组、菌株采用高剂量组(2×10⁹CFU/mL)的菌悬液进行试验。

试验前禁食6h，自由饮水；灌胃后禁食4h，自由饮水。每天下午16点进行灌胃，每只鼠每次灌胃剂量为0.5mL，连续灌胃14d。灌胃后每天观察并记录小鼠的生理状态及死亡情况，在第0d、7d和14d对小鼠进行称重，记录小鼠体重和饲料摄入量从而计算小鼠的饲料利用率。实验期满安乐死处死并解剖小鼠，摘取心、肝、肺、肾、脾，称重。观察脏器有无异常，是否发生病变，并计算脏器指数。

饲料利用率(％)＝小鼠增加的体重(g)/饲料摄入量(g)×100％

脏器指数(％)＝脏器重量(g)/小鼠体重(g)×100％

C.28d经口毒性试验

本实验参照GB15193.22-2014《食品安全国家标准28天经口毒性试验》进行。

选择体重在43～47g的ICR雄性小鼠进行试验，试验前对小鼠进行适应性喂养。适应性喂养结束后，随机选取10只小鼠为一组，共分为10组。分别为生理盐水对照组、菌株采用高剂量组(2×10⁹CFU/mL)的菌悬液和低剂量组(2×10⁷CFU/mL)的菌悬液进行试验。

每天下午17点进行灌胃，每天灌胃1次，每只鼠每次灌胃剂量为0.5mL，连续灌胃30d。每天自由饮食饮水。试验期间每天观察并记录小鼠的生理状态及死亡情况，每周对小鼠进行称重，记录小鼠体重和饲料摄入量从而计算小鼠的饲料利用率。实验期满处死并解剖小鼠，摘取心、肝、肺、肾、脾，称重。观察脏器有无异常，是否发生病变，并计算脏器指数。

小鼠急性经口毒性实验及28d经口毒性的试验结果表明，灌胃三种菌株的小鼠活跃，毛发柔顺有光泽，生理状况正常，未观察到任何异常现象，未发现小鼠稀便或死亡情况。另外，与对照组小鼠相比，灌胃菌株小鼠的摄食量和体重均未出现显著变化。经对小鼠解剖，观察灌胃菌株小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未发生病变，各组脏器指数均与对照组小鼠无显著差异。结果如表4-表9所示所示。

表4急性经口毒性试验中小鼠摄食量变化

注：同列数字后面的字母出现与空白对照不同字母时，表示差异显著(p≤0.05)。

表5急性经口毒性试验中小鼠的体重变化

表6急性经口毒性试验的小鼠脏器指数

表7 28d经口毒性试验小鼠摄食量变化情况

表8 28d经口毒性试验小鼠其体重变化情况

表9 28d经口毒性试验小鼠的脏器指数

抗生素耐药性试验：

参照YY/T 1191-2011《抗菌剂药敏纸片》，将7号菌株以及1号和2号枯草芽孢杆菌进行耐药性试验，结果如表10所示。

使用Mueller-Hinton琼脂平板进行试验，使用直径90mm的平皿，倒厚度为4mm的平板进行使用。

将试验菌株活菌数培养至1.5×10⁸CFU/mL，取100μL菌液进行涂布平板，涂抹均匀后放置3～10min，不要超过15min，使MH琼脂平板表面无残余水分。

选择甲氧苄啶(5μg/片)、头孢氨苄(30μg/片)、四环素(30μg/片)、庆大霉素(10μg/片)、氨苄西林(10μg/片)、头孢哌酮(75μg/片)、美罗培南(10μg/片)、青霉素(10μg/片)、红霉素(15μg/片)、利福平(5μg/片)、万古霉素(30μg/片)、左氧氟沙星(5μg/片)12种药敏纸片。

在每个MH琼脂平板底部按照据平皿边缘20mm，据平皿中心25mm的地方，对称点上4个点作为标记，将药敏纸片正面贴到做好的标记上方，每个MH琼脂平板放置4种抗生素纸片，15min内，将MH琼脂板正置培养，37℃培养18h，对抑菌环直径进行测量。药敏判定标准参照CLSI/NCCLS M100中葡萄球菌的抑菌圈直径。

表10产纳豆激酶菌株对不同抗生素的抗性

由上表可以看出，在供试的12种抗生素中，1号菌株和2号菌株仅对氨苄西林有一定的抗性；7号菌株除对氨苄西林有一定的抗性外，还对利福平和青霉素有一定抗性。

抑菌试验：

使用单层平板琼脂扩散法，按照1％的接种量，将条件致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(菌种保藏ATCC 27217)和大肠杆菌(Escherichia coli)(菌种保藏CICC 10372)37℃摇床180rpm/min培养4h，取200μL菌液使用玻璃珠均匀地涂布于LB固体培养基上，待菌液被LB固体培养基完全吸收后，使用无菌打孔器打6mm的圆孔。

将产纳豆激酶的菌株置于LB液体培养基中培养24h左右，得生长至稳定期的菌株培养液(OD值7.0以上)，取部分培养液于8000r/min离心10min，得上清液；将菌株培养液(OD值7.0以上)、上清液、链霉素分别取20μL加入圆孔中，置于37℃培养箱培养24h后测量抑菌圈直径。

抑菌试验结果表明，利用1号、2号和7号菌株的培养液和上清液对大肠杆菌均未表现出抑制作用；在金黄色葡萄球菌试验中，仅7号菌株的培养液和上清液对金黄色葡萄球菌表现出较弱的抑制作用。

胆盐耐性试验：

胆盐溶液配置：在LB液体培养基中加入牛胆盐，配置浓度为0.3％的牛胆盐LB液体培养基，121℃灭菌15min，冷却备用。

将产纳豆激酶的菌株置于LB液体培养基中培养24h，按照10％的接种量接种至2mL含牛胆盐的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃培养，设置0.5h、1h、2h、3h、4h的培养时间，以0h的活菌数作为对照，取菌液100μL进行稀释涂布计算活菌数，每个培养时间设置3个重复。结果如图5所示。

菌株耐受性试验结果表明，1号和2号菌株对人工胆盐有良好耐受性，7号菌对人工胆盐耐受性较差。

人工胃液和肠液耐受性试验：

人工胃液配置：参照《中华人民共和国药典》2020年版四部配置人工胃液，使用0.22μL的无菌水系滤膜过滤除菌，4℃备用。将产纳豆激酶的菌株置于LB液体培养基中培养24h，按照10％的接种量接种至pH为2.0的2mL人工胃液中，180rpm/min，37℃培养，设置0h、1h、2h、3h、4h的培养时间，以0h的活菌数作为对照，取菌液100μL进行稀释涂布计算活菌数，每个培养时间设置3个重复。结果如图6所示。

结果表明，7号菌株对人工胃液耐受性较差，1号和2号菌株则对人工胃液均具有较好的耐受性。

人工肠液配置：参照《中华人民共和国药典》2020年版四部配置人工肠液，使用0.22μL的无菌水系滤膜过滤除菌，4℃备用。将产纳豆激酶的菌株置于LB液体培养基中培养24h，按照10％的接种量接种至pH 6.8的2mL人工肠液中，180rpm/min，37℃培养，设置0h、1h、2h、3h、4h的培养时间，以0h的活菌数作为对照，取菌液100μL进行稀释涂布计算活菌数，每个培养时间设置3个重复。结果如图7所示。

结果表明，7号菌株以及1号和2号菌株对人工肠液均具有较好的耐受性。

由于耐盐芽孢杆菌不在国家食品目录中，虽然枯草芽孢杆菌也不在目录中，但是枯草芽孢杆菌属于传统上用于食品加工的菌种，且迄今为止未见因食用纳豆出现任何不良反应的报道，结合上述有关菌株的安全性和益生性试验结果，选择1号和2号菌株进行蒸熟大豆的发酵试验。结果表明，2号菌株发酵的纳豆在综合感官品质上优于1号，因此，最终选择2号菌株进行后续试验，并将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HAU-SDZ6。

2.枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6发酵大豆的方法：

枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的甘油管冷冻保藏菌种融化，并按1％～2％(v/v)接种量接种到LB液体培养基中，37℃下培养48h，得活化菌液；将上述活化菌液按1％～2％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，37℃～40℃培养12h～15h，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的培养液；将所述培养液离心所得菌泥重悬在灭菌后的蒸馏水中，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液(OD值4.0以上)。

挑选颗粒饱满、无明显虫蛀损坏的黄豆，流水冲洗后在饮用水(1g:3mL)中常温下浸泡12h～14h，直至大豆两片子叶可轻易用手分开，且中间有轻微凹陷为佳，将浸泡好的黄豆洗涤后放入高压灭菌锅内121℃蒸煮30min。放凉后，按照每100g蒸熟大豆接种10mL生长至对数生长期的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6菌液的比例进行接种，在恒温恒湿培养箱内37℃发酵18h～22h，得纳豆。

3.枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6发酵的纳豆的品质

(1)感官评价

将本发明采用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6发酵制备的纳豆，以及市售的山大纳豆、滨莉纳豆、燕京纳豆、崂山纳豆、花彩纳豆和七柚园纳豆进行感官评价对比。

选择30名年龄在21～50岁之间的健康男性和女性作为纳豆感官评价小组成员，不向小组成员提供关于纳豆的任何信息。以硬度(适中为高分)、色泽(颜色鲜亮为高分)、豆粒完整度(无裂纹为高分)、口感(绵、苦味小、不过滑为高分)、氨臭气味(气味弱得分高)、粘性(粘性过高为低分)等6项指标作为评价指标，基本点设为3分，最高分为5分。按照21～30岁、31～40岁、41～50岁的年龄段分为三个组，每个组的感官评分各去掉一个最低分和一个最高分，剩余24名志愿者打分取平均值，结果如表11所示。

表11

结果发现，用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6发酵的纳豆除粘性明显低于市售纳豆外，其余感官品质，如气味、口感、完整度、色泽和硬度等5个指标均获得较高评分。且本次感官评价中，多数小组成员对表观黏液量大、口感过于光滑的评分普遍较低，以为这两个特征以及氨臭味容易让人感觉恶心而难以下咽。

另外，为了解表观黏液量和黏液粘度，还对黏液产率和拉丝长度进行测定。结果表明，用本发明菌株HAU-SDZ6发酵的纳豆黏液产率为6.37％、拉丝长度12cm；山大、滨莉、燕京、崂山、花彩和七柚园纳豆的黏液产率分别为7.16％、6.05％、6.62％、6.71％、6.95％和7.08％；拉丝长度分别为185cm、175cm、75cm、95cm、176cm和180cm。

由于生产市售纳豆所用原料大豆可能不尽相同，为了更直观观察本发明分离得到菌株HAU-SDZ6制作的纳豆与商品纳豆的不同，除用购买的商品纳豆直接与本发明中的自制纳豆进行对比外，本发明还从购买的6种商品纳豆中分别分离了6株商品纳豆中的发酵菌株，经鉴定均为枯草芽孢杆菌，并用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6和分自商品纳豆的6株枯草芽孢杆菌分别发酵大豆，制得的纳豆如图8所示。

从图中可以明显看出，采用本发明菌株HAU-SDZ6制作的纳豆的黏液量明显偏低。

(2)纳豆激酶酶活性测定

分别测定采用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6制作的纳豆与市售纳豆(山大纳豆、滨莉纳豆、燕京纳豆、崂山纳豆、花彩纳豆和七柚园纳豆)的纳豆激酶活性，结果如图9所示。

且试验结果证明，纳豆放置在-20℃低温冷冻保藏，贮藏6个月对纳豆激酶酶活性影响不大。

(3)纳豆多糖含量测定

A.纳豆中总糖的提取

按照发酵大豆：蒸馏水＝1:20的质量比提取纳豆粗多糖。取1g纳豆于研钵中，加入20mL蒸馏水研磨均匀，置于50mL离心管中，50℃水浴超声提取2h，4000rpm/min离心10min，取上清液作为待测液。

B.总糖含量测定(苯酚-硫酸法)

配制0.1mg/mL的葡萄糖溶液和6％的苯酚溶液，6％的苯酚溶液现配现用。绘制葡萄糖标准曲线：y＝0.0049x-0.0001；R²＝0.9996。横坐标：不同含量(20μg、40μg、60μg、80μg、100μg、120μg)的葡萄糖，纵坐标：490nm处吸光度。样品含量测定：将A中的上清液样品稀释100倍，取2mL稀释样品液进行反应，计算纳豆中纳豆总糖的含量。

C.还原糖含量测定(DNS法)

葡萄糖溶液标准曲线绘制：

配制不同浓度葡萄糖溶液，进行吸光度测定，得到葡萄糖标准曲线：y＝0.0006x-0.0509；R²＝0.9992。横坐标：不同含量(200μg、400μg、600μg、800μg、1000μg、1200μg、1400μg)的葡萄糖，纵坐标：540nm处的吸光度。样品含量测定：将上述A所得上清液样品稀释10倍，取2.5mL待测液进行反应，测定吸光度，计算纳豆中纳豆还原糖的含量。利用纳豆总糖含量减去纳豆还原糖含量得到纳豆多糖的含量。

结果表明，用枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6发酵大豆制作的纳豆中纳豆多糖仅显著低于日本山大纳豆，与日本滨莉纳豆无显著差异，显著高于国产四种纳豆(燕京纳豆、崂山纳豆、花彩纳豆和七柚园纳豆)。用HAU-SDZ6发酵制成的纳豆、山大、滨莉、燕京、崂山、花彩和七柚园纳豆的纳豆多糖含量分别为：40.87mg/g、58.01mg/g、42.27mg/g、33.26mg/g、32.83mg/g、32.20mg/g和18.95mg/g。

(3)DPPH自由基清除能力测定

取上述发酵大豆1g于研钵中，加1mL蒸馏水研磨，磨碎后加入体积百分含量为70％的乙醇水溶液20mL，在37℃摇床180rpm下提取2h，离心取上清液300μL，加900μL的0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光反应30min，然后8000rmp离心10min，取上清在517nm波长下测定吸光值。

DPPH清除率用以下公式计算：

DPPH自由基清除率＝(A₀-A₁)/A₀×100％

其中，A₀为空白吸光值；A₁为样品吸光值。

结果表明，用HAU-SDZ6发酵制成的纳豆、山大、滨莉、燕京、崂山、花彩和七柚园纳豆对DPPH自由基的平均清除率分别为：60.72％、60.22％、55.57％、58.81％、45.96％、54.23％和51.75％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种枯草芽孢杆菌、用其制备纳豆的方法及制备的纳豆与应用

<130> 2021.12.28

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 通用引物27F

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 通用引物1492R

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1451

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 3

cctggcgggc gtgctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440

aaggtaccag a 1451

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HAU-SDZ6，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.24151。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6在制备纳豆中的应用。

3.一种纳豆，其特征在于，利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6制备而成。

4.如权利要求3所述的纳豆的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液接种至蒸熟大豆中，37℃～44℃发酵18h～22h，得纳豆。

5.如权利要求4所述的纳豆的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液的接种量与蒸熟大豆的体积质量比为(6～10)mL:100g。

6.如权利要求4所述的纳豆的制备方法，其特征在于，所述蒸熟大豆是由大豆与水按照重量体积比为1:2.5～1:3.5在18℃～20℃浸泡12h～14h，然后于115℃～125℃蒸制30min～35min得到的；其中，重量的单位是克，体积的单位是毫升。

7.如权利要求4所述的纳豆的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液的制备方法包括如下步骤：将所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的活化菌液按1％～2％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，37℃～40℃培养12h～15h，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的培养液；将所述培养液离心所得菌泥重悬在灭菌后的蒸馏水中，得所述枯草芽孢杆菌HAU-SDZ6的菌液。

8.权利要求3所述的纳豆在制备抗氧化、提高免疫力保健食品中的应用。

9.权利要求3所述的纳豆在制备溶血栓、降血压药品中的应用。