CN1857722A - 蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种溶栓酶，具体地说是一种由蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶。本发明提供的蜡激酶在HPLC检测条件：色谱柱：Waters Protein－PakTM 60 7.8×300mm；流动相：0.2mol/L NaH2PO4－CH3OH(95∶5)；流速：1ml/min；检测波长：220nm，有HPLC指纹图谱，峰在7～9min之间。本发明还提供了蜡激酶的制备方法。本发明还提供了蜡样芽孢杆菌以及本发明蜡激酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途。大鼠颈动脉血栓形成试验表明，本发明提供的蜡激酶具有较明显的抗血栓形成作用，为治疗血栓疾病提供了一种新的用药选择。

Description

蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途
技术领域
本发明涉及蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途，具体地说是一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途，属于生物医药领域。
背景技术
血栓疾病是危害人类健康的主要疾病之一，如脑血栓、急性心肌梗死的死亡率已达40％以上，血栓病逐渐成为死亡率占首位的病症。溶解血栓是治疗这类疾病的重要手段。当今用于临床治疗的溶栓药物如链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)、重组组织型纤溶酶原激活剂(Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator，rt-PA)等均存在一定的缺陷：毒性较强、副作用较大、体内半衰期短、价格昂贵等。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)，是从纳豆中提取的一种丝氨酸蛋白酶。这种溶纤维蛋白酶(Plasmin)由275个氨基酸组成，无毒、无副作用。相对分子量为27728，远远小于尿激酶等，因此作为药物具有易于吸收的优点。等电聚焦显示其pI为8.6±0.3，在pH6.0～12.0的条件下稳定，低于pH5.0则不稳定。通过人体实验发现纳豆激酶能将纤维蛋白溶酶原、尿激酶原激活成纤维蛋白溶酶和尿激酶而达到溶血栓的效果，同时还发现纳豆激酶可激活血浆中组织型溶纤酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA)的产生，从而间接表现出其溶栓活性。纳豆激酶在自然状态下较稳定，且在胃肠环境中不会失活。实验发现它不仅作用迅速，而且疗效时间长。
纳豆激酶制剂的口服及其纤溶作用实验显示至第4小时活性达最高，然后开始下降，至8小时仍有作用。同时发现内源组织型纤溶酶原激活剂的量亦有增加，表明纳豆激酶通过肠道吸收进入血液后除它本身的纤溶活性外，还激活血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，增加其内源纤溶活性。而且纳豆激酶是直接破坏交链纤维蛋白，而不是破坏体内的纤维蛋白原。纳豆激酶的纤维蛋白原水解活性远低于纤溶酶和尿激酶，与t-PA基本相同。提示纳豆激酶在发挥纤溶作用时，不易引起出血倾向。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)又称蜡样芽孢杆菌，广泛分布于自然界中。菌体杆状，直或接近直，0.3～2.2×1.2～7.0微米。多数运动；鞭毛典型侧生。形成抗热内生孢子；在一个孢子囊中，孢子不多于1个。暴露于空气中时，不妨碍孢子的形成。革兰氏反应为：阳性、仅在生长早期为阳性、阴性。孢子椭圆或柱状，孢子囊不明显膨胀，孢子中生；接触酶、V.P反应、厌氧生长阳性，50℃生长阴性，平板菌落和斜面划线生长呈蜡质状。有些菌株报道的DNA的G+C含量为32～33克分子％(熔解温度法)和33～37克分子％(分析法)。杆状菌体有成链的趋势；链的稳定性决定了菌落的形态，在不同的菌株中菌落形态变化很大。一种特殊的菌落为暗的或毛玻璃状，并有起伏的边缘，从边缘移出的生长物不发育。另一种特殊菌落，根状生长，在洋菜表面上广泛扩展。生长物呈现不规则地纠缠，在不同的菌株中，它们的根状多以顺时针弯曲或呈逆时针弯曲。目前为止，未见蜡样芽孢杆菌用于制备治疗血栓疾病的药物中相关报道，也未见由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶用于制备治疗血栓疾病的药物中相关报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供蜡样芽孢杆菌在制备治疗血栓疾病药物中的用途，本发明的另一技术方案是提供一种用于治疗血栓疾病的溶栓酶，具体地说是一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，在本发明中，发明人将其命名为蜡激酶，英文名Cerekinase，CK。
本发明供了蜡样芽孢杆菌用于制备治疗血栓疾病药物中的用途以及一种由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶用于制备治疗血栓疾病药物中的用途。
本发明提供的由蜡样芽孢杆菌所产生的溶纤维蛋白酶，即蜡激酶(Cerekinase，CK)，有如下HPLC指纹图谱特征：
HPLC检测条件：
色谱柱：Waters Proein-PakTM 60 7.8×300mm
流动相：0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)
流速：1ml/min
检测波长：220nm
蜡激酶在7～9min之间出峰。
所述蜡激酶是由以下方法制备得到：
a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的蜡样芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培养后作为发酵用种子液；
b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到本发明蜡激酶。
其中，所述液态发酵为：
种子液按照5％～20％ v/v(以培养基的体积为基准)的接种量接入发酵培养基中，于30～40℃，180～220rpm培养24～72h，离心，上清液滤膜浓缩，喷雾干燥后得到本发明蜡激酶成品。
液态发酵培养基(g/L)为：C源5～35，N源5～45，Na2HPO4·12H2O 0.5～3，NaH2PO4·2H2O 0.5～4，CaCl2 0.05～1，MgSO4·7H2O 0.05～1.5，pH7.5±1.0，121℃灭菌20min。
其中，C源(蔗糖)可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替，N源(大豆蛋白胨)可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、动物)、豆浆等代替。
所述喷雾干燥，添加20％～40％(W/V)的硬脂酸美、β-环状糊精、明胶、大豆分离蛋白、糊精中的一种或几种辅料。
所述固态发酵为：
将豆渣喷洒营养液(重量配比为每1000g豆渣喷洒营养液20～120ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％ v/w(以培养基的重量为基准)的接种量接入培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％，培养12～56h，干燥后得到本发明蜡激酶成品。
其中，固态发酵营养液组分(g/L)：甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl2 0.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，pH7.5±1.0。
本发明还提供了蜡激酶的制备方法：
a、种子液制备
本发明使用的菌种是由具有溶栓能力的发酵性食品中分离得到，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并且予以保藏，保藏编号为M204092。
工作种子批菌种启开后，营养琼脂(NA)培养基平板培养，保存于NA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后，(即在培养好的NA试管斜面上勾取少量培养物涂片，革兰氏染色后显微镜下观察，凡镜下形态一致，无杂菌污染的种子为合格种子。生产能力检查是通过实验室水平的发酵来检测菌株的生产能力(即每毫升发酵液的酶活)，凡生产能力大于1000IU/ml即为合格种子。)作为生产用种子，种子于30～40℃，180～220rpm，NB培养基中培养8～24h作为一级种子；然后按5～10％的接种量接种于NB(营养肉汤)培养基中，于30～40℃，180～220rpm培养8～24h可作为二级种子，也可作为发酵用种子液。
b、发酵
所述发酵可以是液态发酵或固态发酵。
本发明所述培养基为：
营养肉汤(NB)培养基，供摇床培养用；营养琼脂(NA)培养基供制备平板和斜面用，含0.5％琼脂的营养肉汤(NB)培养基供短期保存菌种用。
NB培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉浸膏5、氯化钠5，pH7.2±0.2，121℃/20min
NA培养基(g/L)：蛋白胨10、牛肉浸膏5、氯化钠5、琼脂13，pH7.1±0.1，121℃/20min。
液态发酵
液态发酵培养基配方为(g/L)：
C源(蔗糖)5～35，N源(大豆蛋白胨)5～45，Na2HPO4·12H2O 0.5～3，NaH2PO4·2H2O0.5～4，CaCl2 0.05～1，MgSO4·7H2O 0.05～1.5，pH7.5±1.0，121℃灭菌20min。
其中，C源可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替。N源可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、动物)、豆浆等代替。
将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入发酵培养基中。发酵培养基于30～40℃，180～220rpm培养24～72h。离心除去菌体，上清液采用截流分子量8000Da的滤膜浓缩，填加辅料，喷雾干燥后得到本发明溶栓酶成品。
填加辅料主要是为了满足喷雾干燥的需要，辅料主要为硬脂酸美、β-环状糊精、明胶、大豆分离蛋白、糊精中的一种或几种，用量为20％～40％(W/V)。
发酵过程中对氧气的需求量极大，因此需要充分供养(提高通气量、加快搅拌速度)。其中通氧量、温度及培养基组分是关键，过低和过高都会严重影响蜡激酶产量。
固态发酵
固态发酵营养液组分(g/L)：甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl2 0.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，pH7.5±1.0。
新鲜豆渣喷洒营养液(重量配比为每1000g豆渣喷洒营养液20～120ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入混有营养液的培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％，培养12～56h，干燥后得到本发明蜡激酶。期间注意通氧(空气流通)保持湿度和温度。发酵过程中的温度、湿度和营养液均为关键因素，过低和过高都会严重影响蜡激酶产量。
本发明蜡激酶(Cerekinase，CK)是由富含纳豆激酶的食用纳豆中分离、纯化得到一株蜡样芽孢杆菌所产生的一种溶纤维蛋白酶，因此命名为蜡激酶。实验显示该酶在pH6.0～12.0的条件下稳定，低于pH5.0则不稳定。56℃以下温度保温30min其酶活基本保持不变。等电聚焦显示其pI为8.6±0.3。该酶与NK一样可以水解纤维蛋白原，且都是由芽孢杆菌属的菌产生，理化性质相似。但是纳豆激酶在胃内pH较低条件下是不稳定的，口服后疗效较低。【Mitsugu FUJITA，Kyomgsu HONG，Yae ITO et al.Transport of nattokinaseacross the rat intestinal tract.Biol Pharm Bull，1995，18(9)：1194～1196.】指出在小鼠的十二指肠中注入纳豆激酶后在血液检测到纳豆激酶及其与纤维蛋白分解物的复合物，表明纳豆激酶可以由消化道吸收到血液中起溶栓作用。而本发明提供的蜡激酶用5％NaHCO3配制后，用于制备治疗血栓疾病的药物，口服疗效显著，克服了纳豆激酶在胃内pH较低条件下的不稳定性，因此认为本发明制备的蜡激酶可能属于纳豆激酶类产品，但又与现有的纳豆激酶不同，为治疗血栓疾病提供了一种新的临床用药选择。当然，本发明提供的蜡激酶由于分子量小也可通过注射或其它方式给药。
小鼠灌胃急性毒性实验表明LD50大于6.0g/kg。大鼠颈动脉血栓形成试验表明5％NaHCO3配制的蜡激酶具有较明显的抗血栓形成作用，而且呈现一定的量效趋势，有效剂量范围较宽，4～100mg/kg均有抗血栓作用；同时，蜡样芽孢杆菌的单一菌株也表现出一定的延长大鼠颈动脉血栓形成时间。
附图说明
图1为实施例2制备的蜡激酶的HPLC谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为吸收值；
图2为实施例3制备的蜡激酶的HPLC谱图，横坐标为保留时间，纵坐标为吸收值。
以下通过具体实施方式进一步说明本发明的有益效果，但不应理解为是对本发明的限制，凡是基于本发明的技术基本思想所做的其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术方案均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1种子液的制备
工作种子批菌种启开后，划NA培养基平板2～3块，培养后挑取平板中典型集落8～10个，分别培养后保存于NA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后作为生产用种子。
由检查合格的菌株斜面中勾取一环培养物于20ml NB培养基中，37℃，200rpm培养20h(作为一级种子)，然后按5％的接种量接种于400ml NB培养基中37℃，180～220rpm培养18h作为发酵用种子液。
实施例2液态发酵制备溶栓酶
发酵培养基组成为(g/L)：蔗糖5g/L，大豆蛋白胨12g/L，Na2HPO4·12H2O 0.50g/L，NaH2PO4·2H2O 2g/L，CaCl2 0.08g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH7.5±1.0，121℃灭菌20min。蔗糖可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替。大豆蛋白胨可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨(植物、动物)、豆浆等代替。
将制备好的种子液250ml按照12％的接种量接入1000ml发酵培养基中。发酵培养基于37℃，180rpm培养50h。4000rpm离心30min除去菌体，上清液采用截流分子量8000Da的滤膜浓缩到原体积的1/10，添加辅料硬脂酸美和明胶，使溶液固形物含量达20％，140℃喷雾干燥得到本发明溶栓酶成品。
蜡激酶的纯化：
将发酵液于5000rpm条件下离心20min，收集上清液。上清液加入硫酸铵((NH4)2SO4)上样于用20mM PB-1.5M(NH4)2SO4 pH7.0平衡完毕的Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow疏水柱。用750mM PB进行洗脱，去除杂蛋白，再用20mM PB进行洗脱，收集洗脱液，冻干后得精制品。
HPLC检测：
将上述冻干前的洗脱液或精制品(用20mM PB配制成1mg/ml的溶液)用于HPLC检测。
HPLC检测条件：色谱仪：Waters 600+996；色谱柱：Waters Protein-PakTM 60 7.8×300mm；流动相：0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)；流速：1ml/min；检测波长：220nm。
蜡激酶在7～9min之间出峰，详见图1。
发酵液或收集的洗脱液干燥即得本发明蜡激酶成品。
实施例3固态发酵制备溶栓酶
营养液(g/L)：甘油100g/L，蛋白胨150g/L，牛肉膏80g/L，Na2HPO4·12H2O 18g/L，NaH2PO4·2H2O 15g/L，CaCl2 10g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，pH7.5±1.0。
取新鲜豆渣1000g，喷洒营养液100ml后，于100℃蒸煮30min，冷却；将制备好的种子液按照20％的接种量接入发酵培养基中。于40℃，湿度≥80％，培养40h后，干燥得到蜡激酶成品。
蜡激酶的纯化：
将蜡激酶成品用10倍体积的生理盐水浸提，浸提液超声处理20min，过滤，收集上清液。上清液配制成终浓度含20mM PB(pH8.0)的溶液。用20mM pH8.0的PB缓冲溶液平衡DEAE SepharoseTM Fast Flow柱，平衡完毕后上样。收集穿透DEAE SepharoseTM FastFlow柱的溶液。调穿透溶液pH值至6.5，上样于用20mM pH8.0的PB缓冲溶液平衡完毕的CM SepharoseTM Fast Flow柱。用200mM PB缓冲溶液洗脱出，收集洗脱液，加入固体硫酸铵((NH4)2SO4)至该溶液浓度为1.5mol/L。将该溶液上样于用20mM PB-1.5M(NH4)2SO4 pH7.0平衡完毕的Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow疏水柱。用750mM PB进行洗脱，去除杂蛋白，再用20mM PB进行洗脱，收集洗脱液，冻干后得精制品。
HPLC检测：
将上述冻干前的洗脱液或精制品(用20mM PB配制成1mg/ml的溶液)用于HPLC检测。
HPLC检测条件：色谱仪：Agilent 1100 series；色谱柱：Waters Protein-PakTM 60 7.8×300mm；流动相：0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)；流速：1ml/min；检测波长：220nm。
蜡激酶在7～9min之间出峰。详见图2。
固态发酵培养基(发酵完成后)或收集的洗脱液干燥即得本发明蜡激酶成品。
以下通过蜡激酶冻干粉抗大鼠颈动脉血栓形成作用研究，进一步说明本发明的有益效果。
试验药物：
蜡激酶冻干粉：
原料药，批号20040617，土色粉末，溶于水，由成都地奥制药集团有限公司微生物组陈军提供。
配制方法：以5％NaHCO3配制成20mg/ml的溶液作为母液，然后以5％NaHCO3按等比稀释配制成0.8mg/ml供大鼠灌胃用；
剂量设置：低、中、高剂量分别取4、20、100mg/kg：
剂量设置依据：初步以临床病人每天最大3.0g，即3000mg/60kg＝50mg/kg：转换成大鼠等效剂量为9.26mg/kg，取其2倍量的整数即20mg/kg作为大鼠药效的中剂量。为便于摸索有效剂量范围，将高中低剂量范围取大一些，组间倍数为5。
配制依据：资料显示NK类药物在pH6.0～12.0稳定，pH低于5.0则不稳定。一般在消化道内胃的pH为0.9～1.5，小肠为6.0～6.8，在结肠为6.5～7.5，因而用一般助溶剂配制后直接灌胃NK药物肯定不稳定易分解。通过预试验说明用5％NaHCO3直接配制蜡激酶室温放置4天很稳定。
肠溶阿斯匹林片：
石家庄制药集团欧意药业有限公司产品，批号040401：以蒸馏水配成8mg/ml的药液供大鼠灌胃用；
剂量设置依据：80～300mg，一日1次；成人按60kg人计算，为1.33～5mg/kg/天，转换成大鼠为8～30mg/Kg/天；本次试验大鼠剂量依据上述剂量及以往试验经验，设定为40mg/Kg/天；
葡激酶：
白色冻干粉，5mg/支，批号20040301，溶于水，由地奥公司基因组吴洽庆提供。每支以蒸馏水配成0.3mg/ml的药液供大鼠灌胃用；
剂量设置依据：临床成人一次性15mg，15mg/60kg＝0.25mg/kg，转换成大鼠等效剂量为1.35～1.5mg/kg，本次试验取1.5mg/kg：
试验动物：SD大鼠，84只，体重250～320g，雄性，购于河南医科大学动物中心；
试验仪器：BT87-3型实验性体内血栓形成测定仪，包头医学院心血管研究室研制；
试验方法：
84只大鼠，按体重随机分为七组，每组各12只，均为雄性。每天按0.5ml/100g体重灌胃给予试验药物蜡激酶冻干粉、阳性药物阿斯匹林、对照组给予5％NaHCO3，连续给予七天；阳性药葡激酶于第七天静脉注射。
灌胃末次给药后1.0小时、静脉给药后15分钟按文献资料方法分离颈总动脉，用直流电持续刺激(2mA、7min)后，大鼠颈总动脉内膜损伤逐渐形成血栓，当血流阻断后仪器自动报警，并记录血栓形成时间。
试验结果：
1、给药一周各组大鼠体重变化如下(详见表1)：
                            表1
  序号   组别   动物数   给药前   给药后7天
  ABCDEFG   阴性对照组阳性对照组(阿司匹林)阳性对照组(葡激酶)蜡激酶低剂量蜡激酶中剂量蜡激酶高剂量蜡样芽孢杆菌菌株   12121212121212   293±20296±15293±22298±18296±19291±23295±16   307±21316±20316±21315±20316±21311±23328±20
结果显示药前各组大鼠体重无明显差异，给药七天后各组大鼠体重均呈现稳定地增长，也无明显差异。给药期间各组大鼠饮食饮水正常，活动自如，也无别的明显毒性。说明5％NaHCO3配制的蜡激酶药物大鼠灌胃给药七天无明显毒性。
2、血栓形成时间(秒)比较如下(详见表2)：
                                   表2
组别 阴性对照 阿司匹林 葡激酶   蜡激酶低剂量   蜡激酶中剂量   蜡激酶高剂量   蜡样芽孢杆菌菌株
  例数均值标准值P值   12943164   81379**2850.0049   101224*1960.0132   111237*2750.0446   111287*3270.0181   101309**2190.006   91198*2340.0289
结果显示蜡激酶冻干粉低、中、高剂量各组与阴性对照组相比均能明显地延长大鼠颈动脉血栓形成时间(P＜0.05或P＜0.01)，各剂量组间虽无明显量效关系，但呈现出一定的量效趋势，而且各剂量组与阳性药阿斯匹林相比无明显差异。
蜡样芽孢杆菌菌株的单一菌株也表现出一定的延长大鼠颈动脉血栓形成时间(P＜0.05)。
总之，本发明的菌株本身或蜡激酶为治疗血栓疾病提供了一种新的用药选择。

Claims (10)

1、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的蜡样芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)在制备治疗血栓疾病药物中的用途。
2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：蜡样芽孢杆菌所产生的蜡激酶在制备治疗血栓疾病药物中的用途。
3、根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述蜡激酶的HPLC图谱如图1所示，由1个特征峰组成，
其中色谱条件为：
色谱柱：Waters Protein-PakTM 607.8×300mm
流动相：0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)
流速：1ml/min
检测波长：220nm
蜡激酶的保留时间在7～9min之间出峰。
4、一种蜡激酶，其特征在于：它的HPLC图谱如图1所示，由1个特征峰组成，
其中色谱条件为：
色谱柱：Waters Protein-PakTM 607.8×300mm
流动相：0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)
流速：1ml/min
检测波长：220nm
蜡激酶的保留时间在7～9min之间出峰。
5、根据权利要求4所述的蜡激酶，其特征在于：所述蜡激酶是由以下方法制备：
a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的蜡样芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培养后作为发酵用种子液；
b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到本发明蜡激酶。
6、一种制备权利要求4所述的蜡激酶的方法，包括：
a、中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO：M204092的蜡样芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus cereus Diao 1502)，培养后作为发酵用种子液；
b、利用a步骤种子液经液态发酵或固态发酵得到本发明蜡激酶。
7、根据权利要求6所述的制备蜡激酶的方法，其特征在于：所述液态发酵为：
种子液按照5％～20％v/v的接种量接入发酵培养基中，于30～40℃，180～220rpm培养24～72h，离心，上清液滤膜浓缩，干燥后得到本发明蜡激酶成品。
8、根据权利要求7所述的制备蜡激酶的方法，其特征在于：所述液态发酵培养基为：C源5～35g/L，N源5～45g/L，Na2HPO4·12H2O 0.5～3g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～4g/L，CaCl2 0.05～1g/L，MgSO4·7H2O 0.05～1.5g/L，pH 7.5±1.0；所述C源为蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉或蜜糖，N源为：动物蛋白胨、玉米浆、酵母膏、牛肉膏、植物或豆浆。
9、根据权利要求6所述的制备蜡激酶的方法，其特征在于：所述固态发酵为：按重量配比每1000g豆渣喷洒固态发酵营养液20～120ml，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％v/w的接种量接入培养基中，于30～45℃，湿度≥80％，培养12～56h，干燥后得到本发明蜡激酶成品。
10、根据权利要求9所述的制备蜡激酶的方法，其特征在于：固态发酵营养液组分：甘油50～300g/L，蛋白胨50～300g/L，牛肉膏50～100g/L，Na2HPO4·12H2O 5～20g/L，NaH2PO4·2H2O 5～20g/L，CaCl2 0.5～10g/L，MgSO4·7H2O 0.5～10g/L，pH 7.5±1.0。
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