CN101768580B - 新型溶纤维蛋白酶、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型溶纤维蛋白酶(亦称溶血纤维蛋白酶)及其制备方法与用途。本溶纤维蛋白酶经实验证明具有分解纤维蛋白(fibrin)及纤维蛋白原(fibrinogen)的能力，但不会活化溶血纤维蛋白酶原(plasminogen)。由于本新型酶不具备活化溶血纤维蛋白酶原的能力，使本发明的物质在应用时(如中风后处理)可避免发生不可预测的出血现象。

Description

新型溶纤维蛋白酶、其制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种新型溶纤维蛋白酶、其制备方法及用途。

背景技术

当血管受损时，通过凝血作用于伤口处形成“血液凝块”，以作为暂时性的屏障，阻止血液自伤口流出，并抵抗血管内压力而使伤口得以复原。血液凝块主要是由称为“纤维蛋白(fibrin)”的初级蛋白所构成，纤维蛋白是由其前体“纤维蛋白原(fibrinogen)”在凝血酶(thrombin)作用下转变成的(Voet和Voet，1990)。在健康的人体中，血液凝块的稳定性，包括血块收缩性(blood clot retraction)及溶纤性(fibrinolyticproperties)等，受到血液凝块形成过程中所具有的结构性、生物性、生理性及化学性特征的影响(Weisel，2007)。

在生理平衡的环境下，血液凝块最终会被溶纤维蛋白酶(plasmin)分解，以避免在血管中形成栓塞(thrombosis)。若血液凝块未正常分解，将会阻碍血液运送养分到各组织而造成疾病，例如心脏血管疾病、高血压等(Haines和Bussey，1995)。

目前用于治疗血栓相关疾病的药物包括抗凝血剂、抗血小板凝集剂及血栓溶解剂(thrombolytic agent)。血栓溶解剂依其作用机制又可以分为下述二种类型：第I型-经活化溶纤维蛋白酶原(plasminogen)，促使溶纤维蛋白酶原转变成溶纤维蛋白酶而达到溶解纤维蛋白的效果，如：组织型溶纤维蛋白酶原活化剂(tissue-type plasminogen activator，t-PA)(Collen和Lijnen等人，2004)、尿素激酶(urokinase)(Duffy，2002)、链激酶(streptokinase)等；第II型-可直接溶解纤维蛋白，如：人类溶纤维蛋白酶、蚯蚓激酶(lumbrokinase)(Banerijee等人，2004；Park等人，1998)等。许多血栓溶解剂萃取自动物，如蛇(Girón等人，2008；Leonardi等人，2007)及蚯蚓(Ge等人，2005；Park等人，1998)；细菌，如枯草杆菌(Bacilli subtilis)(Omura等人，2005；Ko等人，2004；Choi等人，2004)及链霉菌(Streptomyces megasporus)(Chitte和Dey2000)；真菌(Kim和Kim，1999；Choi和Sa，2000；Kim和Kim，2001；Lee等人，2005；Hattori等人，2005；Park等人，2007；Li等人，2007)；以及海藻类(Matsubara等人，1999)等。

如上所述，第I型血栓溶解剂是经溶纤维蛋白酶原转换成溶纤维蛋白酶而达到血栓溶解的效果，因此在治疗血栓引起的疾病时有产生过量溶纤维蛋白酶而导致出血的危险。再者，属于第II型血栓溶解剂的蚯蚓激酶实质上为一种混合物，其除了具有可直接溶解纤维蛋白的成分外，还具有活化纤维蛋白酶原的成分，因此也有产生过量溶纤维蛋白酶的危险。因此，临床上需要一种可直接溶解纤维蛋白、不会活化溶纤维蛋白酶原，以致不会因产生过量溶纤维蛋白酶而导致出血的血栓溶解剂。

另一方面，无论在亚洲或西方国家，菇蕈常被作为食材或药材(Sullivan等人，2006)。已知菇蕈含有多种活性蛋白或胜肽，这些活性蛋白或胜肽在人体中的效用目前正被积极研究(Ng，2004)。再者，裂褶菌(Schizophyllum commune)为一种传统的药用菇蕈。目前已知从裂褶菌的液态发酵培养液中分离出一种长链状大分子多糖分子，即裂褶多糖(schizophyllan)(Rau等人，1992)。裂褶多糖具有免疫调节作用，可以预防肿瘤及对抗病毒(Kumari等人，2008)。但至今尚无人从裂褶菌等菇蕈中分离出具有血纤维蛋白溶解作用，且不具有刺激溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶作用的蛋白酶。

发明内容

本发明提供一种新型溶纤维蛋白酶，其特征为：

(a)N末端序列为：ASYNGXSS；其中，A代表丙氨酸残基，S代表丝氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，G代表甘氨酸残基及X代表未测出；

(b)具有如图4A所示的LC/MSMS图谱；及

(c)分子量为20-23kD。

本发明的溶纤维蛋白酶来自液态培养的菇蕈，优选为来自相同方式培养的可食用或药用的菇蕈，更优选为来自裂褶菌。

根据本发明，来自裂褶菌的溶纤维蛋白酶为单体(monomer)，分子量为20-23kD。

本发明的溶纤维蛋白酶具有分解纤维蛋白的能力，也具有分解纤维蛋白原的能力，但不会活化溶纤维蛋白酶原。因此，本发明的溶纤维蛋白酶可用于治疗血栓相关性疾病，且可避免现有血栓溶解剂因刺激溶纤维蛋白酶原，导致过量溶纤维蛋白酶产生所造成的出血副作用。

本发明亦提供一种制备溶纤维蛋白酶的方法，其包括：

(a)将可产生溶纤维蛋白酶的菇蕈进行液体培养；

(b)将步骤(a)得到的培养液中的菇蕈菌丝体滤除；

(c)将步骤(b)得到的培养液以尺寸排阻型分离膜分级(fractionation)，得到第一滤液及第二滤液，其中第一滤液包含可通过分离膜的相对较小的分子，而第二滤液包含不可通过分离膜的相对较大的分子；

(d)将步骤(c)得到的第一滤液中的蛋白质沉淀，得到粗蛋白质；及

(e)将步骤(d)得到的粗蛋白质纯化，得到溶纤维蛋白酶。

本方法使用的菇蕈优选为以相同培养方式培养的可食用或药用的菇蕈，更优选为裂褶菌。

用于本发明方法的步骤(c)的尺寸排阻型分离膜可为本领域现有的尺寸排阻型分离膜，优选为陶瓷滤膜优选，更优选为扫流式陶瓷滤膜(cross-flow ceramic filtration membrane)。分离膜的尺寸(分子量)排阻限值通常为10至150kDa，优选为50至120kDa，更优选为100kDa。

在进行步骤(d)之前，视需要，可将从步骤(c)得到的第一滤液进一步浓缩。

在本发明的方法的步骤(d)中，第一滤液通过添加硫酸铵等本领域现有的方法进行蛋白质沉淀，而得到粗蛋白质。

在进行步骤(e)之前，可将步骤(d)中得到的粗蛋白质通过透析除去盐类。

在本发明的方法的步骤(e)中，可将粗蛋白质依序进行疏水交互作用层析(hydrophobic interaction chromatopgraphy)、阴离子交换层析(anion-exchange chromatography)及胶体过滤层析(gel filtrationchromatopgraphy)，且在每次层析后检测各提出份的溶纤维蛋白酶活性，并选取及合并显示溶纤维蛋白酶活性的提出份。

相比于现有的加热萃取法或有机溶剂萃取法，本发明的方法未加热，亦未使用有机溶剂，而是采用过滤及层析等方法，因此更能保持溶纤维蛋白酶的活性。

本发明亦提供一种组成物，其包含新型溶纤维蛋白酶及药学上可接受的载体。

本发明还提供新型溶纤维蛋白酶或包含新型溶纤维蛋白酶的药物组合物在制备治疗血栓相关疾病的药物中的用途。

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容了解本发明的其他优点与功效。

附图说明

图1A显示由裂褶菌培养液的粗蛋白质进行疏水交互作用层析(使用phenyl SepharoseTM High Performance凝胶)而得的提出份(fractions)No.4～27以纤维蛋白琼脂盘检测的结果，其中，“+”代表阳性对照组(10μg人类溶纤维蛋白酶)；图1B显示上述粗蛋白质进行疏水交互作用层析而得的各提出份的蛋白质浓度(△)及蛋白酶活性(◆)；图1C显示上述疏水交互作用层析后依据纤维蛋白琼脂盘检测结果所收集得的蛋白酶溶液(A)进行阴离子交换层析(使用MonoQ5/50GL管柱)而得的各提出份的蛋白质浓度(△)及蛋白酶活性(◆)；图1D显示上述阴离子交换层析后依据纤维蛋白琼脂盘检测结果所收集得的蛋白酶溶液(B)进行胶体过滤层析(使用Superdex 75 10/300GL管柱)而得的各提出份的蛋白质浓度(△)及蛋白酶活性(◆)。

图2A显示本发明的溶纤维蛋白酶的样本，以及标准品：核糖核酸酶A(ribonuclease A)(13.5kDa)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)(29kDa)、脱铁蛋白(apoferritin)(44.3kDa)及牛血清蛋白(67kDa)进行胶体过滤层析的结果。图2B显示制备本发明溶纤维蛋白酶的各个阶段的产物的SDS-PEGE分析图谱，其中，M：蛋白质分子量标记；1：澄清培养液；2：第一滤液；3：蛋白酶溶液(A)；4：蛋白酶溶液(B)；5：蛋白酶溶液(C)(A280nm：40mAU)；及6：蛋白酶溶液(C)(A280nm：80mAU)。

图3A显示蛋白酶溶液(C)进行SDS-PEGE的结果，图3B为其经糖蛋白染色后结果的对照图。其中，M：蛋白质分子量标记；1：糖蛋白电泳阳性反应组；2：糖蛋白电泳阴性反应组；3：蛋白酶溶液(A)；4：经纯化的本发明蛋白酶。

图4A为MS/MS图谱，图4B为以MS/MS图谱进行资料库分析比对的结果。

图5显示人类溶纤维蛋白酶及本发明溶纤维蛋白酶在人工纤维蛋白琼脂盘上形成溶解圈的情形。A、B、C、D分别为0.2、0.5、0.8、1μg的人类溶纤维蛋白酶处理组；E、F、G、H分别为0.1、0.25、0.5、1μg本法分离纯化的蛋白酶。

图6显示以SDS-PEGE测定本发明溶纤维蛋白酶的纤维蛋白原分解作用的结果。其中，M：蛋白质分子量标记；1～7：分别为反应第0、0.5、2、6、12、22及30小时的样本；α、β、γ分别表示纤维蛋白原的α链、β链及γ链。

图7显示本发明溶纤维蛋白酶对人类溶纤维蛋白酶原的活化作用的测定结果。其中，Scfz+PLG：本发明溶纤维蛋白酶及溶纤维蛋白酶原；UK+PLG：现有人类尿素激酶及溶纤维蛋白酶原；Scfz：本发明溶纤维蛋白酶；PL：现有人类溶纤维蛋白酶；PLG：溶纤维蛋白酶原；20μg UK；20μg的人类尿素激酶。

具体实施方式

一、溶纤维蛋白酶的分离纯化

(1)菌种的液体培养及分离

将裂褶菌接种于YM培养液(Acumedia)(YM培养基包含0.3％(w/w)酵母菌萃取物、0.3％麦芽抽出物、0.5％蛋白胨(peptone)、1.0％葡萄糖)中，在25～30℃及持续供气下进行搅拌培养4～10天。于4℃下以8.23×1000g离心30分钟以移除菌丝体，将培养液再依序以11μm、2.5μm滤纸及0.45μm滤膜(Millipore)过滤，以除去所有的菌丝体，得到澄清培养液。

(2)培养液的分级(fractionation)

由于菇蕈培养液中含有复杂成分，必须先经过”划分”的步骤，才可进一步进行蛋白质分离步骤。因此，以扫流式陶瓷滤膜(cross-flowceramic filtration membrane)(迈先生物技术公司)过滤所得澄清培养液。陶瓷过滤膜的分子量排阻限值视目标蛋白质的分子量而定；在本发明中为10至150kDa，优选为50至120kDa，最优选为100kDa。操作时，以循环辅助澄清培养液在系统内循环，以适当的速度流经膜面，并且在膜面造成扫流作用，以缓和易堵塞物质在膜面上的堆积。当循环液流经膜面时，小分子物质与水分子会穿透分离膜而成为第一滤液；而无法穿透膜面的大分子物质等，则留在循环液，称为第二滤液。第一滤液为含有小分子物质(包括目标溶纤维蛋白酶)的滤出液，其通常为经稀释的液体；而第二滤液为含有高浓度大分子物质的循环液。

如果需要，第一滤液可再以第二分离膜(例如，分子量排阻限值为3kDa的陶瓷滤膜)进行过滤，由此除去部分水而将第一滤液浓缩，并除去过小的分子。

(3)蛋白质的分离

在经浓缩的第一滤液中添加硫酸铵至浓度达80％以进行蛋白质沉淀，其中，硫酸铵需先经烘干并磨成粉末，以避免局部浓度过高而造成沉淀不完全或沉淀不均。接着以HITACHI 05PR-22远心分离机以3000rpm进行离心，除去上层液体取得沉淀物。以二次水(secondarywater)溶解沉淀物，使用透析膜(Spectrum spectra/por dialysis membraneMWCO：6-8,000)并以20mM Tris溶液作为透析液进行透析，以除去盐类并将其溶液置换为20mM Tris溶液，接着以0.22μm滤膜滤除杂质后而得粗蛋白质。

(4)溶纤维蛋白酶的分离及纯化

(4)-1.将粗蛋白质在

purifier 10(Amersham PharmaciaBiotech)上进行疏水交互作用层析(使用phenyl SepharoseTM highperformance gel column，由GE Healthcare Life Science出品)，其中层析管柱以含有1M(NH4)2SO4的50mM磷酸溶液(pH 7)平衡，洗脱溶液为含有梯度(100-0％)1M(NH4)2SO4的50mM磷酸溶液，洗脱溶液流速设定为1ml/分钟。测定各提出份(fraction)的蛋白质浓度及蛋白酶活性(测定方法详述于下文)，其结果示于图1B中。用纤维蛋白琼脂盘检测各提出份的溶纤维蛋白酶活性，结果如图1A所示。选取具有高溶纤维蛋白酶活性的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(A)。由图1A及图1B可知，提出份25至28号展现高溶纤维蛋白酶活性，亦展现对应程度的高蛋白酶活性，这表示提出份的溶纤维蛋白酶活性与其蛋白酶活性成正比。因此，在以下步骤中，通过测定提出份的蛋白酶活性来判定其溶纤维蛋白酶活性并据此进行收集。

(4)-2.将蛋白酶溶液(A)进行强阴离子交换层析(使用MonoQ 5/50GL管柱，由GE Healthcare Life Science出品)，其中洗脱溶液为含有梯度(0-30％)1M NaCl的20mM Tris，洗脱溶液流速设定为1m1/分钟，洗脱时间为28分钟。测定各提出份的蛋白质浓度及蛋白酶活性，其结果示于图1C中。选取具有高蛋白酶活性(表示具有高溶纤维蛋白酶活性)的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(B)。

(4)-3.将蛋白酶溶液(B)进行胶体过滤层析(使用Superdex 7510/300GL管柱，由GE Healthcare Life Science出品)，其中洗脱溶液为含1.5M NaCl的50mM磷酸盐缓冲溶液。测定各提出份的蛋白质浓度及蛋白酶活性，其结果示于图1D中。选取具有高蛋白酶活性(表示具有高溶纤维蛋白酶活性)的提出份并加以合并，得到蛋白酶溶液(C)。

另一选择为将粗蛋白质依序以阴离子交换层析(使用，例如，DEAE-sepharoseTM Fast Flow凝胶管柱，流动相为20mM Tris溶液，洗脱液为含梯度1M NaCl的20mM Tris溶液)、疏水交互作用层析(使用，例如，phenyl SepharoseTM管柱)、强阴离子交换层析(使用，例如，MonoQ 5/50GL管柱)及胶体过滤层析(使用，例如，Superdex 7510/300GL管柱)按照上述方式进行纯化。

在上述步骤(4)-1至(4)-3中，溶纤维蛋白酶活性、蛋白质浓度及蛋白酶活性的测定方法说明如下。

(5)蛋白酶溶液测定

溶纤维蛋白酶活性的测定

溶纤维蛋白酶活性通常可通过使用纤维蛋白琼脂盘，按照Astrup及Mullertz(1952)所教示的方法检测。即，将1.5％琼脂、0.2％人类纤维蛋白原与10U人类凝血酶混合，于室温静置15分钟以使人类纤维蛋白原转变成人类纤维蛋白，然后以空气吸取器于琼脂盘上小心地打出小洞。将20μl的各待测样本及作为阳性对照组的市售人类溶纤维蛋白酶(human plasmin)分别加入洞中，并让其于20℃作用24小时。观察纤维蛋白琼脂盘上是否形成肉眼可见的溶解圈(clear zone)，并与阳性对照组比较。溶解圈的直径与其溶纤活性成正比。纤维蛋白琼脂盘检测法的优点为操作较容易，结果可以肉眼直接观察，但具有检测需要的时间较长(通常大于5小时，甚至数天)且溶解圈的大小会随着时间经过人工纤维蛋白自然分解，导致不易判定，而有误差较大的缺点。

溶纤维蛋白酶的活性亦可通过使用溶纤维蛋白酶专一性底物(plasmin-specific substrate)，即人工合成的H-Val-Leu-Lys-pNA(Sigma S2251)来检验。当待测样本具有溶纤维蛋白酶活性时，会分解底物而释放pNA，pNA可于波长405nm来检测。待测样本的溶纤维蛋白酶活性与测得的吸光值呈正相关性。

蛋白质浓度的测定

使用Bio-Rad Protein Assay kit(Bio-Rad)测定各样本在波长595nm的吸光度(单位：mAU)。以牛血清蛋白(bovine serum albumin，Sigma)标准品为基准做出标准曲线，而换算得各样本的蛋白质浓度。

蛋白酶活性的测定

各样本的蛋白酶活性通过检测其与偶氮酪蛋白(azocasein，Sigma)反应后所产生的可溶于酸性溶液的物质的量来判定。将各待测样本100μl加入100μl的0.5％(W/V)偶氮酪蛋白溶液中，在37℃下反应15分钟，再加入350μl的10％(W/V)冰三氯乙酸(trichloroacetic acid)。混合均匀后静置5分钟，于4℃以12×1000g离心15分钟，取上层澄清液500μl并与等量的0.5N NaOH混合。检测混合物于波长440nm的吸光度。将同样的样本经高温煮沸，使蛋白酶活性丧失，以作为对照组。以上述同样方法测定对照组于波长440nm的吸光度。在37℃反应15分钟的条件下，偶氮酪蛋白分解所产生的溶于酸性溶液的物质于440nm的吸光度与对照组相比增加0.001时，即定义酶活性为1单位(U)。

(6)结果

依照上述方法测定各阶段产物-澄清培养液、第一滤液、以及蛋白酶溶液(A)至(C)的各个样本中的蛋白质浓度及蛋白酶活性，并由此计算出各阶段产物的总蛋白质含量(mg)、总蛋白酶活性、蛋白酶单位活性(U/mg)、纯化倍率(purification fold)及回收率(yield)。将其结果总结于表1中，其中蛋白酶单位活性、纯化倍率及回收率通过下述公式计算而得：

蛋白酶单位活性(U/mg)＝总蛋白酶活性(U)/总蛋白质含量(mg)

纯化倍率＝各阶段产物的蛋白酶单位活性/澄清培养液的蛋白酶单位活性

回收率＝各阶段产物的总蛋白质含量/澄清培养液的总蛋白质含量

表1、

二、新型溶纤维蛋白酶的结构及活性特征的鉴定

(1)分子量的测定

将得到的含溶纤维蛋白酶的蛋白酶溶液(C)的样本与标准品核糖核酸酶A(ribonuclease A)(13.5kDa)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase)(29kDa)、脱铁蛋白(apoferritin)(44.3kDa)及牛血清蛋白(67kDa)一起进行胶体过滤层析(使用Superdex 75 10/300GL管柱，GEHealthcare)，其结果示于图2A。由图2A可知溶纤维蛋白酶在流出体积(flowthrough volumn)达到大约14ml时被洗脱，由此可以判定溶纤维蛋白酶在非变性态(undenaturated state)的分子量为约21.33kDa。

另外，将澄清培养液、第一滤液以及蛋白酶溶液(A)至(C)进行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(10％)gelelectrophoresis)，并用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色，以测定溶纤维蛋白酶在变性态(经SDS变性而成为单体状态)的分子量。结果如图2B所示。在图2B中，M：蛋白质分子量标记(marker)；1：澄清培养液；2：第一滤液；3：蛋白酶溶液(A)；4：蛋白酶溶液(B)；5：蛋白酶溶液(C)(波长280nm：吸光值40mAU)及6：蛋白酶溶液(C)(波长280nm：吸光值80mAU)。由图2B可知溶纤维蛋白酶在还原态的分子量为约21.33kDa，与在非变性态的分子量相同。由此可以判定溶纤维蛋白酶为单体(monomer)，而非多体(polymer)。

(2)糖蛋白染色检验

将蛋白酶溶液(C)进行SDS-PAGE并以糖蛋白染色试剂盒(GelCode Glycoprotein Staining Kit)染色。结果未观察到阳性反应，由此证明所得到的溶纤维蛋白酶未与糖基结合，不属于糖蛋白。结果示于图3。

(3)蛋白质鉴定

将上述经SDS-PAGE分离纯化的溶纤维蛋白酶以MicromassQ-TOF ESI/MS/MS质谱仪分析，并将分析结果与MASCOT资料库比对，以鉴定是否有近似本发明蛋白质的数据。质谱仪分析图谱与比对结果如图4所示。根据MASCOT资料库的比对结果显示，本发明蛋白质中仅有一个MS/MS片段SGGGGGGGLGSGGSIR与已知片段：编号gi|81175178的角蛋白，即第I型细胞骨架蛋白-9(Keratin，type Icytoskeletal 9(Cytokeratin-9)(CK-9)(Keratin-9)(K9))的一个片段相似；但本发明蛋白质的其他部分则未比对到相似片段(误差分数皆＞50)，证实以MS/MS图谱分析结果而言，本发明蛋白质为一新型蛋白质。

(4)N末端定序

将经上述SDS-PAGE分离纯化的溶纤维蛋白酶转印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，再依埃德曼(Edman)降解法的原理进行蛋白质N末端序列分析(仪器为Applied Biosystems，Procise 494)，得到N末端胺基酸序列为ASYNGXSS(丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-未测出-丝氨酸-丝氨酸)。

将所得N末端序列以BLASTBLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与已知的溶纤维蛋白酶进行比对，但并未比对到类似的N末端序列；由此可知此溶纤维蛋白酶与现有的溶纤维蛋白酶在N末端序列不相同，确实为新型的溶纤维蛋白酶。

(5)纤维蛋白溶解活性(fibrinolytic activity)的检测

参照溶纤维蛋白酶活性的测定，结果如图5所示。A、B、C、D分别为0.2、0.5、0.8、1μg的市售人类溶纤维蛋白酶(human plasmin)处理组；E、F、G、H分别为0.1、0.25、0.5、1μg本发明的蛋白酶。并测定溶解圈的大小以估计蛋白酶活性，结果如表2所示。

表2、

由表2的结果可知，由本发明的方法所分离纯化的溶纤维蛋白酶的活性约为市售人类溶血纤维蛋白酶的活性的两倍。

(6)纤维蛋白原(fibrinogen)降解活性的检测

在225μl的1％纤维蛋白原溶液中加入25μl的0.05mg/ml的本发明裂褶菌溶纤维蛋白酶溶液，于37℃下反应，于反应期间，每隔一段时间采样进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图6所示，标号1～7分别为反应后第0、0.5、2、6、12、22及30小时所采集的样本。结果显示，反应后22小时，纤维蛋白原的α链、β链及γ链均消失，证实本发明的裂褶菌溶纤维蛋白酶具有直接降解纤维蛋白原的活性，因此，可阻断纤维蛋白的形成。

(7)溶纤维蛋白酶原(plasminogen)活化的检测

在0.1M磷酸钠缓冲溶液(Sodium phosphate buffer)中，混合40μl的浓度10mM的S2251底物，并视实验条件加入0.1UN的人类溶纤维蛋白酶原(PLG)及1μg的人类溶纤维蛋白酶(PL)、人类尿素激酶(UK)、本发明溶纤维蛋白酶(Scfz)，并调整总体积为1ml进行反应，在反应期间第0、5、10、20、40、60、90、120、180、240、480分钟测量波长405nm的吸光值，结果如图7所示。其中，以现有尿素激酶(urokinase，UK)及以现有人类溶纤维蛋白酶(PL)作为对照组。

由图7可知，若于反应中仅加入尿素激酶(UK)、或溶血纤维酶原(PLG)、或本发明溶纤维蛋白酶(Scfz)，皆不产生吸光值的改变，显示对S2251底物不反应。

然而，当UK与PLG同时存在于反应中，可将PLG转化成有效的溶纤维蛋白酶，而与S2251底物作用，进而产生吸光值的明显变化。反观本发明溶纤维蛋白酶(Scfz)与PLG混合后，对S2251底物仍不产生反应，证实本发明溶纤维蛋白酶不具有活化溶纤维蛋白酶原的能力。

由上述检测结果可知，本发明的溶纤维蛋白酶具有分解纤维蛋白的能力，亦具有分解纤维蛋白原的能力，但不会活化溶纤维蛋白酶原。因此，本发明的溶纤维蛋白酶可用于治疗血栓相关性疾病，且可避免现有血栓溶解剂因促进溶纤维蛋白酶原转变为溶纤维蛋白酶而造成的出血等副作用。

上述实施例仅例示性说明本发明的组成物与制备方法，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围如权利要求所载。

Claims (17)

1.一种由裂褶菌分离而得的溶纤维蛋白酶，其特征为：

(a)N末端序列为：ASYNGXSS；其中，A代表丙氨酸残基，S代表丝氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，G代表甘氨酸残基及X代表未测出；

(b)如图4A所示的LC/MSMS图谱；及

(c)分子量为20-23kD，

其中，所述的溶纤维蛋白酶利用下述方法制备，包括：

(a)将可产生溶纤维蛋白酶的裂褶菌进行液体培养；

(b)将步骤(a)得到的培养液中的裂褶菌菌丝体滤除；

(c)将步骤(b)得到的培养液以尺寸排阻型分离膜划分，得到第一滤液及第二滤液，其中第一滤液包含可通过分离膜的相对较小的分子，而第二滤液包含不可通过分离膜的相对较大的分子；

(d)使步骤(c)得到的第一滤液中的蛋白质沉淀，得到粗蛋白质；及

(e)将步骤(d)得到的粗蛋白质纯化，得到溶纤维蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的溶纤维蛋白酶，其为单体。

3.根据权利要求1或2项所述的溶纤维蛋白酶，其具有分解纤维蛋白及纤维蛋白原的能力，但不会活化溶纤维蛋白酶原。

4.根据权利要求1或2项所述的溶纤维蛋白酶，其可用于制备用于治疗血栓相关疾病的药物。

5.一种制备如根据权利要求1所述的溶纤维蛋白酶的方法，其包括：

(a)将可产生溶纤维蛋白酶的裂褶菌进行液体培养；

(b)将步骤(a)得到的培养液中的裂褶菌菌丝体滤除；

(c)将步骤(b)得到的培养液以尺寸排阻型分离膜划分，得到第一滤液及第二滤液，其中第一滤液包含可通过分离膜的相对较小的分子，而第二滤液包含不可通过分离膜的相对较大的分子；

(d)使步骤(c)得到的第一滤液中的蛋白质沉淀，得到粗蛋白质；及

(e)将步骤(d)得到的粗蛋白质纯化，得到溶纤维蛋白酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(c)的尺寸排阻型分离膜为陶瓷滤膜。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，尺寸排阻分离膜的尺寸排阻限值为10至150kDa。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，在进行步骤(d)之前，将从步骤(c)得到的第一滤液进一步浓缩。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(d)中，粗蛋白质通过在第一滤液中添加硫酸铵，使得第一滤液中的蛋白质沉淀而得到。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在进行步骤(e)之前，通过透析除去粗蛋白质中的盐类。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(e)中，将步骤(d)得到的粗蛋白质依序进行疏水交互作用层析、阴离子交换层析及胶体过滤层析，且于每次层析后检测各提出份的溶纤维蛋白酶活性，选取及合并显示高溶纤维蛋白酶活性的提出份。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，疏水交互作用层析通过使用phenyl Sepharose^TM High Performance凝胶管柱而进行。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，阴离子交换层析通过使用MonoQ 5/50GL管柱而进行。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，胶体过滤层析通过使用Superdex 75 10/300GL管柱而进行。

15.一种具有溶纤作用的药物组成物，其包含根据权利要求1所述的溶纤维蛋白酶及药学上可接受的载体。

16.一种根据权利要求15所述的药物组成物，其用于制备用于治疗血栓相关疾病的药物。

17.一种根据权利要求1所述的溶纤维蛋白酶在制备用于治疗血栓相关疾病的药物中的用途。

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