CN104830821A - 一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法。本发明用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；粗酶液的获得：在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代，扩培后离心所得上清液；高纯度胶原酶的柱层析制备由两步柱层析步骤即可得到高纯度胶原酶。本发明为工业化大规模生产胶原酶提供了重要的技术参数，弥补了国内在柱层析纯化微生物胶原酶方面的技术空白。

Description

一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的蛋白质纯化方法，具体涉及纯化一种蜡样芽孢杆菌胶原酶的方法。
背景技术
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地降解难以被普通蛋白酶降解的天然胶原纤维。根据胶原酶的来源可分为动物胶原酶和微生物胶原酶。其中，微生物胶原酶以底物范围广、酶切位点多、生产成本低等优点被广泛应用。如细胞培养时去除细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、降解富含胶原的肉食品(如牛肉)中过多的胶原进而使肉制品鲜嫩可口、临床治疗一些胶原沉积性疾病等。
在微生物胶原酶中，研究背景最清楚、实际应用最广泛的是梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)所产的胶原酶G(Collagenase G，缩写为Col G),目前常见的梭状芽孢杆菌胶原酶产品中的主要成分都是CoL G的结构类似物(Eckhard,U.,,E.,Nüss,D.,Brandstetter,H.NatStructMol Biol.,18(2011)1109-1114.)。目前常见的胶原酶产品大多为直接由梭状芽孢杆菌培养物冻干而得的粗品，粗品成分复杂、纯度较低，其中的褐色素甚至毒素的存在使之无法应用于要求较高的医疗及科研领域，且粗品中含有的半胱氨酸水解酶会逐渐地水解胶原酶而使胶原酶活力丧失。但通过柱层析方式获得的高纯度胶原酶的方法被严格保密无法获得。
目前，我国在微生物胶原酶的应用方面还处于起步阶段，在我国关于高活性微生物胶原酶纯化方法的专利未有报道，国内市场依赖大量高价进口的胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。本发明涉及的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E(CGMCC NO.8614)分泌的一种胶原酶已申请专利(申请公布号为CN 104017761A)，但是获得高纯度蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus R75E胶原酶的分离纯化方法还未有相关专利。基于胶原酶广泛的市场需求，以及胶原酶分离纯化技术的空白，从蜡样芽孢杆菌R75E的液体培养物中分离制备高纯度的胶原酶具有很高的理论意义与市场应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，而提供一种从蜡样芽胞杆菌R75E(保藏编号CGMCC NO.8614)的液体培养物中分离纯化胶原酶的方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法，用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；
所述粗酶液的获得过程为：(1)在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代；(2)挑取单克隆接种至LB肉汤液体培养基中，在37℃条件下振荡培养12h；(3)按照1％的接种量在37℃条件下扩大培养24h；(4)培养结束后在4℃条件下12000rpm/min离心20min，所得上清液即为R75E的粗酶液；
所述高纯度胶原酶的柱层析制备过程，按照如下步骤进行：
(1)盐析：按照硫酸铵在0℃条件下的饱和度表，根据粗酶液的体积数向粗酶液中边搅拌边缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度达到40％(以1升粗酶液为例，需要加入226克硫酸铵)，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；弃沉淀，保留上清液；继续向上清液中加入硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度达到60％(按照硫酸铵在0℃条件下的饱和度表，以1升上清液为例，需要加入120克硫酸铵粉末)，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；保留沉淀，弃上清溶液；将所得沉淀用缓冲液B2溶解。
所述缓冲液B2即PBS缓冲液，配制方法为在800mL去离子水中加入0.2mol/L的Na2HPO481mL、0.2mol/L的NaH2PO419mL，用去离子水定容至1L；
(2)疏水相互作用层析，过柱条件为：①用10mL超纯水以1mL/min的流速洗蛋白纯化柱(HiTrapTMButylFF疏水层析柱)；②用10mL缓冲液B3以1mL/min的流速平衡蛋白纯化柱；③向步骤(1)所得的B2溶解的蛋白溶液中加入硫酸铵粉末，调节其电导率值至170mS/cm，即获得待HiTrapTMButylFF疏水层析分离所需的样品液；以1mL/min的流速将样品液上样至蛋白纯化柱(HiTrapTMButylFF疏水层析柱)；④全部上样结束后，继续用20mL缓冲液B3以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱(HiTrapTMButylFF疏水层析柱)；⑤利用缓冲液B2对结合在蛋白纯化柱(HiTrapTMButylFF疏水层析柱)上的胶原酶进行线性梯度洗脱，逐渐降低洗脱液中的硫酸铵浓度，使溶液的电导率在40min内由170mS/cm逐渐降至0mS/cm，通过蛋白纯化仪上的紫外检测仪监测蛋白的紫外吸收峰情况，并收集洗脱下来的蛋白；⑥SDS-PAGE电泳检测洗脱下来的蛋白，跟踪目标蛋白；⑦将含有胶原酶的洗脱液合并并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL,并将该溶液标记为S1。
所述缓冲液B3其配制方法为：在800mL PBS缓冲液中加入硫酸铵粉末132.14g，用去离子水定容至1L；
(3)分子筛层析过柱条件为：①以0.5mL/min的流速用超纯水润洗SuperderTM200分子筛纯化柱，总润洗水的体积为120mL；②用120mL缓冲液B2以0.5mL/min的流速平衡SuperderTM200分子筛纯化柱；③将S1样品液以0.5mL/min的流速上样至SuperderTM 200分子筛纯化柱；④以1mL为体积单位收集蛋白洗脱液，并进行SDS-PAGE电泳检测，跟踪目标蛋白；⑤合并包含胶原酶蛋白的洗脱液并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL，即获得高纯度胶原酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供一种从蜡样芽胞杆菌培养液中纯化胶原酶的方法，该方法步骤简单，由两步柱层析步骤即可得到高纯度胶原酶，为工业化大规模生产胶原酶提供了重要的技术参数，弥补了国内在柱层析纯化微生物胶原酶方面的技术空白。
2、本发明得到的胶原酶纯化方法可有效地去除微生物发酵过程中分泌产生的色素、杂蛋白等干扰成分，所得的高纯度胶原酶进一步可用于纯度要求较高的医学实验或蛋白质结构研究。
3、本发明得到的胶原酶经检测其活力比目前市场上广泛应用的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶的粗品高10.98倍，对于解决国内高纯度胶原酶长期依赖国外产品的困境有显著的应用前景。
本发明使用了系列层析步骤，可适用于高纯度微生物胶原酶产品的制备。
附图说明
图1为本发明蜡样芽孢杆菌R75E(CGMCC NO.8614)粗酶液经硫酸铵沉淀后的酶谱分析分析结果，图中：M为DNA标准；1为蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液经饱和度为40％-60％的硫酸铵沉淀所得的蛋白组分；
图2为本发明蜡样芽孢杆菌R75E(CGMCC NO.8614)粗酶液经硫酸铵沉淀后的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为DNA标准；1为蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液经饱和度为40％-60％的硫酸铵沉淀所得的蛋白组分；
图3为经40％-60％硫酸铵沉淀后的蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶蛋白样品经疏水层析分离后的蛋白洗脱紫外监测图，其中横轴为洗脱液体积(单位为mL)，左侧纵轴为过柱溶液的紫外吸收检测值(OD280nm),右侧纵轴为电导率值，从80mL处开始洗脱，图中：1和2均为蛋白洗脱峰；
图4为疏水层析所得1和2蛋白洗脱峰的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为蛋白标准；泳道1和2为蛋白洗脱峰1对应的蛋白组分；泳道3-5均为蛋白洗脱峰2对应的蛋白组分，其中洗脱峰2中含有目标蛋白；
图5为疏水层析所得洗脱峰2纯化产物超滤浓缩前后的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为蛋白标准；1为疏水层析所得洗脱峰2纯化产物超滤前的蛋白组分；2为疏水层析所得洗脱峰2纯化产物超滤后的蛋白组分；
图6为经疏水层析洗脱后的蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶蛋白样品经分子筛(SuperderTM 200)层析分离后的蛋白洗脱紫外监测图，其中横轴为洗脱液体积(单位为mL)，纵轴为洗脱液的紫外吸收检测值(OD280nm),图中：1-8均为分子筛(SuperderTM 200)的洗脱峰；
图7为分子筛(SuperderTM 200)层析后含有目标胶原酶蛋白的洗脱液的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为蛋白标准；泳道1为过柱前的蛋白样品；泳道2-4均为3号峰对应的蛋白；泳道5-7均为4号峰对应的蛋白，其中4号峰中含有目标蛋白；
图8为分子筛(SuperderTM 200)层析所得纯化产物超滤后的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：M为蛋白标准；1为分子筛(SuperderTM 200)层析纯化产物超滤后所得的胶原酶纯品。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的实施例中所用的实验材料及溶液的配置如下：
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)R75E保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏日期为2013年12月20日，保藏编号为CGMCC No.8614。
梭状芽孢杆菌(Clostridiumhistolycum)所产的Ⅰ型胶原酶标准品购自Sigma公司，货号：c0130。
LB液体培养基的配制方法：在90mL去离子水中加入胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl 1g，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至100mL，于121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min后冷却待用。
LB固体培养平板的配制方法：在90mL去离子水中加入胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl1g、琼脂1g，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至100mL，于121℃高压蒸汽锅中灭菌20min后倒平板，冷却后备用。
HiTrapTMButylFF疏水层析柱、SuperderTM200分子筛层析柱均购自GE Healthcare公司；15mL超滤管(最小截留分子量为10kDa)购自Millipore公司，货号：R9EN00493。
缓冲液B1：用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白样品的制备。其组成为250mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.8)，内含重量体积百分比0.5％(W/V)溴酚兰，体积百分比50％(V/V)甘油，重量体积百分比10％(W/V)十二烷基硫酸钠，体积百分比5％(V/V)β-巯基乙醇组成。
洗脱液：50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，内含2.5％(V/V)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、5mmol/L CaCl2。
漂洗液：50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，内含5mmol/L CaCl2。
孵育液：50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，内含0.02％十二烷基聚乙二醇醚(Brij)、200mmol/L NaCl、5mmol/L CaCl2。
缓冲液B2:即PBS缓冲液，用于疏水层析中目标蛋白的洗脱及分子筛层析中上样缓冲液。配制方法为在800mL去离子水中加入0.2mol/L的Na2HPO481mL、0.2mol/L的NaH2PO419mL，用去离子水定容至1L。溶液的pH值为7.4。
缓冲液B3：作为疏水层析中的上样缓冲液。其配制方法为在800mLPBS缓冲液中加入硫酸铵粉末132.14g，用去离子水定容至1L。
缓冲液B4：用于胶原蛋白底物的配制。其组成为50mmoL/LTris-HCl，pH值为7.4，内含0.36mmoL/L CaCl2。
考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501.0g溶于450mL甲醇与冰醋酸100mL的混合溶液后用蒸馏水定容至1L，用于SDS-PAGE凝胶的染色。
脱色液：100mL无水甲醇和100mL冰乙酸混合后用蒸馏水定容至1L，用于SDS-PAGE凝胶的脱色。
考马斯亮蓝G-250溶液：称取考马斯亮蓝G-2500.1g溶于50mL 90％的乙醇中，加入100mL85％的磷酸后用蒸馏水定容至1L，用于蛋白质浓度分析。
实施例1:ColR75E粗酶液的获得
(1)用无菌牙签蘸取冻存保藏的蜡样芽胞杆菌R75E菌液，于LB平板上划线复苏培养3代，培养条件为37℃、12h。
(2)从步骤(1)中所得第3代LB固体培养平板上挑取单菌落接种至10mL LB液体培养基中培养，培养条件为37℃，150rpm/min，12h。培养结束后，按照1％的接种量将10mL菌液接种至1L LB液体培养基中进行扩大培养24h，培养条件为37℃，150rpm/min。扩大培养后得到的菌液于4℃条件下12000rpm/min离心15min，离心后留取上清液，将上清液用孔径为0.45μm的过滤膜进行除菌后即为ColR75E粗酶液。
实施例2:ColR75E的纯化
如果不另外指示，以下所有的步骤均在4℃条件下进行。
(1)硫酸铵沉淀
此步骤的目的是除去部分杂蛋白并对目标蛋白进行浓缩，具体过程为：①在实施例1获得的粗酶液中溶解硫酸铵至40％饱和度，即每升粗酶液中溶解226g硫酸铵，于0℃条件下沉淀蛋白8h后于12000rpm/min条件下离心20min，留取上清液；②继续向上清液中加入硫酸铵粉末至60％饱和度，即每升上清液中再溶解120g硫酸铵，于0℃条件下沉淀蛋白8h后于12000rpm/min条件下离心20min，弃去上清液留取蛋白沉淀；③用缓冲液B2溶解蛋白沉淀：每升上清液所得蛋白沉淀用15mL缓冲液B2溶解后即为硫酸铵盐析产物。
(2)硫酸铵沉淀产物的电泳分析
①制胶：分别配制含有终浓度为0.1％(W/V)的胶原蛋白及不含胶原蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，厚度为1mm。其中分离胶和浓缩胶的浓度指的是丙烯酰胺的浓度。用于电泳检测的凝胶配制组分如下表1所示。
表1含有胶原蛋白的凝胶配制组分
成分 分离胶 浓缩胶
1.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH 8.8 3.7mL 0mL
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH 6.8 0mL 1.2mL
30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液 5mL 0.8mL
10％(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液 150μL 50μL
10％(W/V)过硫酸铵(AP)水溶液 150μL 25μL
N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED) 15μL 5μL
1％(W/V)Ⅰ型胶原蛋白水溶液 1.5mL 0mL
超纯水 4.5mL 2.72mL
总体积 15mL 4.8mL
不含胶原蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制方法为：将表1中1％(W/V)Ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积替换为超纯水的体积，其余组分不变。
②酶谱分析：将步骤(1)中所得的蛋白溶液按照体积比为5:1的比例与缓冲液B1混合，室温下静置10min。吸取蛋白Marker 5μL(Fermentas公司，货号：00096206)及15μL与缓冲液B1混合的蛋白样品，分别上样至上述凝胶中。在110V的条件下电泳2h，待溴酚蓝前沿接近分离胶底部时，关闭电源停止电泳。电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，每次45min，随后用漂洗液在室温条件下漂洗2次，每次20min，最后将凝胶用孵育液在37℃下孵育12h。孵育结束后将凝胶先经考马斯亮蓝染色液静置染色1h，再经脱色液室温振荡脱色2h后即可观察结果，拍照。
本实施例中步骤(1)所制备的蛋白溶液的酶谱分析结果如图1所示，蛋白溶液所在的泳道中观察到较明显的胶原降解条带(分子量约为110kDa)。表明本实施例中步骤(1)所制备的蛋白溶液有胶原酶活性。
③电泳检测：将步骤(1)中所得的蛋白溶液按照体积比为5:1的比例与缓冲液B1混合，100℃加热5min。按照酶谱分析的电泳方法进行电泳检测，电泳结束后将凝胶先经考马斯亮蓝染色液静置染色1h，再经脱色液室温振荡脱色2h后即可观察结果。
本实施例中步骤(1)所制备的蛋白溶液的电泳分析结果如图2所示，蛋白溶液所在的泳道中观察到与预期分子量为110kDa的目标胶原酶蛋白相仿的蛋白条带，且与酶谱分析中的胶原降解条带完全对应。表明本实施例中步骤(1)所制备的蛋白溶液中含有目标胶原酶组分，且蛋白溶液中还存在多种杂蛋白。
(3)疏水层析
①柱平衡：打开AKTA purifier 10蛋白层析系统，安装HiTrapTMButylFF疏水层析柱。用10mL超纯水以1mL/min的流速洗柱，再用10mL缓冲液B3以1mL/min的流速平衡柱。
②上样：向步骤(1)所得硫酸铵盐析产物中补加硫酸铵粉末，将该溶液的电导率值调节至160mS/cm。将该溶液以1mL/min的流速上样到HiTrapTMButylFF疏水层析柱，弃去穿出液。然后利用缓冲液B3洗涤(含1mol/L硫酸铵)结合了目标蛋白的层析柱固定相，至紫外吸收值至基线附近后洗涤结束。
③目标蛋白的洗脱：为了将胶原酶蛋白从固定相上移除并与其他蛋白分离，通过逐渐降低硫酸铵浓度的梯度洗脱，使电导率在40min内由170mS/cm降至0mS/cm，同时收集洗脱液。洗脱过程的紫外吸收(OD280nm)监测过程如图3所示，从80mL处开始洗脱，随着电导率值的逐渐降低，共出现两个紫外吸收峰。将峰1对应的第122mL、第123mL洗脱液和峰2对应的第126-128mL洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，检测方法同本实施例步骤(2)所述。SDS-PAGE电泳检测结果如图4所示，目标胶原酶蛋白在峰2对应的洗脱液中，而且相对于硫酸铵沉淀后的蛋白溶液，其杂蛋白的种类和浓度均减少了70％以上。
④超滤浓缩：将包含胶原酶蛋白的洗脱液合并为3mL，用15mL的超滤管(最小截留分子量为10kDa，Millipore公司，货号：R9EN00493)进行超滤，超滤条件为4000rpm/min离心6min，浓缩后的蛋白溶液体积为1mL，记为S1。超滤浓缩前后样品的SDS-PAGE电泳检测结果如图5所示，可见胶原酶蛋白浓度显著提高，且杂蛋白的分子量都分布在70kDa以下，非常适合利用SuperderTM 200分子筛层析柱进一步纯化。
(4)分子筛层析
①柱平衡：在AKTA purifier 10蛋白层析系统中，安装SuperderTM200分子筛层析柱。用120mL超纯水以0.5mL/min的流速洗柱子，再用120mL缓冲液B2以0.5mL/min的流速平衡柱子。
②上样：将本实施例步骤(3)所得纯化产物以0.5mL/min的流速上样至SuperderTM 200分子筛层析柱。从将含有胶原酶蛋白的混合物上样到柱上开始，以1mL为单位收集穿出液。
③目标蛋白的分离洗脱：用缓冲液B2以0.5mL/min的流速冲洗层析柱并同时继续收集穿出液，直至紫外吸收峰到达基线附近且不再变化。洗脱过程的紫外吸收(OD280nm)监测值如图6所示：从上样开始，共得到8个紫外吸收峰。将每个峰对应的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图7所示，显示目标胶原酶蛋白在4号峰对应的穿出液中，且成功与其它杂蛋白分离，这说明目标蛋白ColR75E被成功分离纯化。
④超滤浓缩：将包含胶原酶蛋白的洗脱液合并为5mL，用15mL的超滤管(最小截留分子量为10kDa，Millipore公司，货号：R9EN00493)进行超滤，超滤条件为4000rpm/min离心6min，超滤浓缩后得到体积为1.5mL的高纯度胶原酶(ColR75E)。胶原酶纯品SDS-PAGE电泳检测结果如图8所示，可见胶原酶蛋白浓度显著提高，且无杂蛋白存在。
实施例3:ColR75E的活性分析
(1)胶原酶的活力测定
采用通用的Mandl胶原酶活力测定方法(Mandl,I.,Maclennan,J.,D.,Howes,E.,L.,J.Clin.Invest.,12(1953)1323-1329.)测定纯化过程中各步骤所得胶原酶的比活力。该方法中将1个活力单位(U)定义为：每毫升胶原酶与牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白在37℃、pH值为7.4的条件下反应，在5小时内每生成1μmoL游离氨基酸即对应1个活力单位(1U)。胶原酶比活力由每毫升胶原酶的酶活力单位总数(U)与每毫升胶原酶蛋白质量(mg)的比值(U/mg)表示。活力测定的具体步骤为：
a、L-甘氨酸标准曲线的绘制
①用缓冲液B4配制浓度分别为0μmoL/mL、0.2μmoL/mL、0.4μmoL/mL、0.6μmoL/mL、0.8μmoL/mL、1.0μmoL/mL、1.2μmoL/mL的L-甘氨酸标准溶液；
②分别取200μL上述不同浓度的L-甘氨酸标准溶液，依次加入200μL乙酸钠-乙酸缓冲(乙酸钠浓度为2moL/L,pH5.4)及加入400μL 2％(W/V)茚三酮溶液(内含7.1mmoL/L SnCl2)；
③沸水浴加热5min后迅速置于冰水中冷却，于570nm处测其吸光度；
④以吸光度值为Y轴纵坐标(单位为1)，L-甘氨酸浓度为X轴横坐标(单位为mmoL/L),绘制游离氨基酸标准曲线(曲线方程为Y＝1.1221X，R2＝0.999)
b、将由缓冲液B4配制的牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白溶液在37℃恒温水浴中预热5min；
c、按下表2所示的程序操作：
表2胶原酶的活力测定体系
d、蛋白标准曲线的绘制
①用去离子水配制浓度分别为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)标准溶液；
②分别取40μL上述不同浓度的牛血清白蛋白标准溶液，依次加入200μL考马斯亮蓝G-250溶液；
③室温放置5min，于595nm处测其吸光度；
④以吸光度值为Y轴纵坐标(单位为1)，牛血清白蛋白的浓度为X轴横坐标(单位为μg/mL),绘制蛋白标准曲线(曲线方程为Y＝0.0043X+0.0106，R2＝0.994)
e、蛋白纯化各步骤所得蛋白含量的测定
取蛋白纯化过程中各步骤所得的酶液40μL，依次加入200μL考马斯亮蓝G-250溶液，室温放置5min，于595nm处测其吸光度。
f、计算
根据步骤a中所得的游离氨基酸标准曲线(曲线方程为Y＝1.1221X，R2＝0.999)、步骤c中操作9所测得对照组及反应组于570nm处测得的吸光度值(反应组数值在计算时取平均值，误差不超过3％)、步骤d中所得的蛋白标准曲线(曲线方程为Y＝0.0043X+0.0106，R2＝0.994)及步骤e中所得的酶液于595nm处测得的吸光度值，根据如下公式F1计算胶原酶的比活力：
E＝(D×0.2/0.005)/P  …………………(F1)
式中：E为胶原酶的比活力，单位为：U/mg；
D为反应组游离氨基酸浓度(单位为μmoL/L)及对照组游离氨基酸浓度(单位为μmoL/L)的差值；
0.2指胶原酶的胶原蛋白反应终止后的体积：5μL酶液+95μL Ⅰ型胶原蛋白溶液+100μL HCl溶液，共计0.2mL；
0.005指胶原酶的胶原蛋白的反应体系中胶原酶的体积0.005mL；
P为胶原酶的蛋白浓度(单位为mg/mL)。
采用上述方法测定实施例2中各步骤所得的胶原酶活力，最终计算得到如表3所示的胶原酶(ColR75E)纯化表。最终得到的蛋白纯品的比活力为2486.69U/mg，相对于粗酶液纯化了18.4倍。综上，说明通过实施例2的纯化步骤成功得到了高纯度的天然胶原酶(ColR75E)。
表3 胶原酶(ColR75E)纯化表
(2)纯化所得胶原酶纯品与商品化的微生物胶原酶产品的活力比较
本发明对商品化的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶标准品(Sigma公司，货号：c0130)的比活力进行测定，测定方法如本实施例步骤(1)所述，测得商品化的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶的比活力为125U/mg，此结果也与其产品说明书所示数据相符。因此，本发明所得到的胶原酶纯品较商品化的梭状芽孢杆菌所产的Ⅰ型胶原酶的比活力高19.89倍。
综上表明，本发明中通过纯化得到的胶原酶具有高纯度、高比活的特点，本实施例提供的纯化方法具有很强的科研理论意义与实际应用价值。

Claims (1)

1.一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的纯化方法，其特征是，用于从蜡样芽胞杆菌R75E的液体培养物中纯化胶原酶，包括粗酶液的获得和高纯度胶原酶的柱层析制备过程；
所述粗酶液的获得过程为：(1)在LB肉汤固体培养基上划线复苏蜡样芽胞杆菌R75E三代；(2)挑取单克隆接种至LB肉汤液体培养基中，在37℃条件下振荡培养12h；(3)按照1％的接种量在37℃条件下扩大培养24h；(4)培养结束后在4℃条件下12000rpm/min离心20min，所得上清液即为R75E的粗酶液；
所述高纯度胶原酶的柱层析制备过程，按照如下步骤进行：
(1)盐析：按照硫酸铵在0℃条件下的饱和度表，根据粗酶液的体积数向粗酶液中边搅拌边缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度达到40％，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；弃沉淀，保留上清液；继续向上清液中加入硫酸铵粉末至硫酸铵饱和度达到60％，在冰浴条件下持续搅拌12小时后，4℃冷冻离心，离心条件为12000rpm/min，20min；保留沉淀，弃上清溶液；将所得沉淀用缓冲液B2溶解；
所述缓冲液B2即PBS缓冲液，配制方法为在800mL去离子水中加入0.2mol/L的Na2HPO4 81mL、0.2mol/L的NaH2PO4 19mL，用去离子水定容至1L；
(2)疏水相互作用层析，过柱条件为：①用10mL超纯水以1mL/min的流速洗蛋白纯化柱；②用10mL缓冲液B3以1mL/min的流速平衡蛋白纯化柱；③向步骤(1)所得的B2溶解的蛋白溶液中加入硫酸铵粉末，调节其电导率值至170mS/cm，即获得待蛋白纯化柱疏水层析分离所需的样品液；以1mL/min的流速将样品液上样至蛋白纯化柱；④全部上样结束后，继续用20mL缓冲液B3以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱；⑤利用缓冲液B2对结合在蛋白纯化柱上的胶原酶进行线性梯度洗脱，逐渐降低洗脱液中的硫酸铵浓度，使溶液的电导率在40min内由170mS/cm逐渐降至0mS/cm，通过蛋白纯化仪上的紫外检测仪监测蛋白的紫外吸收峰情况，并收集洗脱下来的蛋白；⑥SDS-PAGE电泳检测洗脱下来的蛋白，跟踪目标蛋白；⑦将含有胶原酶的洗脱液合并，并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL,并将该溶液标记为S1；
所述蛋白纯化柱为HiTrapTMButylFF疏水层析柱；
所述缓冲液B3其配制方法为：在800mL PBS缓冲液中加入硫酸铵粉末132.14g，用去离子水定容至1L；
(3)分子筛层析过柱条件为：①以0.5mL/min的流速用超纯水润洗SuperderTM200分子筛纯化柱，总润洗水的体积为120mL；②用120mL缓冲液B2以0.5mL/min的流速平衡SuperderTM200分子筛纯化柱；③将S1样品液以0.5mL/min的流速上样至SuperderTM 200分子筛纯化柱；④以1mL为体积单位收集蛋白洗脱液，并进行SDS-PAGE电泳检测，跟踪目标蛋白；⑤合并包含胶原酶蛋白的洗脱液并进行超滤浓缩，条件为4℃，4000rpm/min，6分钟，最终将胶原酶蛋白溶液浓缩至1mL，即获得高纯度胶原酶。
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