CN108285492A - 一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产透皮肽寡肽‑1融合蛋白的制备方法。步骤包括：工程菌发酵；扩张床吸附；凝胶分离；冷冻升华干燥。有益效果：本发明利用上述方法制得的透皮肽寡肽‑1融合蛋白，具有发酵液中产物浓度高(大于500mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98.37％以上)，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，属于生物工程领域。
背景技术
EGF(Epidermal Growth Factoy)中文名称为表皮生长因子，俗称寡肽-1，由53个氨基酸组成(并包括3个二硫键的多肽)。Montalcini和Cohen教授因为发现寡肽-1并分析其结构和作用机理，获1986年诺贝尔生理学及医学获奖。寡肽-1能刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生的效果，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。
最初的寡肽-1主要被应用于医学领域，对治疗烧烫伤、促进伤口愈合，修复肠胃道、肝脏及眼角膜的损伤等，功效十分显著。
其后，更广泛应用于化妆品领域，寡肽-1能够深入肌肤基底层，加速细胞的增殖分化，让衰老细胞快速角化，使已断裂、变性的胶原纤维和弹性纤维得到修复，皮肤弹性增加，皱纹逐渐平复乃至消失，同时，可使面部的色斑逐渐淡化，使表皮内角质层水分保持能力增加，让肌肤滋润焕发活力。
透皮肽有十几个氨基酸组成，可以穿透细胞膜。为进一步增加寡肽-1的透皮吸收性在其N端加透皮肽，可以大大增强肽-1的功效。
寡肽-1是极为安全的，因为它是一种人体本身就能够产生的生物因子，在年轻的时候，人体自身能够产生足够多的寡肽-1，促使表皮细胞生长，但随着年龄的减退，寡肽-1的产生量逐步下降，因此表皮细胞的更新速度就越来越慢了。正是寡肽-1为人体本身之组成部分，故没有任何毒副作用，十分安全。使用寡肽-1护肤品，相比于一些其它的抗皱方法，安全更是卓越的优点。
尽管目前已有一些寡肽-1的基因工程生产方法，但这些方法均存在着发酵液中产物浓度低，提取工艺复杂，操作成本高及收率低等缺点，至今为止，尚未有一个成熟的工业化发酵生产工艺。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种方法简单、收率高、周期短的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，步骤包括：
(1)工程菌发酵；
(2)扩张床吸附；
(3)凝胶分离；
(4)冷冻升华干燥。
优选地，所述工程菌发酵为：
从菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml；28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，得到培养液；按1-8％接种量将所述培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时，得到发酵液。
优选地，所述扩张床吸附为：
用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；
取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；
用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100-800ml的该上清液以1.5-8.5ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰；
再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-10ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，洗脱液于2-18℃条件下保存备用。
优选地，所述凝胶分离为：
用层析系统将15-30ml所述洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220-280ml。
优选地，所述冷冻升华干燥为：
将收集液加入冻干保护剂，于-35℃至-42℃下冷冻升华干燥，得白色干粉状透皮肽寡肽-1融合蛋白。
有益效果：本发明利用上述方法制得的透皮肽寡肽-1融合蛋白，具有发酵液中产物浓度高(大于500mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98.37％以上)，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
具体实施方式
实施例一：
(1)工程菌发酵：
从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入5-15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，按1-8％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时。透皮肽寡肽-1融合蛋白表达于菌种中。
(2)扩张床吸附：
用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；
取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；
用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100-800ml的该上清液以1.5-8.5ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰；
再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-10ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，洗脱液于2-18℃条件下保存备用。
(3)凝胶分离：
用层析系统将15-30ml所述洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220-280ml。
(4)冷冻升华干燥
将收集液加入冻干保护剂，于-35℃至-42℃下冷冻升华干燥，得白色干粉状透皮肽寡肽-1融合蛋白。
实施例二：
(1)工程菌发酵：
从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入10ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到100mg/ml，30℃，200rpm摇床培养10小时，按5％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在100mg/ml，30℃，200rpm摇床培养10小时，再按5％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，30℃，200rpm，PH值维持7.0，培养10小时，然后温度诱导，继续培养4小时。透皮肽寡肽-1融合蛋白表达于菌种中。
(2)扩张床吸附：
用冷冻离心机将发酵液与4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，弃上清液保留沉淀于4℃条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，900w超声处理25个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，弃上清液；取适量沉淀，用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理2遍，再用冷冻离心机将缓冲液于4℃条件下以10000rpm的速度离心20min；取沉淀用20倍裂解液溶解，10000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将200ml的该上清液以3ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将2000ml的复性液液以8ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，洗脱液于4℃条件下保存备用。
(3)凝胶分离：
用层析系统将25ml上面洗脱液以6.5ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以6.5ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为250ml。
(4)冷冻升华干燥
将收集液加入冻干保护剂，于-40℃下冷冻升华干燥，得白色干粉状透皮肽寡肽-1融合蛋白。
利用上述方法制得的透皮肽寡肽-1融合蛋白，具有发酵液中产物浓度高(大于500mg/L)，提取工艺简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1倍)，操作成本低及纯度高(98.37％以上)，可很好的实现工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。。
Claims (5)
1.一种生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：
(1)工程菌发酵；
(2)扩张床吸附；
(3)凝胶分离；
(4)冷冻升华干燥。
2.如权利要求1所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述工程菌发酵为：
从菌种管中挑取单菌落接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml；28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，得到培养液；按1-8％接种量将所述培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在50-200mg/ml，28-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，再按1-8％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，29-31℃，160-240rpm，PH值维持7.0，培养9-11小时，然后温度诱导，继续培养2-8小时，得到发酵液。
3.如权利要求2所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述扩张床吸附为：
用冷冻离心机将所述发酵液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液保留沉淀于2-4℃条件下保存备用；
取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，700-1800w超声处理10-28个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心10-30min，弃上清液；
用5倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，用高压均质机处理1-5遍，再用冷冻离心机将缓冲液于2-4℃条件下以6000-12000rpm的速度离心5-30min，弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，6000-12000rpm的速度离心30min，收集上清液，用层析系统将100-800ml的该上清液以1.5-8.5ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用20mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠20mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰；
再将洗脱峰液用复性液复性，用层析系统将1500-3500ml的复性液液以4-10ml/min速度加入source 30Q扩张床中，用15mM精氨酸缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含0.75M氯化钠15mM精氨酸缓冲液以10％比例洗脱，收集含透皮肽寡肽-1融合蛋白的洗脱峰，洗脱液于2-18℃条件下保存备用。
4.如权利要求3所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述凝胶分离为：
用层析系统将15-30ml所述洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为220-280ml。
5.如权利要求4所述的生产透皮肽寡肽-1融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述冷冻升华干燥为：
将收集液加入冻干保护剂，于-35℃至-42℃下冷冻升华干燥，得白色干粉状透皮肽寡肽-1融合蛋白。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111195354A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-26 | 广州优理氏生物科技有限公司 | 一种含SNAP25-Htt150Q融合基因纳米脂质体的面部抗皱冻干粉及其制备方法 |
| CN115154614A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-10-11 | 广西福莱明生物制药有限公司 | 一种融合因子配方组合工艺 |
-
2018
- 2018-02-02 CN CN201810104952.6A patent/CN108285492A/zh active Pending
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |