CN107459580A - 一种利用酵母菌表达含有穿膜肽的寡肽‑1（egf）创新制备工艺 - Google Patents
一种利用酵母菌表达含有穿膜肽的寡肽‑1（egf）创新制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了工业化生产含有ELP(Val‑Pro‑Gly‑Xaa‑Gly)穿膜肽和寡肽‑1(EGF)的融合蛋白的制备方法，含有它们的组合物和它们的用途，采用酵母菌通过种子培养，扩大发酵、菌体采集、破碎、裂解、分离纯化等工艺方法收集含穿膜肽的寡肽‑1融合蛋白。本发明具有方法简单、产物浓度高、操作成本低等优点，适合工业化生产。本发明的化合物和组合物可以用作医疗器械耗材、保健品和化妆品的活性成分或添加剂。
Description
发明领域
本发明涉及一种工业化生产含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的制备方法，属生物工程领域。
发明背景
穿膜肽是由小于30个氨基酸组成的具有细胞穿透功能的小肽，它能通过与细胞膜的相互交联作用而穿过细胞膜这一天然屏障。最近通过设计获得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，能够引导所承载的寡肽-1修复蛋白穿透细胞膜，经表皮渗透吸收，富含碱性氨基酸，含有较多的正电荷的肽片段，靶向导入皮肤基底层受体。该穿膜肽具有以下特性：
①具有净正电荷性和两亲性；②穿膜转运效率高；③可以导入近乎所有的细胞；④可以携带多种活性物质进入细胞；⑤可靶向穿透细胞膜，达到灭活多种病毒且不造成细胞损伤。
寡肽-1(EGF)是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活细胞，藉由刺激寡肽-1受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，对创伤、溃疡等受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖逆分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。最初的寡肽-1主要被运用于医学领域，以促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤、溃疡、促进伤口愈合、修复肠胃道、肝脏和眼角膜的损伤等，功效十分显著。现代临床早已将寡肽-1扩大应用于医疗耗材、人体保健及抗衰老的化妆品领域。
寡肽-1(即：重组人表皮生长因子)是美国生化学家Stanley Cohen博士于1962年最先在小鼠下颌腺的提取液中发现，并提出该因子有直接促进皮肤粘膜的修复和表皮细胞的生长，并能使衰老的细胞逆分化为年轻细胞，有促进胶原蛋白和弹力蛋白的合成，能促进肉芽组织再生，延缓细胞衰老、滋养女性生殖器官、淡化皱纹与色斑的作用，它是人类医学与美学史上最伟大的发现之一。Stanley Cohen博士发现的EGF生长因子于1986年获国际诺贝尔生理医学奖。寡肽-1(EGF)全球市场需求量大，产品资源十分稀缺，为了解决全球市场对寡肽-1EGF敷料的需求供给，我公司联合美国哈佛大学魏博士、山东农业大学于博士、中华生物医药研究院、广东医保药业有限公司共同研究，创新了一种用酵母菌表达含穿膜肽的寡肽-1EGF制备方法，制得高纯度融合新蛋白(PHPV蛋白)。用酵母菌表达含有穿膜肽与寡肽-1融合新蛋白(即PHPV蛋白)，PHPV蛋白不仅有穿膜肽与寡肽的独立功能，而且其交联融合后的新蛋白表面的负电荷(阴离子)C端与人乳头瘤病毒HPV颗粒上的N端正电荷(阳离子)相互络合，通过其表面所带正电荷的N端与中间的疏水区及含有肽酶的识别区位点的C端负电荷相结合，将膜转位信号与核定位信号的NLS偶联，从而阴断人乳头瘤病毒侵入宿主细胞内，再通过细胞膜的相互作用而穿透细胞膜这一天然屏障，达到破坏病毒胞膜外壳治疗HPV感染的目的。
目前世界上尚未有含穿膜肽的寡肽-1融合蛋白在酵母菌中的基因工程工业化生产方法。
发明内容
本发明涉及穿膜肽和寡肽-1的融合蛋白，穿膜肽是通过设计获得的ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽，(理论基础＝WENDE PA，ROTHBARD J B，JESSOP T C，etal.Oligocarbamate molecular transporters：Design，synthes is，and biologicalevaluation of a new class of transporters for drug delivery JAme Chem Soc，2002，124(45)：13382-13383)富含碱性氨基酸，ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽位于寡肽-1(EGF)的C-端，优选紧邻寡肽-1，也可以通过间隔序列与寡肽-1相连，含有较多的正电荷的肽片段，利用正负电荷非特异性相互作用的原理与细胞膜结合，打开皮肤细胞膜从而将目的蛋白靶向导入皮肤基底层受体。
本发明的目的是解决工业用基因工程酵母菌生产含穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合蛋白的方法。
一种工业化生产含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白的制备方法，生产步骤如下：
(1)酵母菌扩培发酵：
从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入5-15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml，22-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，按1-10％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在27-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时。含穿膜肽的寡肽-1(EGF)融合蛋白表达于菌种中。
(2)菌体收集破碎分离纯化：
用冷冻离心机将发酵液离心，弃上清液保留沉淀保存备用。取200g沉淀，用8倍量的缓冲液溶解，经超声1800W处理6个循环，每个循环20min，再用冷冻离心机以6000-12000rpm将缓冲液离心15min，弃上清液，取沉淀用裂解液溶解，，所用裂解液为20mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素所组成的缓冲液，再离心，收集上清液，用层析系统将该上清液加入扩张床中，用缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用缓冲液以7％比例洗脱，收集含穿膜肽的寡肽-1(EGF)的洗脱峰。
(3)凝胶分离纯化：
用层析系统将洗脱液加入到凝胶层析柱中，然后将精氨酸缓冲液洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，将收集液于-20℃冷冻保存。
(4)复配组合物
将含有穿膜肽和寡肽-1的冷冻原液复溶后，添加赋形剂甘露醇，稳定剂精氨酸、海藻糖，稀释剂去离子水，复配组合物。所述组合物是医疗器械组合物、保健品组合物、化妆品组合物。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例一：
(1)种子液制备：
从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入5-15ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到50-200mg/ml，22-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时，按1-10％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在27-32℃，150-250rpm摇床培养8-12小时。
(2)酵母菌发酵
在无菌条件下，将上述培养好的种子液再按30ml接种量接种到发酵培养基中；发酵培养基成分(g/L)：蛋白胨：10g、NaCl：5g、氨苄青霉素：0.1g用去离子水溶解定容，高压灭菌；发酵条件：温度30-32℃，发酵至OD600达到0.8左右加入诱导剂100mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)0.1％诱导，3-4小时后收集菌体。
(3)菌体收集破碎：
将发酵液以6000-12000rpm的速度用离心机离心20-30min，弃上清液保留沉淀。取沉淀，用磷酸缓冲液(pH8.0)冲洗1-2次，用5倍Tris-Hcl缓冲液溶解，1800w超声处理破碎，再用冷冻离心机将缓冲液在2-18℃条件下以6000-12000rpm的速度离心弃上清液，取沉淀用15-45倍裂解液溶解，所用裂解液为20mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素所组成的缓冲液，在2-18℃条件下离心30min收集上清液。
(4)含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白纯化
将上清液用层析系统以1.5-8.5ml/min速度加入source 30S扩张床中，用80mMTris缓冲液速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠80mMTris缓冲液以13％比例洗脱，收集含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白的洗脱峰。
用层析系统将15-30ml上面洗脱液以4-8ml/min的速度加到Superdex75凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以4-8ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为300-500ml，将收集液于-20℃冷冻保存。
(5)复配组合物
将含有穿膜肽和寡肽-1的冷冻原液复溶后，添加赋形剂甘露醇，稳定剂精氨酸、海藻糖，稀释剂去离子水，复配组合物。所述组合物是医疗器械组合物、保健品组合物、化妆品组合物。
实施例二：
(1)酵母菌扩培发酵：
从-70℃保存的菌种管中挑取单菌落接入10ml种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在培养基中的浓度达到100mg/ml，30℃，200rpm摇床培养10小时，按5％接种量将前面的培养液再次接入种子培养基中，同时加入氨苄青霉素，使其在100mg/ml，32℃，200rpm摇床培养10小时，再按5％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，发酵培养基成分(g/L)：蛋白胨：10g、NaCl：5g、氨苄青霉素：0.1g用去离子水溶解定容，高压灭菌；35℃，200rpm，采用Tris-Hcl缓冲液使PH值维持9.0，培养10小时，然后将发酵温度提高到40℃诱导，继续培养4小时。穿膜肽的寡肽-1(EGF)表达于菌种中。
(2)菌体收集破碎：
用冷冻离心机将发酵液与4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，弃上清液保留沉淀于4℃条件下保存备用。取适量沉淀，用10倍量Tris-Hcl缓冲液溶解，900w超声处理25个循环，每个循环35min，再用冷冻离心机将缓冲液与4℃条件下以10000rpm的速度离心30min，弃上清液，取沉淀用20倍裂解液溶解，所用裂解液为20mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素所组成的缓冲液，10000rpm的速度离心30min，收集上清液。
(3)含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白纯化
用层析系统将200ml的该上清液以3ml/min速度加入source 30S扩张床中，用80mMTris缓冲液以相同速度洗涤至波长为280nm时紫外吸收峰值为零，再用含1M氯化钠80mMTris缓冲液以7％比例洗脱，收集含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合蛋白的洗脱峰。
(4)、凝胶分离：
用层析系统将25ml上面洗脱液以6.5ml/min的速度加到Superdex75凝胶层析柱中，然后将15mM精氨酸缓冲液以6.5ml/min的速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测检测仪在波长280nm下进行检测，收集保留吸收峰，收集体积为350ml，将收集液于-20℃冷冻保存。
(5)复配组合物
将含有穿膜肽和寡肽-1的冷冻原液复溶后，添加赋形剂甘露醇，稳定剂精氨酸、海藻糖，稀释剂去离子水，复配组合物。所述组合物是医疗器械组合物、保健品组合物、化妆品组合物。
利用上述方法制得的含EGF寡肽-1，具有发酵液中产物浓度高(大于100mg/L，创新点是：改变了表达菌种、使产品作用浓度较以往提高了一倍)；优化了工艺：使工艺提取技术更简单(只需要3步层析操作，较之前工艺简化1-2倍)；操作成本更低、纯度更高(90％以上)，本发明是一个较为成熟的工业化发酵生产工艺，经济效益十分显著。
Claims (7)
1.包含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合蛋白。
优选地，ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)穿膜肽位于寡肽-1(EGF)的C-端，优选紧邻寡肽-1，也可以通过间隔序列与寡肽-1相连。
2.组合物，权利要求包含穿膜肽和寡肽-1的单一或多个组合，任选的，所述组合物还含有赋形剂、稳定剂、稀释剂；所述组合物是医疗耗材组合物、保健品组合物、化妆品组合物。
3.本发明涉及一种工业化生产含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)种子液制备
(2)酵母菌发酵
(3)菌体收集破碎
(4)含穿膜肽的寡肽-1(EGF)融合蛋白纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述的分离纯化是采用缓冲液洗涤、离子交换、凝胶层析的组合方式。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所用裂解液为20mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素所组成的缓冲液。
6.含有穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合蛋白，其特征在于其既可用于药品，医疗耗材，也可以用于化妆品和保健食品的活性成分或添加剂。
7.为了市场应用的便捷与识别，在市场应用中将含穿膜肽的寡肽-1(EGF)简称为：寡肽-1或PHPV蛋白。
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