CN107648205A - 一种促进伤口愈合的胶原肽敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医疗技术领域，一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的质量百分比如下所示：牛骨胶原低聚肽50‑70%，改性几丁聚糖溶液0.5‑5%，海参寡肽或天蚕素B 5‑20%或1‑5%，人参寡肽1‑5%，保湿剂0‑20%，余量为溶剂。本发明敷料在皮肤表面形成膜达到抗菌的功效，且附着力强，不仅可以长效抗菌，同时还可以隔离感染，是一种具有生物相容性、安全性、抗菌、促进创口愈合等优点的新型液体敷料。
Description
技术领域
本发明属于医疗制剂技术领域，具体涉及一种促进伤口愈合的胶原肽敷料的组成及其制备方法。
背景技术
创伤会对人体产生多种危害。创伤发生后，机体随之而产生的各种损伤因子可引起急性呼吸窘迫综合征；创伤还可直接损害器官或系统的形态和功能，严重创伤后，在应激、休克及感染等情况下，机体释放大量的有害介质，并在级联放大效应的作用下，造成过度炎症反应，导致组织器官损害加重和多器官功能衰竭（MODS）的发生。
外科手术可人为产生创伤，其对于机体本身就是一个应激过程。而术后如果伤口不能良好的愈合将会对机体造成极大的影响，例如伤口感染、形成瘢痕等。近年来更多的孕妇选择将剖宫产作为胎儿娩出的主要手段，但是剖宫产本身作为一种疑菌手术，是具有很多不安全因素的外科手术操作。如果感染，可能会发生切口裂开、化脓、宫腔感染等并发症，严重的甚至会出现大出血、腹膜炎和败血症，甚至危及病人生命。除此之外，皮肤的损伤或丢失将会不同程度地影响皮肤的功能，甚至造成死亡。
伤口愈合是机体维持正常解剖结构和功能的一种方式。受损组织的恢复进程不仅在各种外科操作也在生命的延续中扮演着重要角色。目前，对于伤口愈合不良的防治方法集中在伤口外用敷料和使用促进伤口愈合的药物两方面。临床实践证明，这些方法存在着很多弊端和不足，主要体现在：促进伤口愈合的外用敷料和药物成分和作用比较单一，效果不甚理想。目前的伤口外用敷料主要包括传统的纱布类敷料、生物敷料、人工合成敷料、矿物质类敷料、生长因子敷料等。这些敷料各有优缺点，纱布类敷料会妨碍组织细胞上皮化，使创面愈合延迟等；生物敷料虽然在治疗烧伤和皮肤移植方面具有重要作用，但是在消化液和感染环境中抗张强度损耗快，吸收时间不好控制。
中国专利（CN102228715A）公布了一种含壳聚糖衍生物的液体敷料及其制备方法，中国专利（CN104667335A）公开了一种皮肤屏障功能的重组人源胶原蛋白产品及制备方法，此敷料虽然均含有胶原蛋白，但由于胶原蛋白的分子量太大，因此，溶解度较小，稳定性差，此外，液体敷料均采用了化学合成的防腐剂、抑菌剂，因此，安全性也值得考虑。虽然生物敷料的发展非常迅速，但目前没一种敷料能够达到理想敷料的要求，各种类型的敷料均有其不能克服的缺点。
发明内容
本发明在于克服现有技术缺陷，提供一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，该敷料在皮肤表面形成膜达到抗菌的功效，且附着力强，不仅可以长效抗菌，同时还可以隔离感染，是一种具有生物相容性、安全性、抗菌、促进创口愈合等优点的新型液体敷料。
本发明还提供了上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的质量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50-70%，
改性几丁聚糖溶液 0.5-5%，
海参寡肽或天蚕素B 5-20%或1-5%，
人参寡肽 1-5%，
保湿剂 0-20%，
余量为溶剂。
该胶原肽敷料为液体成膜敷料，可作为搽剂、涂抹剂等，具有防治感染、修复组织、促进伤口愈合等功效。
具体的，所用的牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，通过高效液相色谱-质谱进行分析，其相对分子质量低于1000以下的寡肽占60-80%。可购买普通市售产品，或者也可以按照下述工艺流程制备获得：
。
其中，所述的高压蒸煮参数为：时间为5-10h。压力为0.1-1MPa，温度为100-120℃。料液比：1:10-1:50。所述的固液分离处理采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目。离心分离参数：4000r/min，离心10min。所述的酶解处理中，酶可以选用碱性蛋白酶（2.4 AU/g，丹麦诺维信）、中性蛋白酶（0.8 AU/g，丹麦诺维信）、木瓜蛋白酶（2000 U/g，Wolsen公司）、胰蛋白酶（1250 USP/mg，丹麦诺维信）和风味蛋白酶（1000 LAPU/g，丹麦诺维信）中的一种或几种；酶解条件为：酶解温度30-60℃，酶解时间2-6h，pH5-11，酶添加量为上清液重量的0.1-1%。所述的灭酶处理为高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min。所述的分离处理采用膜分离或层析分离。膜分离采用纤维素超滤膜进行超滤，超滤膜分别截留的分子量范围为5-10ku，3-5ku，1-3ku，1uk以下；进料压力0.6 Mpa-1.0Mpa，温度为20℃-30℃。层析分离采用凝胶层析分离，分别采用Sephadex G-25、Sephadex G-10进行分离，流动相为去离子水。所述的干燥处理采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。喷雾干燥（下同）的条件为：喷雾干燥进口温度160-200℃，出口温度80-85℃。真空冷冻干燥（下同）条件为：真空度为0.014MPa，冷阱温度为-40℃- -60℃，干燥时间为20-30h。
具体的，所述改性几丁聚糖溶液是以浓度0.5-1%的乙酸水溶液为溶剂配制而得的，改性几丁聚糖溶液的质量浓度为0.5-5%。配制过程为机械搅拌，搅拌速度50-200rpm，温度为20-40℃，时间为1-3h。本发明选用的改性几丁聚糖购自上海佰一化工有限公司，其脱乙酰度≥70%。
进一步的，所述的海参寡肽具体经下述方法获得：利用碱性蛋白酶（酶活2.4AU/g，购自丹麦诺维信公司）采用仿生提取技术对辽参进行提取（提取温度50℃、提取时间4h），所得酶解液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜，再经喷雾干燥即得。
进一步的，所述的人参寡肽具体经下述方法获得：利用中性蛋白酶（酶活0.8AU/g，购自丹麦诺维信公司）采用仿生提取技术对人参进行提取（提取温度55℃、提取时间5h），所得提取液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜进行分级超滤分离、再经真空冷冻干燥即得。
具体的，所述的保湿剂为甘油、丙二醇、聚乙二醇或山梨醇。
具体的，所述的溶剂为医用纯化水、无水乙醇或不同浓度（10%、30%、50%、70%）的乙醇-水混合液。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1）胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，并分散于部分溶剂中，获得胶原肽溶液；
2）改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖，并按一定比例分散于乙酸水溶液中，获得改性几丁聚糖溶液；
3）主料溶液的制备：将步骤1）所得的胶原肽溶液与步骤（2）所得的改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下充分混合均匀，得到主料溶液；
4）辅料溶液的制备：称取海参寡肽或天蚕素B、以及人参寡肽，分散于保湿剂中，充分混合均匀，获得辅料溶液；
5）成膜敷料的制备：将步骤4）所得的辅料溶液溶于步骤3）所得的主料溶液中，加入剩余的溶剂，充分搅拌至混合均匀，得到液体成膜敷料；
6）杀菌灌装：将骤5）所得的液体成膜敷料瓶体灌装，灭菌，检测，包装即为成品。
步骤1）中，牛骨胶原低聚肽的分散具体可采用机械搅拌或超声波分散，其中，机械搅拌的条件为：温度20-40℃，转速20-100rpm，搅拌时间为0.5-2h；超声波分散的条件为：超声功率200W-800W，超声时间5-30min，占空比1s/1s、2s/1s或1s/2s。
步骤2）中，所述的分散采用机械搅拌，搅拌速度50-200rpm，温度为20-40℃，时间为1-3h。
步骤3）中，所述主料溶液的制备具体可采用机械搅拌，搅拌速度20-100rpm，温度为20-40℃，时间为0.5-2h；
步骤4）中，所述辅料溶液的制备具体为：将保湿剂置于反应釜中，在搅拌状态下加入海参寡肽或天蚕素B、以及人参寡肽，将混合液继续搅拌以充分溶解，搅拌速度为20-100rpm，温度20-40℃，搅拌时间为0.5-2h；
步骤6）中，所述的灭菌具体为采用辐照灭菌，辐照灭菌的辐照剂量为5 kGy-35 kGy。
理想敷料应具备以下功能：防止水分和体液的过度散失；抵御细菌的入侵，防止感染；与创面帖合良好，但不应与创面粘合以免更换敷料带来二次损伤；透湿、透气并使创面处于湿润但又没有积液的环境；生物相容性好，并最好具有能促进伤口愈合的功能。
牛骨胶原低聚肽，提取自牛骨，是一种动物性生物活性肽。其相对分子质量集中在1000以下，其占60-80%。相比普通物理加工制得的牛骨粉，牛骨胶原低聚肽具有其独特的优点：水溶性好；稳定性强；乳化性好；黏度低；易消化吸收；无抗原性，安全性高。有研究表明，牛骨多肽可以促进成骨细胞增殖；并且具有清除自由基抗氧化的作用。最新研究证实，牛骨胶原低聚肽可有效促进伤口愈合。
海参寡肽指以鲜活海参为原料，经蛋白酶水解，分离纯化后得到的以小分子肽为主、多种功效成分共存的蛋白质水解产物。一般由3~10个氨基酸组成，相对分子质量低于1000的组分占90%以上。相比普通物理加工制得的海参粉，经生物酶解得到的海参寡肽具有其独特的优点：水溶性好；稳定性强；乳化性好；黏度低；易消化吸收；无抗原性，安全性高。海参寡肽还具有多种生理活性，抗氧化、抗疲劳、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血压等多种生理功能。有报道从海参体腔细胞胞液中提取的肽段，发现其有抗菌肽的普通理化特性，所以海参体内的免疫调节因子能够作为新型抗菌肽的来源。
研究证实，人参寡肽能够促进成纤维细胞生长,在维持组织结构和参与损伤修复有显著的促进作用，人参寡肽可显著提高小鼠碳廓清能力和巨噬细胞吞噬率，具有显著的抗炎作用，并且具有良好的抗病毒功效。
目前，并没有针对低聚肽开发的医用敷料。基于牛骨胶原低聚肽和海参寡肽的诸多功能和优良特性，将其开发为创面敷料，促进伤口愈合。本发明的创新之处在于：采用牛骨胶原低聚肽可以解决溶解度不佳、稳定性差的问题，提高吸收利用率；并且牛骨胶原低聚肽具有良好的抗炎活性，因此，采用牛骨胶原低聚肽制备促进伤口愈合的医用敷料，再添加生物制剂海参寡肽作为抑菌剂，此液体敷料在皮肤表面形成膜达到抗菌的功效，且附着力强，不仅可以长效抗菌，同时还可以隔离感染，是一种具有生物相容性、安全性、抗菌、促进创口愈合等优点的新型液体敷料。此外，本发明制备工艺设计科学合理，操作简单易行，安全性高，且效果理想，特别是能促进伤口的愈合。
具体实施方式：
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，所用的海参寡肽具体经下述方法获得：利用碱性蛋白酶（酶活2.4AU/g，购自丹麦诺维信公司）采用仿生提取技术对辽参进行提取（提取温度50℃、提取时间4h，提取时料液比为1:30，酶添加量为酶与辽参质量比1:200），所得提取液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜，再经喷雾干燥即得。所得海参寡肽为小分子生物活性肽，经高效液相色谱纯化后，用质谱仪对其分子质量分布进行分析可知，其主要以小分子寡肽为主，相对分子质量小于1000 的寡肽占90%。实施例中，选用的天蚕素B的纯度为80%，购自中农颖泰生物肽有限公司。
下述实施例中，所用的人参寡肽具体经下述方法获得：利用中性蛋白酶（酶活0.8AU/g，购自丹麦诺维信公司）采用仿生提取技术对吉林人参进行提取（提取温度55℃、提取时间5h、提取时料液比为1:25，酶添加量为酶与人参质量比1:200），所得提取液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜进行分级超滤分离、再经真空冷冻干燥即得。所得人参寡肽为小分子生物活性肽的混合物，经高效液相色谱纯化后，用质谱仪对其分子质量分布进行分析可知，混合物主要以小分子低聚肽为主，相对分子质量<1000的组分质量分数大于95%。
实施例1
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50%，
改性几丁聚糖溶液 0.5%，
海参寡肽 5%，
人参寡肽 5%，
甘油 10%，
余量为溶剂医用纯化水。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为5h。压力为0.2MPa，温度为100℃，料液比1:20；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用碱性蛋白酶（2.4AU/g，丹麦诺维信公司）。酶解条件为：酶解温度30℃，酶解时间5h，pH11，酶添加量为上清液重量的0.2%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用膜分离。膜分离采用纤维素超滤膜进行超滤，超滤膜分别截留分子量范围为5-10ku，3-5ku，1-3ku，1uk以下。进料压力0.6 Mpa，温度为20℃；
6）干燥处理：采用喷雾干燥。喷雾干燥的条件为：喷雾干燥进口温度160℃，出口温度80℃。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占60%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启机械搅拌的情况下，边搅拌边分散于部分医用纯化水中。机械搅拌的条件为：温度20℃，转速100rpm，搅拌时间为2h；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度70%），改性几丁聚糖添加量为0.5%（质量百分比），在搅拌状态下溶于0.5%的乙酸水溶液中，搅拌速度50rpm，温度为20℃，时间为3h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行充分混合。搅拌速度50rpm，温度为30℃，时间为1h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取甘油于反应釜中，在充分搅拌状态下加入海参寡肽、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为100rpm，温度40℃，搅拌时间为2h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的医用纯化水，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为5kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表1所示。
表1 敷料的抑菌性分析
*与山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠创面，7天后其皮肤抗张力强度为25.56±2.13g/mm2。每日3次涂抹此敷料于烫伤患者伤口处（伤口面积3cm2），两周后，伤口面积减少率为42%。
实施例2
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 60%，
改性几丁聚糖溶液 1%，
海参寡肽 10%，
人参寡肽 1%，
丙二醇 10%，
余量为溶剂医用纯化水。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为6h。压力为0.5MPa，温度为120℃，料液比1:20；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用中性蛋白酶（0.8AU/g，丹麦诺维信公司）。酶解条件为：酶解温度60℃，酶解时间4h，pH7，酶添加量为上清液重量的0.5%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用膜分离。膜分离采用纤维素超滤膜进行超滤，超滤膜分别截留分子量范围为5-10ku，3-5ku，1-3ku，1uk以下。进料压力1.0Mpa，温度为30℃；
6）干燥处理：采用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥条件为：真空度为0.014MPa，冷阱温度为-60℃，干燥时间为30h。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占70%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启超声波的情况下，分散于部分医用纯化水中。超声波分散的条件为：功率为800w，占空比为1s/2s，超声时间30min；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度80%），改性几丁聚糖添加量为0.8%（质量百分比），在搅拌状态下溶于0.5%的乙酸水溶液中，搅拌速度100rpm，温度为25℃，时间为1h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行混合，搅拌速度100rpm，温度为30℃，时间为1h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取丙二醇于反应釜中，在充分搅拌状态下加入海参寡肽、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为100rpm，温度25℃，搅拌时间为2h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的医用纯化水，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为15kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表2所示。
表2 敷料的抑菌性分析
*与山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠的创面，7天后其皮肤抗张力强度为26.12±3.02g/mm2。每日3次涂抹此敷料于烫伤患者伤口处（伤口面积2.5cm2）患者伤口处，两周后，伤口面积减少率为48%。
实施例3
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50%，
改性几丁聚糖溶液 2%，
海参寡肽 5%，
人参寡肽 5%，
丙二醇 10%，
余量为溶剂30%乙醇-水溶液。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为8h。压力为0.5MPa，温度为100℃，料液比1:10；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用碱性蛋白酶（2.4AU/g，丹麦诺维信公司）和木瓜蛋白酶（2000U/g，Wolsen公司），两种酶重量比例1:1。酶解条件为：酶解温度50℃，酶解时间2h，pH8，酶添加量为上清液重量的1%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用膜分离。膜分离采用纤维素超滤膜进行超滤，超滤膜分别截留分子量范围为5-10ku，3-5ku，1-3ku，1uk以下。进料压力1.0Mpa，温度为25℃；
6）干燥处理：采用喷雾干燥。喷雾干燥的条件为：喷雾干燥进口温度200℃，出口温度85℃。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占80%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启机械搅拌的情况下，边搅拌边分散于部分30%乙醇-水溶液中。机械搅拌的条件为：温度25℃，转速100rpm，搅拌时间为1h；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度70%），改性几丁聚糖添加量为0.5%（质量百分比），在搅拌状态下溶于0.8%的乙酸水溶液中，搅拌速度100rpm，温度为35℃，时间为2h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行混合，搅拌速度50rpm，温度为30℃，时间为2h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取丙二醇于反应釜中，在充分搅拌状态下加入海参寡肽、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为50rpm，温度20℃，搅拌时间为1h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的30%乙醇-水溶液，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为20kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表3所示。
表3 敷料的抑菌性分析
*与医用纯化水和山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠的创面，7天后其皮肤抗张力强度为23.12±1.02g/mm2。每日3次涂抹此敷料于划伤患者伤口处（伤口长度4cm2），两周后，伤口面积减少率为38%。
实施例4
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 70%，
改性几丁聚糖溶液 5%，
天蚕素B 2%，
人参寡肽 2%，
聚乙二醇 10%，
余量为溶剂50%乙醇-水混合液。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为5h。压力为1MPa，温度为120℃，料液比1:30；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用胰蛋白酶（1250 USP/mg，丹麦诺维信）、风味蛋白酶（1000 LAPU/g，丹麦诺维信），两种酶重量比例1:1。酶解条件为：酶解温度60℃，酶解时间4h，pH7，酶添加量为上清液重量的1%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用层析分离。层析分离采用凝胶层析分离，分别采用Sephadex G-25、Sephadex G-10进行分离，流动相为去离子水；
6）干燥处理：采用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥条件为：真空度为0.014MPa，冷阱温度为-40℃，干燥时间为20h。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占75%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启机械搅拌的情况下，边搅拌边分散于部分50%乙醇-水混合液中。机械搅拌的条件为：温度30℃，转速20rpm，搅拌时间为0.5h；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度80%），改性几丁聚糖添加量为1%（质量百分比），在搅拌状态下溶于1%的乙酸水溶液中，搅拌速度200rpm，温度为40℃，时间为3h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行混合，搅拌速度100rpm，温度为30℃，时间为2h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取聚乙二醇于反应釜中，在充分搅拌状态下加入天蚕素B、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为20rpm，温度40℃，搅拌时间为1h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的50%乙醇-水混合液，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为5kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表4所示。
表4 敷料的抑菌性分析
*与医用纯化水和山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠的创面，7天后其皮肤抗张力强度为22.56±3.02g/mm2。每日3次涂抹此敷料于烫伤患者伤口（伤口面积2cm2），两周后，伤口面积减少率为50%。
实施例5
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50%，
改性几丁聚糖溶液 2%，
天蚕素B 5%，
人参寡肽 2%，
甘油 20%，
余量为溶剂70%乙醇-水混合液。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为8h。压力为0.8MPa，温度为120℃，料液比1:40；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用木瓜蛋白酶（2000U/g，Wolsen公司）。酶解条件为：酶解温度50℃，酶解时间5h，pH7，酶添加量为上清液重量的1%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用膜分离。膜分离采用纤维素超滤膜进行超滤，超滤膜分别截留分子量范围为5-10ku，3-5ku，1-3ku，1uk以下。进料压力1.0Mpa，温度为30℃；
6）干燥处理：采用喷雾干燥。喷雾干燥的条件为：喷雾干燥进口温度180℃，出口温度85℃。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占75%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启超声波的情况下，分散于部分70%乙醇-水混合液。超声波功率为200W，占空比1s/1s，超声时间10min；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度70%），改性几丁聚糖添加量为0.5%（质量百分比），在搅拌状态下溶于0.8%的乙酸水溶液中，搅拌速度200rpm，温度为40℃，时间为1h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行混合，搅拌速度100rpm，温度为20℃，时间为2h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取甘油于反应釜中，在充分搅拌状态下加入天蚕素B、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为100rpm，温度30℃，搅拌时间为0.5h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的70%乙醇-水混合液，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为35kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表5所示。
表5 敷料的抑菌活性分析
*与医用纯化水和山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠的创面，7天后其皮肤抗张力强度为28.56±2.42g/mm2。每日3次涂抹此敷料于摔伤伤患者伤口处（伤口面积4cm2），两周后，伤口面积减少率为60%。
实施例6
一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的重量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50%，
改性几丁聚糖 0.5%，
海参寡肽 20%，
人参寡肽 1%，
山梨醇 10%，
余量为溶剂无水乙醇。
其中，牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其具体工艺流程如下：
；
1）高压蒸煮：时间为10h。压力为1MPa，温度为120℃，料液比1:50；
2）固液分离处理：采用滤布过滤进行分离，所用滤布为200目；
3）离心分离：采用4000r/min，离心10min；
4）酶解处理：采用碱性蛋白酶（2.4AU/g，丹麦诺维信公司）。酶解条件为：酶解温度60℃，酶解时间3h，pH11，酶添加量为上清液重量的1%。所述的灭酶处理采用高温灭酶法，温度为95℃，水浴20min。灭酶完成后，澄清处理采用离心分离取上清液备用，离心分离采用4000r/min，离心10min；
5）分离处理：采用层析分离。层析分离采用凝胶层析分离，分别采用Sephadex G-25、Sephadex G-10进行分离，流动相为去离子水；
6）干燥处理：采用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥条件为：真空度为0.014MPa，冷阱温度为-60℃，干燥时间为30h。采用以上工艺制备的牛骨胶原低聚肽，通过高效液相色谱-质谱进行分析，得到其相对分子质量低于1000以下的寡肽占80%。
上述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其具体包括如下步骤：
1、胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，在开启机械搅拌的情况下，边搅拌边分散于部分无水乙醇中。机械搅拌的条件为：温度20℃，转速50rpm。搅拌时间为0.5h；获得胶原肽溶液；
2、改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖（脱乙酰度80%），改性几丁聚糖添加量为1%（质量百分比），在搅拌状态下溶于0.5%的乙酸水溶液中，搅拌速度50rpm，温度为20℃，时间为1h；获得改性几丁聚糖溶液；
3、主料溶液的制备：将步骤1所得胶原肽溶液与步骤2所得改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下进行混合，搅拌速度100rpm，温度为20℃，时间为2h。混合均匀后得主料溶液；
4、辅料溶液的制备：称取山梨醇于反应釜中，在充分搅拌状态下加入海参寡肽、人参寡肽，将混合液继续搅拌，搅拌速度为100rpm，温度20℃，搅拌时间为1h，使之混合均匀，获得辅料溶液；
5、成膜敷料的制备：将步骤4所得辅料溶液溶于步骤3所得主料溶液中，加入剩余的无水乙醇，充分搅拌至混合均匀，制备得到液体成膜敷料；
6、杀菌灌装：将液体成膜敷料瓶体灌装，采用辐照灭菌，辐照剂量为15kGy。灭菌后检测，包装即为成品。该促进伤口愈合的胶原肽敷料为液体成膜敷料，可用作搽剂、抹剂。
对此敷料的抑菌性进行了分析，通过抑菌圈的直径对抑菌性进行评价，结果见表6所示。
表6 敷料的抑菌活性分析
*与医用纯化水和山梨酸钾相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
#与医用纯化水相比，差异存在统计学意义（P<0.05）
经过实验测试，每日3次涂抹此敷料于皮肤切口手术模型雄性ICR小鼠的创面，7天后其皮肤抗张力强度为20.56±3.02g/mm2。每日3次涂抹此敷料于摔伤伤患者伤口处（伤口面积8cm2），两周后，伤口面积减少率为40%。
综上可以看出：本发明以牛骨胶原低聚肽为主要成分，辅以人参寡肽，加入改性几丁聚糖、抗菌肽（海参寡肽或天蚕素B）、以及保湿剂和溶剂制备获得胶原肽液态敷料。该敷料在皮肤表面形成膜达到抗菌的功效，且附着力强，不仅可以长效抗菌，同时还可以隔离感染，是一种具有生物相容性、安全性、抗菌、促进创口愈合等优点的新型液体敷料。
Claims (10)
1.一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，其各成分的质量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽 50-70%，
改性几丁聚糖溶液 0.5-5%，
海参寡肽或天蚕素B 5-20%或1-5%，
人参寡肽 1-5%，
保湿剂 0-20%，
余量为溶剂。
2.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所用的牛骨胶原低聚肽提取自牛骨，其相对分子质量低于1000以下的寡肽占60-80%。
3.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所述改性几丁聚糖溶液是以浓度0.5-1%的乙酸水溶液为溶剂配制而得的，改性几丁聚糖溶液的质量浓度为0.5-5%。
4.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所述的海参寡肽具体经下述方法获得：利用碱性蛋白酶采用仿生提取技术对辽参进行提取，所得提取液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜，再经喷雾干燥即得。
5.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所述的人参寡肽具体经下述方法获得：利用中性蛋白酶采用仿生提取技术对人参进行提取，所得提取液依次通过截留分子量10、5、3、1ku的超滤膜进行分级超滤分离、再经真空冷冻干燥即得。
6.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所述的保湿剂为甘油、丙二醇、聚乙二醇或山梨醇。
7.根据权利要求1所述促进伤口愈合的胶原肽敷料，其特征在于，所述的溶剂为医用纯化水、无水乙醇或乙醇-水混合液。
8.权利要求1至7任一所述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）胶原肽溶液的制备：称取牛骨胶原低聚肽，并分散于部分溶剂中，获得胶原肽溶液；
2）改性几丁聚糖溶液的制备：称取改性几丁聚糖，并按一定比例分散于乙酸水溶液中，获得改性几丁聚糖溶液；
3）主料溶液的制备：将步骤1）所得的胶原肽溶液与步骤（2）所得的改性几丁聚糖溶液在搅拌状态下充分混合均匀，得到主料溶液；
4）辅料溶液的制备：称取海参寡肽或天蚕素B、以及人参寡肽，分散于保湿剂中，充分混合均匀，获得辅料溶液；
5）成膜敷料的制备：将步骤4）所得的辅料溶液溶于步骤3）所得的主料溶液中，加入剩余的溶剂，充分搅拌至混合均匀，得到液体成膜敷料；
6）杀菌灌装：将骤5）所得的液体成膜敷料瓶体灌装，灭菌，检测，包装即为成品。
9.权利要求8所述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其特征在于，步骤1）中，牛骨胶原低聚肽的分散采用机械搅拌或超声波分散，其中，机械搅拌的条件为：温度20-40℃，转速20-100rpm，搅拌时间为0.5-2h；超声波分散的条件为：超声功率200W-800W，超声时间5-30min，占空比1s/1s、2s/1s或1s/2s。
10.权利要求9所述促进伤口愈合的胶原肽敷料的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述主料溶液的制备采用机械搅拌，搅拌速度20-100rpm，温度为20-40℃，时间为0.5-2h；
步骤4）中，所述辅料溶液的制备具体为：将保湿剂置于反应釜中，在搅拌状态下加入海参寡肽或天蚕素B、以及人参寡肽，将混合液继续搅拌以充分溶解，搅拌速度为20-100rpm，温度20-40℃，搅拌时间为0.5-2h；
步骤6）中，所述的灭菌采用辐照灭菌，辐照灭菌的辐照剂量为5 kGy-35 kGy。
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