CN110559476A - 一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法，属于医用材料技术领域，包括成膜剂、增塑剂、抗炎物质、溶剂；其中，增塑剂包括甘油，溶剂包括去离子水，抗炎物质包括高F值寡肽，氨基酸序列为Leu‑Leu‑Phe‑Thr‑Thr‑Gln，分子量为736.52Da。该液体创可贴能够促进白细胞介素10(IL‑10)的表达，抑制白细胞介素6(IL‑6)和肿瘤坏死因子(TNF‑α)的表达，具有较好的抗炎活性；能够增强凝胶与受伤的皮肤表面的紧密接触，增加创面清洁度，能够提高炎症细胞的清除速率。

Description

一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法。

背景技术

传统创可贴己经有近百年的历史，在处理伤口的便捷性上做出了巨大的贡献。传统的创可贴能够覆盖伤口表面，以免外界环境对伤口愈合进程的影响，能够压迫止血，隔绝杀菌，促进伤口愈合且易于携带。这种传统创可贴虽说经久不衰，但是在日常生活中，我们也感受到了其在特殊情况下的劣势所在：当在特殊复杂的伤口表面时，传统创可贴不能很好地贴敷在伤口表面；胶布透气性较差，人伤口处的分泌物和汗液不能很好地排出体外而对伤口处产生浸泡作用，因而能使伤口很好地愈合；部分传统创可贴打着防水的旗号，其实其防水性能堪忧，总会有外界的水浸泡胶布及含药层，而进入伤口造成伤口感染。液体创可贴是由成膜材料溶解在溶剂中，通过涂抹或者喷洒紧紧粘附于皮肤创伤部位，形成半透明保护膜。具有隔菌、透气、防水、使用方便、易于观察伤口情况及促进伤口恢复等特点。液体创可贴包括两类，一类是非处方性质的皮肤保护剂，可以保护表面擦伤及慢性褥疮等；第二类是用于手术缝合的组织胶粘剂，用于治疗严重的皮肤撕裂。相比于传统创可贴，液体创可贴的有着划时代的意义。但是就目前国内相关研究及市场来看，普遍存在的问题是使用时刺激性较大，有一定的异味，而且防水性能及透气性能等也亟待进一步的改善。

现有技术如授权公告号为CN 101381356 B的中国发明专利，公开一种液体创可贴，其原料组成和配比包括：活性物质，活性物质包括细胞因子0.0042-0.0095％，细胞因子选自EGF、PDGF、FGF和IL-10中的至少两种；成膜物质，成膜物质包括壳聚糖盐酸盐2％-8％；以及溶剂，溶剂为去离子水或者蒸馏水。该发明还公开一种制备该液体创可贴的方法。利用该发明的和/或利用该发明的方法制备得的包含多种生物活性物质的液体创可贴，能够保持各种生物活性物质的活性，能够高效的对创口进行高效、无痕修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴，该液体创可贴能够促进白细胞介素10(IL-10)的表达，抑制细胞促炎因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达，具有较好的抗炎活性；能够增强凝胶与受伤的皮肤表面的紧密接触，增加创面清洁度，能够提高炎症细胞的清除速率。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴，包括成膜剂、增塑剂、抗炎物质、溶剂；

其中，上述增塑剂包括甘油，上述溶剂包括去离子水，上述抗炎物质包括高F值寡肽，氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da。氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的高F值寡肽具有较好的抗炎活性，能够促进白细胞介素10(IL-10)的表达，抑制细胞促炎因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达，使用含有该高F值寡肽的液体创可贴能够减少炎症的发生，促进伤口愈合。

作为优选，上述成膜剂包括聚乙烯醇，改性壳聚糖。伤口愈合过程是一个复杂的过程，涉及多种机制，目前任何一种单一材料都不能满足伤口愈合过程的复杂需要，聚乙烯醇/改性壳聚糖生物复合水凝胶吸收性好，具有良好的生物相容性，生物学活性，隔绝性能和机械强度。

作为优选，上述改性壳聚糖为羟基肉桂酸改性壳聚糖，羟基肉桂酸改性壳聚糖上接枝有二羟香豆素。本发明提供的改性壳聚糖，能够提高液体创可贴的吸水性，同时能够调整温度敏感性，使成胶温度保持在36.5℃左右，增强凝胶与受伤的皮肤表面的紧密接触，增加创面清洁度，能够提高炎症细胞的清除速率，减少创面的炎症反应，加快伤口愈合。

作为优选，上述羟基肉桂酸对壳聚糖进行改性的具体方法为：

取壳聚糖，加入二甲基亚砜，搅拌，缓慢滴加碱液，搅拌碱化1.8-2.2h；

取羟基肉桂酸溶于二甲基亚砜中，缓慢滴入上述步骤制得的溶液中，滴加过程中不断进行搅拌，后置于58-62℃反应5.5-6h，冷却后抽滤，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮充分洗涤，干燥，得羟基肉桂酸改性壳聚糖。

作为优选，采用溶液共混法制备上述液体创可贴。采用溶液共混法制备的聚乙烯醇/改性壳聚糖复合水凝胶具有良好的抗菌性能、涂覆性能、对细胞无毒副作用。

本发明的另一个目的在于提供一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴的制备方法，上述液体创可贴的制备步骤和条件如下：

上述液体创可贴按重量份计，包括成膜剂50-70份，高F值寡肽1-1.2份，增塑剂80-90份，溶剂150-200份；

将上述成膜剂溶于溶剂中，搅拌至溶解完全，加入高F值寡肽，加入增塑剂，搅拌均匀后，即制得本发明的液体创可贴。根据本发明提供的方法所制得的液体创可贴的流动性好，贴附性优良，对皮肤刺激性小具有良好的生物相容性，生物学活性，隔绝性能和机械强度。

作为优选，上述高F值寡肽为天然寡肽。

作为优选，上述天然寡肽的制备原料为金枪鱼下脚料。

作为优选，上述天然寡肽的制备方法包含：

采用双酶分步水解金枪鱼蛋白：第一步水解酶为胃蛋白酶，第二步水解酶为风味蛋白酶；

脱除芳香族氨基酸；

分离纯化。采用胃蛋白酶和风味蛋白酶水解金枪鱼蛋白，有利于提高酶解效率，释放芳香族氨基酸，所得蛋白水解液的F值较高，能够得到氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的高F值寡肽。

作为优选，采用活性炭对上述芳香族氨基酸进行脱除。

本发明的有益效果为：

1)本发明在液体创可贴中加入氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的高F值寡肽具有较好的抗炎活性，能够促进白细胞介素10(IL-10)的表达，抑制细胞促炎因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达，减少伤口恢复时炎症的发生，促进伤口愈合；

2)本发明通过对壳聚糖进行改性，能够提高液体创可贴的吸水性，同时能够调整温度敏感性，使成胶温度保持在36.5℃左右，增强凝胶与受伤的皮肤表面的紧密接触，增加创面清洁度，能够提高炎症细胞的清除速率，减少创面的炎症反应，加快伤口愈合。

附图说明

图1为本发明试验例1中液体创可贴的成胶温度和吸水率；

图2为本发明试验例2中皮肤创面中性粒细胞的募集情况；

图3为本发明试验例2中中性粒细胞在0.09mm²创面的募集数量；

图4为本发明试验例2中IL-10、IL-6和TNF-α的免疫印迹图；

图5为本发明试验例2中IL-10、IL-6和TNF-α的相对表达量；

图6为本发明试验例2中液体创可贴处理后创面的愈合率。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴的制备方法，包括：

采用双酶分步水解金枪鱼蛋白：取金枪鱼碎肉，第一步水解用酶为胃蛋白酶，加酶量600U/g，pH2.0，料水比1:7，温度35℃，水解时间3h；第二步水解用酶为风味蛋白酶，加酶量50000U/g，pH6.5，温度50℃,水解时间4h，得到蛋白水解液。

脱除芳香族氨基酸：将蛋白水解液进行真空抽滤，按照固液比为1:20的比例加入200目活性炭粉末，pH3.0，温度35℃，时间3h，静态吸附芳香族氨基酸，待吸附结束后，4000rpm离心10min，取上清，得到寡肽液。

凝胶过滤：将经活性炭静态脱芳处理的寡肽液浓缩，冷冻干燥后，取50mg溶于1.5ml蒸馏水中，采用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱(1.6×50cm)分离纯化。上样后用pH7.2磷酸盐缓冲液洗脱，每230s收集一管洗脱液，每管3ml，分别测定各管在220nm、280nm下的紫外吸光值(A)，得到A1、A2、A3、A4四个组分，分别检测各组分的氨基酸组成以及含量，按下式计算各组分的F值：

F＝(Val+Ile+Leu)/(Tyr+Phe)

其中，Val、Ile、Tyr、Phe、Leu分别代表缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的含量，单位为mg/mL。

经计算，A3的F值最高，为37.52。

反向高效液相色谱纯化寡肽：将凝胶分离后的A3组分寡肽液浓缩，冷冻干燥。取1mg，用含0.05％TFA的超纯水溶解至1ml，离心，取上清，上RP-HPLC色谱。色谱条件：进样体积500μL，流速0.8ml/min，检测波长280nm，柱温25℃，流动相为A相-B相，A相为含0.05％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.05％三氟乙酸的乙腈。梯度洗脱条件(B相)：0-9min，0％B；9-40min，0％-100％B；40-50min，100％B。最后在色谱峰上收集到M1、M2、M3、M4共4个组分，进行冻干处理，称重，测定收集到的组分的氨基酸序列，并对各组分的分子量进行精确测定，测得M3组分为氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的目标寡肽。

改性壳聚糖的制备：取1.5g壳聚糖于三口烧瓶，加入10mL二甲基亚砜，30℃下搅拌溶胀1h，缓慢滴加碱液，搅拌碱化2h；取3g羟基肉桂酸溶于二甲基亚砜中，缓慢滴入烧瓶中，滴加过程中不断进行搅拌，后置于60℃反应5.8h，冷却后抽滤，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮充分洗涤，干燥，得羟基肉桂酸改性壳聚糖。取1g羟基肉桂酸改性的壳聚糖溶于100mL2％乙酸溶液中，溶胀2h，搅拌下将其加入到碱液中沉淀，抽滤，用丙酮洗涤，抽至半干，转入100mL丙酮中，搅拌成悬浊液，滴入5mL环氧氯丙烷，调温至35℃反应24h。之后加入3mL二羟香豆素，置于60℃反应6h，再加入8mL二羟香豆素、50mLNaOH溶液，0.05g碘化钾，搅拌4h，冷却后抽滤，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮充分洗涤，干燥，得到二羟香豆素接枝的改性壳聚糖。

液体创可贴的制备：将16g聚乙烯醇溶于160g去离子水，90℃水浴条件下搅拌至溶解完全，加入40g改性壳聚糖，溶解完全后，加入1g高F值寡肽，加入64g甘油，搅拌均匀后，即制得本发明的液体创可贴。

对比例1：

液体创可贴中未加入高F值寡肽，其余部分和实施例1完全一致。

对比例2：

未用羟基肉桂酸改性壳聚糖，其余部分和实施例1完全一致。

对比例3：

未用二羟香豆素接枝壳聚糖，其余部分和实施例1完全一致。

对比例4：

未用羟基肉桂酸改性壳聚糖，未用二羟香豆素接枝壳聚糖，其余部分和实施例1完全一致。

对比例5：

未用羟基肉桂酸改性壳聚糖，未用二羟香豆素接枝壳聚糖，液体创可贴中未加入高F值寡肽，其余部分和实施例1完全一致。

试验例1：

液体创可贴的温敏性检测：

将配制的液体创可贴置于水浴环境中，以0.5℃/min速度逐渐升温，每次升温后，采用倒置法观察溶液体系，若体系倒置无液体流出，则该温度为最低成胶温度。

液体创可贴的吸水率检测：

将配制的液体创可贴水浴成胶，将胶片置于PBS溶液中，室温下溶胀平衡。拭干湿胶片表面水分并称重。将湿胶片烘干并称重，则凝胶吸水率的计算公式如下：

吸水率＝(W-W₀)/W₀×100％

其中，W为溶胀平衡时湿凝胶的质量；W₀为干凝胶的质量。液体创可贴的成胶温度和吸水率见图1。

由图1可以看出，实施例1和对比例1的成胶温度为36.5℃左右，为人体体温范围，对比例2、对比例3、对比例4、对比例5的成胶温度高于人体体温，且实施例1和对比例1的吸水率明显较高，这说明用羟基肉桂酸改性壳聚糖，二羟香豆素接枝壳聚糖，能够提高液体创可贴的吸水性，使成胶温度保持在36.5℃左右。

试验例2：

构建小鼠皮肤全切除创伤模型：腹腔注射100μL，2％戊巴比妥钠，脱去小鼠毛发，干燥洁净环境培养24h，使用打孔器在小鼠背脊两侧各制造直径为8mm的皮肤权切除创伤，以对创伤不做处理的为对照组，以未进行创伤处理的为空白组。

将处理后的小鼠置于干燥洁净的环境下进行培养，分别在培养第2天后进行拍照，提取创伤组织(含距离创面约5mm的正常组织)进行后续的实验。

创面中性粒细胞的检测：

将皮肤组织进行包埋和制片，采用兔子中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)免疫组化检测试剂盒检测中性粒细胞的募集。皮肤创面中性粒细胞的募集情况见图2，标尺为25μm。中性粒细胞在0.09mm²创面的募集数量见图3。

由图3可以看出，实施例1和对比例1的中性粒细胞在0.09mm²创面的募集数量明显高于对比例2、对比例3、对比例4、对比例5，这说明，用羟基肉桂酸改性壳聚糖，二羟香豆素接枝壳聚糖，增强凝胶与受伤的皮肤表面的紧密接触，增加保持创面清洁度，能够提高炎症细胞的清除速率，减少创面的炎症反应；对比例2、对比例3、对比例4的中性粒细胞在0.09mm²创面的募集数量明显高于对比例5，这说明，使用含有氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的高F值寡肽的液体创可贴能够减少炎症的发生，图2皮肤创面中性粒细胞的募集情况也证实了这个结论。

免疫印迹法检测白细胞介素10(IL-10)，白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达：

以β-actin作为参考蛋白，采用WB免疫印迹试剂盒检测IL-10、IL-6、TNF-α的表达。IL-10、IL-6和TNF-α的免疫印迹图见图4，IL-10、IL-6和TNF-α的相对表达量见图5。

由图4，图5可以看出实施例1和对比例2、对比例3、对比例4的IL-10的相对表达量明显高于对比例1和对比例5，且IL-6和TNF-α的相对表达量明显低于对比例1和对比例5，这说明，含有氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da的高F值寡肽的液体创可贴能够通过促进白细胞介素10(IL-10)的表达，且抑制细胞促炎因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达来减少炎症的发生。

创面愈合过程的检测：

分别在治疗后第1、4、7、14d，观察全切除创伤使用液体创可贴处理后创面的愈合情况。伤口愈合率见图6。

由图6可以看出，实施例1的愈合率明显高于对比例1，对比例2和对比例3、对比例4的愈合率明显高于对比例5，这说明，液体创可贴中加入高F值寡肽，能够减少炎症的发生，促进创面的愈合。实施例1的愈合率明显高于对比例2，对比例3和对比例4，对比例1的愈合率明显高于对比例5，这说明，用羟基肉桂酸改性壳聚糖，用二羟香豆素接枝壳聚糖，能够减少创面的炎症反应，提高疗效，加快伤口愈合。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 金枪鱼(Tuna)

<400> 1

Leu Leu Phe Thr Thr Gln

1 5

Claims (10)

1.一种含有肽类抗炎活性成分的液体创可贴，其特征在于，包括成膜剂、增塑剂、抗炎物质、溶剂；

其中，所述增塑剂包括甘油，所述溶剂包括去离子水，所述抗炎物质包括高F值寡肽，氨基酸序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，分子量为736.52Da。

2.根据权利要求1所述的液体创可贴，其特征在于：所述成膜剂包括聚乙烯醇，改性壳聚糖。

3.根据权利要求2所述的液体创可贴，其特征在于：所述改性壳聚糖为羟基肉桂酸改性壳聚糖，所述羟基肉桂酸改性壳聚糖上接枝有二羟香豆素。

4.根据权利要求3所述的液体创可贴，其特征在于：所述羟基肉桂酸对壳聚糖进行改性的具体方法为：

1)取壳聚糖，加入二甲基亚砜，搅拌，缓慢滴加碱液，搅拌碱化1.8-2.2h；

2)取羟基肉桂酸溶于二甲基亚砜中，缓慢滴入所述步骤1)制得的溶液中，滴加过程中不断进行搅拌，后置于58-62℃反应5.5-6h，冷却后抽滤，依次用去离子水，无水乙醇，丙酮充分洗涤，干燥，得羟基肉桂酸改性壳聚糖。

5.根据权利要求1所述的液体创可贴，其特征在于：采用溶液共混法制备所述液体创可贴。

6.权利要求1-5任一项中所述的液体创可贴的制备方法，其特征在于，所述液体创可贴的制备步骤和条件如下：

所述液体创可贴按重量份计，包括成膜剂50-70份，高F值寡肽1-1.2份，增塑剂80-90份，溶剂150-200份；

将所述成膜剂溶于溶剂中，搅拌至溶解完全，加入高F值寡肽，加入增塑剂，搅拌均匀后，即制得本发明的液体创可贴。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述高F值寡肽为天然寡肽。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述天然寡肽的制备原料为金枪鱼下脚料。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述天然寡肽的制备方法包含：

1)采用双酶分步水解金枪鱼蛋白：第一步水解酶为胃蛋白酶，第二步水解酶为风味蛋白酶；

2)脱除芳香族氨基酸；

3)分离纯化。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：采用活性炭对所述芳香族氨基酸进行脱除。