CN111298185B - 一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)将榨油后的山茶油茶籽粕粉碎后加入水中，调节pH值至10.0～11.0，搅拌离心取上清；然后调节上清液的pH值至2.0～4.5使其产出沉淀；再取沉淀物溶于水中，调节pH值至2.0～4.0并加入蛋白酶进行酶解反应，酶解后取上清，并将其pH值调节至中性，超滤、冷冻干燥，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽；(2)将山茶油茶籽粕抗菌多肽溶于水中，然后加入明胶溶液和海藻酸钠溶液，冷冻干燥，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。本发明方法获得的医用敷料抗菌效果好且保湿性能好，可将其应用在创伤保护、创伤修复等领域。

Description

一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医用创伤保护、创伤修复领域，特别涉及一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料及其制备方法与应用。
背景技术
敷料是临床上一种用以覆盖创伤的医用材料，能够隔绝创口与外界环境的直接接触。现有的敷料、纱布等，一方面补水保湿功能欠佳，不能为伤口提供一个良好的愈合环境；另一方面，缺乏对细菌等微生物的抑制、清除能力。为避免细菌等微生物在伤口处的滋生，通常会添加金属类抗菌剂、抗生素或其他防腐剂等来抑制微生物生长，但是这些抗菌剂会对人体产生毒害或其他敏感现象，对人体皮肤不利。此外，由于伤口可能有渗出液，如未及时清理，会造成创口的二次伤害。
油茶为山茶科山茶属植物，是我国南方丘陵地区一种重要的油料作物。我国每年生产油茶籽已经超过210万吨，榨油后的副产物——油茶籽粕约150万吨，榨油后的油茶籽粕中含有小于1％的残脂和10％～20％的蛋白质等，其中油脂具有先天的保湿修复功效，而蛋白质经酶解可制备不同分子量的多肽，有一部分具有优良的抗菌作用，是良好、安全的天然抗菌剂。因此，提供一种以山茶油茶籽粕抗菌多肽为原料制备的医用敷料具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
本发明的再一目的在于提供所述山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将榨油后的山茶油茶籽粕粉碎后加入水中，调节pH值至10.0～11.0，搅拌、离心、取上清，得到上清液A；然后调节上清液A的pH值至2.0～4.5使其产出沉淀，过滤，取沉淀物；再将沉淀物溶于水中，调节pH值至2.0～4.0并加入蛋白酶进行酶解反应，待反应结束后将酶灭活，离心、取上清，得到上清液B；最后将上清液B的pH值调节至中性，经过超滤膜超滤后冷冻干燥，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽；
(2)将步骤(1)中得到的山茶油茶籽粕抗菌多肽溶于水中，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽溶液；然后加入明胶溶液和海藻酸钠溶液，搅拌混合均匀，冷冻干燥，灭菌，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
步骤(1)中所述的粉碎为将山茶油茶籽粕粉碎至60～80目；优选为将山茶油茶籽粕粉碎至60目。
步骤(1)中所述的榨油后的山茶油茶籽粕的用量优选为按每克(g)榨油后的山茶油茶籽粕配比15.0～30.0mL水计算。
步骤(1)中所述的将榨油后的山茶油茶籽粕粉碎后加入水中后，其pH值优选为调节至10.3～11.0。
步骤(1)中所述的调节pH值至10.0～11.0为采用氢氧化钠溶液进行调节；优选为采用0.1～0.5mol/L的氢氧化钠溶液进行调节；更优选为采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液进行调节。
步骤(1)中所述的搅拌的时间为1～3h；优选为2h。
步骤(1)中所述的上清液A的pH值优选为调节至2.5～3.0。
步骤(1)中所述的调节pH值至2.0～4.5为采用盐酸溶液进行调节；优选为采用0.1～0.5mol/L的盐酸溶液进行调节；更优选为采用0.5mol/L的盐酸溶液进行调节。
步骤(1)中所述的沉淀物溶于水中，其pH值优选为调节至3.0～3.7。
步骤(1)中所述的调节pH值至2.0～4.0为采用盐酸溶液进行调节；优选为采用0.1～0.5mol/L的盐酸溶液进行调节；更优选为采用0.5mol/L的盐酸溶液进行调节。
步骤(1)中所述的pH值调节至中性为采用氢氧化钠溶液进行调节；优选为采用0.1～0.5mol/L的氢氧化钠溶液进行调节；更优选为采用0.1mol/L的氢氧化钠溶液进行调节。
步骤(1)中所述的蛋白酶优选为胃蛋白酶；更优选为猪源胃蛋白酶。
所述的猪源胃蛋白酶的用量为按其反应底物质量的0.5％～2％计算(即按每1g底物添加0.005～0.020g猪源胃蛋白)；优选为为按其反应底物质量的1.0％计算。
步骤(1)中所述的酶解反应的条件为：37℃酶解1.0～2.0h。
步骤(1)中所述的将酶灭活的条件为：90℃加热10min。
步骤(1)中所述的超滤膜优选为截留分子量为10kDa的超滤膜。
步骤(2)中所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽溶液的浓度为5.0～15.0mg/mL；优选为10.0～15.0mg/mL。
步骤(2)中所述的明胶溶液的浓度为50.0～150.0mg/mL；优选为100.0～120.0mg/mL。
步骤(2)中所述的海藻酸钠溶液的浓度为50.0～150.0mg/mL；优选为75.0～100.0mg/mL。
步骤(2)中所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽，明胶和海藻酸钠的质量比为12～30：2500～3000：1875～2500。
步骤(2)中所述的冷冻干燥的条件为：在-40℃下预冻后真空冷冻干燥48h。
步骤(2)中所述的灭菌优选为辐照灭菌。
一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料在制备医用抗菌料或抗菌剂中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以山茶油茶籽粕为原料，通过提取具有良好抗菌活性山茶油茶籽粕抗菌多肽，将其制成含有山茶油茶籽粕抗菌多肽的医用敷料，实现了对山茶油茶籽粕固体废弃物的“变废为宝”。
(2)本发明方法制备工艺简单，设备简易，原料价廉易得，生产温和简单且成本低，容易实现产业化，符合市场需求，获得的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料舒适有效，性能稳定，具有可贴敷强、抗菌剂天然、抗菌效果好，且保湿性能好等优点。
(3)本发明从山茶油茶籽粕中提取活性物质山茶油茶籽粕抗菌多肽，天然无刺激，将其成功固定在敷料上制备山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料，发挥稳定的抗菌效果和保湿性能，为伤口提供一个良好的愈合环境，起到对创面的双重保护，可将其应用在创伤保护、创伤修复等领域。
附图说明
图1是本发明中的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的抗菌对照实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的原料和方法为本技术领域常规原料和方法。除非特别说明，本发明所用原材料均可通过市售获得。
本发明中涉及的榨油后的山茶油茶籽粕购于湖南衡阳市衡山县衡星坊生物科技有限公司。
本发明中涉及的猪源胃蛋白酶购于阿拉丁试剂(货号P110927)。
本发明中的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法包括如下步骤：
步骤一：将榨油后的山茶油茶籽粕粉碎，加入水中后调节pH为10.0～11.0，充分搅拌一定时间后，离心过滤取上清液，调节pH为2.0～4.5至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于水，调节pH为2.0～4.0并加入猪源胃蛋白酶，在37℃搅拌后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，pH调至近中性，经过超滤膜进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制浓度为5.0～15.0mg/mL的明胶溶液为A，配制浓度为5.0～15.0mg/mL海藻酸钠溶液B，A和B各自充分超声搅拌完全溶解后混合，添加5.0～15.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到模具中，在-40℃下预冻后真空冷冻干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
实施例1
步骤一：将40g榨油后的山茶油茶籽粕粉碎至60目，加入600mL水中用0.5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为10.3，充分搅拌2h后，离心过滤取上清液，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH为2.5至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于20mL水，调节pH为3.7(用0.5mol/L盐酸溶液调节)并加入猪源胃蛋白酶(按其反应底物质量的0.5％添加)，在37℃搅拌1.5h后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，用0.1mol/L氢氧化钠将pH调至近中性，经过超滤膜(截留分子量10kDa的超滤膜)进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制25mL浓度为100.0mg/mL的明胶溶液A，配制25mL浓度为75mg/mL海藻酸钠溶液B，A和B各自充分超声搅拌完全溶解后混合，添加1mL 12.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽溶液，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻(-40℃)干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
实施例2
步骤一：将40g榨油后的山茶油茶籽粕粉碎至60目，加入800mL水中用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH为10.5，充分搅拌2h后，离心过滤取上清液，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH为3.0至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于20mL水，调节pH为3.0(用0.5mol/L盐酸溶液调节)并加入猪源胃蛋白酶(按其反应底物质量的1.0％添加)，在37℃搅拌1h后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，用0.1mol/L氢氧化钠将pH调至近中性，经过超滤膜进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制25mL浓度为120.0mg/mL的明胶溶液A，配制25mL浓度为100mg/mL海藻酸钠溶液B，A和B各自充分超声搅拌完全溶解后混合，添加2mL 15.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽溶液，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻(-40℃)干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
实施例3
步骤一：将40g榨油后的山茶油茶籽粕粉碎至60目，加入100mL水中用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11.0，充分搅拌2h后，离心过滤取上清液，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH为2.5至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于20mL水，调节pH为3.5(用0.5mol/L盐酸溶液调节)并加入猪源胃蛋白酶(按其反应底物质量的1.5％添加)，在37℃搅拌2h后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，用0.1mol/L氢氧化钠将pH调至近中性，经过超滤膜进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制25mL浓度为100.0mg/mL的明胶溶液A，配制25mL浓度为80mg/mL海藻酸钠溶液B，A和B各自充分超声搅拌完全溶解后混合，添加2mL 10.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽溶液，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻(-40℃)干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
对比例1
在37℃下配制25mL浓度为100.0mg/mL的明胶溶液A，配制25mL浓度为80mg/mL海藻酸钠溶液B，A和B各自充分超声搅拌完全溶解后混合进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻干燥48h，经过辐照灭菌，获得不含山茶油茶籽粕抗菌多肽的医用敷料。
对比例2
步骤一：将40g榨油后的山茶油茶籽粕粉碎至60目，加入800mL水中用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH为10.5，充分搅拌2h后，离心过滤取上清液，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH为3.0至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于20mL水，调节pH为3.0(用0.5mol/L盐酸溶液调节)并加入猪源胃蛋白酶(按其反应底物质量的1.0％添加)，在37℃搅拌1h后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，用0.1mol/L氢氧化钠将pH调至近中性，经过超滤膜进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制50mL浓度为120.0mg/mL的明胶溶液，然后添加2mL 15.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽溶液，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻(-40℃)干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
对比例3
步骤一：将40g榨油后的山茶油茶籽粕粉碎至60目，加入800mL水中用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH为10.5，充分搅拌2h后，离心过滤取上清液，用0.5mol/L盐酸溶液调节pH为3.0至产出沉淀，离心过滤得沉淀物，重新溶于20mL水，调节pH为3.0(用0.5mol/L盐酸溶液调节)并加入猪源胃蛋白酶(按其反应底物质量的1.0％添加)，在37℃搅拌1h后，升高温度至90℃持续10min将酶灭活，离心得上清液，用0.1mol/L氢氧化钠将pH调至近中性，经过超滤膜进行离心超滤，收集分子量小于10kDa的滤后液，冷冻干燥，获得山茶油茶籽粕抗菌肽；
步骤二：在37℃下配制50mL浓度为100mg/mL海藻酸钠溶液，然后添加2mL 15.0mg/mL的山茶油茶籽粕抗菌肽溶液，进行充分搅拌混匀，然后浇铸到8cm×8cm防水模具(厚度1mm)中，在-40℃下预冻后真空冷冻(-40℃)干燥48h，经过辐照灭菌，获得结构均匀的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料。
效果实施例
1.功效测试：
抗菌性能测试
1.1材料与方法
1.1.1受试物：实施例1～3制备的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料，以及对比例1～3制备的含有或不含山茶油茶籽粕抗菌多肽的医用敷料。
1.1.2实验菌体：大肠杆菌(BNCC336902)(北纳生物)
1.1.3实验材料：LB肉汤培养基、LB培养基，LB琼脂培养基、蒸馏水、生理盐水，以上都经121℃高压灭菌锅进行灭菌。
1.1.4实验方法
取实施例1、2、3中制备的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料1cm×1cm×1mm，与100μL 4×104CFU/mL的大肠杆菌菌液、2mL的LB培养基加入到8mL的生理盐水中并混匀，放入37℃、120r/min培养箱中1h，取100μL均匀涂布于LB琼脂平板，放入培养箱8～12小时，形成肉眼可见菌落。另取对比例1中不山茶油茶籽粕抗菌多肽的医用敷料1cm2作为对照，重复上述操作。
1.2测试结果：所得结果如表1和图1。
表1
实验序号 大肠杆菌抑菌率
实施例1 82.2％
实施例2 94.6％
实施例3 87.2％
对比例1 ＜1.0％
对比例2 90.1％
对比例3 91.7％
2.保湿性能测试：
2.1材料与方法
2.1.1受试物：实施例1～3制备的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料，以及对比例1～3制备的含有或不含山茶油茶籽粕抗菌多肽的医用敷料。
2.1.2实验材料：经烘干后的培养皿
2.1.3实验方法
取相同质量的实施例1、2、3和对比例1、2、3的敷料分别置于培养皿中，将各培养皿置于常温(25℃)下静置24h，测量各培养皿中敷料的前后质量，所得质量差即为对应敷料所挥发的水分。每组实验测试三次取平均值。
2.2测试结果：所得结果如表2。
表2
Figure BDA0002392944800000081
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。因此其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将榨油后的山茶油茶籽粕粉碎后加入水中，调节pH值至10.0～11.0，搅拌、离心、取上清，得到上清液A；然后调节上清液A的pH值至2.0～4.5使其产出沉淀，过滤，取沉淀物；再将沉淀物溶于水中，调节pH值至2.0～4.0并加入蛋白酶进行酶解反应，待反应结束后将酶灭活，离心、取上清，得到上清液B；最后将上清液B的pH值调节至中性，经过超滤膜超滤后冷冻干燥，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽；
(2)将步骤(1)中得到的山茶油茶籽粕抗菌多肽溶于水中，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽溶液；然后加入明胶溶液和海藻酸钠溶液，搅拌混合均匀，冷冻干燥，灭菌，得到山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料；
步骤(2)中所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽，明胶和海藻酸钠的质量比为12～30：2500～3000：1875～2500。
2.根据权利要求1所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的蛋白酶为胃蛋白酶；
步骤(2)中所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽溶液的浓度为5.0～15.0mg/mL；
步骤(2)中所述的明胶溶液的浓度为50.0～150.0mg/mL；
步骤(2)中所述的海藻酸钠溶液的浓度为50.0～150.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的蛋白酶为猪源胃蛋白酶；
步骤(2)中所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽溶液的浓度为10.0～15.0mg/mL；
步骤(2)中所述的明胶溶液的浓度为100.0～120.0mg/mL；
步骤(2)中所述的海藻酸钠溶液的浓度为75.0～100.0mg/mL。
4.根据权利要求3所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
所述的猪源胃蛋白酶的用量为按其反应底物质量的0.5％～2％计算。
5.根据权利要求1所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的酶解反应的条件为：37℃酶解1.0～2.0h。
6.根据权利要求1所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的超滤膜为截留分子量为10kDa的超滤膜。
7.根据权利要求1所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的粉碎为将山茶油茶籽粕粉碎至60～80目；
步骤(1)中所述的搅拌的时间为1～3h；
步骤(1)中所述的将酶灭活的条件为：90℃加热10min；
步骤(2)中所述的冷冻干燥的条件为：在-40℃下预冻后真空冷冻干燥48h；
步骤(2)中所述的灭菌为辐照灭菌。
8.一种山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。
9.权利要求8所述的山茶油茶籽粕抗菌多肽医用敷料在制备医用抗菌料或抗菌剂中的应用。
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