CN109045274B - 一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂及其用途，肠道调节剂为高F值寡肽，选自M1:Leu‑Leu‑Tyr‑Ala‑Ala‑Gly‑Ala、M2:Leu‑Leu‑Asp‑Val‑Tyr、M3:Leu‑Leu‑Phe‑Thr‑Thr‑Gln、M4:Leu‑Leu‑Tyr‑Val‑Tyr‑Gln或P1:Tyr‑Val‑Ser‑Trp‑Lys‑Leu。上述肠道调节剂在治疗溃疡性结肠炎方面的用途。有益效果为：本发明肠道调节剂能增加肠道中有益菌的增值并成为优势菌的同时减少肠道有害菌，从而改善了肠道的菌群结构，保持健康的肠道微生态环境，能辅助SASP治疗溃疡性结肠炎。

Description

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂及其用途

技术领域

本发明涉及水产加工技术领域，尤其是涉及一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂及其用途。

技术背景

海洋蛋白资源的开发一直是我国紧迫而重大的战略任务，我国的海洋捕捞除价值高的经济鱼类直接食用外，每年还有400多万吨的低值小杂鱼和300多万吨的加工废弃物，这些低值废弃物除少部分直接冷冻、绞碎用于喂养养殖鱼类外，其他绝大部分直接加工成低品质鱼粉作为饲料原料，由于国内加工鱼粉技术、设备落后，导致整个鱼粉加工行业生产成本高，产品质量差，甚至存在产品质量安全隐患。海洋生物资源在国民经济和人民生活中占有重要的地位，它除了提供优质高蛋白的食物外，也为医药卫生、化工、食品等工业提供了新的原料。我国是海洋生物资源的大国，但重要海洋生物资源的开发，尚处于相对初始的阶段。海洋生物种质(细胞、基因等)宝贵资源没有很好的研究，造成了资源的浪费。舟山有丰富的海洋渔业资源和众多的水产加工企业，每年几十万吨的水产加工废弃物。

F值(Fischer ratio)为氨基酸或是寡肽混合物中的支链氨基酸(BCAA:Val,Ile,Leu)与芳香族氨基酸(AAA:Trp,Tyr,Phe)的摩尔比值。由2-9个氨基酸通过缩合所形成的产物被称为寡肽，在寡肽所组成的混合小肽体系中，支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的摩尔比值大于20称之为高F值寡肽，具有保肝护肝、醒酒和抗疲劳等功效受到国内外学者的广泛研究，但高F值寡肽对肠道菌群结构的调节及辅助治疗溃疡性结肠炎的功效鲜有涉及。肠道菌群是人体或动物肠道内所寄生的微生物总成，人体中细胞的数量远远小于肠道菌群的数量。大肠埃希菌、粪杆菌、乳酸杆菌等细菌属于抓性厌氧菌，它们主要分布于结肠部位，是肠道屏障功能的重要组成部分。宿主与肠道菌群的关系有以下三种：共生菌，以长双歧杆菌、嗜乳酸杆菌等菌为代表的益生菌可以对宿主产生互利关系的一类菌；条件致病菌，例如大肠杆菌在正常条件下对机体无害，而当机体受致病菌侵染后会加剧宿主的损伤；致病菌，在正常条件下无法在机体肠道内长期定植，会直接导致宿主疾病的一类细菌，因此，利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂，该肠道调节剂为高F值寡肽，能增加肠道中有益菌的增值并成为优势菌的同时减少肠道有害菌，从而改善了肠道的菌群结构，保持健康的肠道微生态环境。

本发明的目的之二是提供一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂抗的溃疡性结肠炎模型的构建，该模型与人类溃疡性结肠炎在症状及组织学形态等方面表现相似；实验重复率高，模型持续时间较长，可体现出急性向慢性转化的动态过程。

本发明的目的之三是提供一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，本发明肠道调节剂对溃疡性结肠炎具有一定的治疗功能，辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的功效更优，能辅助SASP治疗溃疡性结肠炎。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂，肠道调节剂为高F值寡肽。肠道菌群与人体同时进化，为宿主提供自身所不具备的生化代谢通路与酶，为抵御外界因素所导致的机体异常构建了重要屏障，肠道菌群影响宿主着的能量代谢、免疫系统和炎症反应，与人体代谢密切相关，肠道微生物在与宿主相互作用时，宿主本身的基因型、年龄和饮食结构和营养的摄入等环境因素，会从不同方面影响着肠道菌群的形成及多样性组成，高F值寡肽具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收，而高F值寡肽的生物消化吸收率会受到肠道菌群的影响，反过来其也会改变生物体内肠道菌群的构成，增加肠道中有益菌的增值并成为优势菌的同时减少肠道有害菌，从而改善了肠道的菌群结构，保持健康的肠道微生态环境。

作为优选，高F值寡肽选自M1:Leu-Leu-Tyr-Ala-Ala-Gly-Ala、

M2:Leu-Leu-Asp-Val-Tyr、M3:Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln、

M4:Leu-Leu-Tyr-Val-Tyr-Gln或P1:Tyr-Val-Ser-Trp-Lys-Leu。

进一步优选，高F值寡肽为M3。寡肽M3可使肠道益生菌增殖，并且组成肽链的亮氨酸与改善中肠和后肠的免疫状态和物理屏障功能、调控细胞因子的基因转录有关，苏氨酸与肠道黏液素成分的改变有关。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的验证方法，挑选身高、体重相近、精力旺盛的小鼠，在正常饮食的基础上，灌胃1g/100mL高F值寡肽水解液，一周后处死小鼠，收集肠道内容物并进行肠道菌群DNA提取，提取的DNA使用nano drop2000进行浓度检测，并进行16s rRNA测序。使用高F值寡肽液灌胃后小鼠的肠道菌群出现了大量对机体有益的益生菌，而对照组肠道内菌群多为条件致病菌，说明高F值寡肽对于改善小鼠肠道菌群具有积极作用。

作为优选，灌胃量为0.1mL。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂抗的溃疡性结肠炎模型的构建，包括如下步骤：

S1.实验动物：选择清洁级Balb/c小鼠，七周龄，雄性，体重约18-23g，饲养于清洁级实验动物房中，温度为24℃，12h光照/黑暗循环，动物饲养使用标准鼠粮和水；

S2.造模方法、实验分组以及给药方案：实验小鼠首先进行适应性喂养7天，正常给予食物与水源，确认小鼠健康后进行后续实验，将小鼠按每组10只随机分为6组：空白组、病理模型组、低浓度寡肽组、高浓度寡肽组，阳性对照组SASP、SASP+寡肽组。本发明溃疡性结肠炎模型具有以下优点：与人类溃疡性结肠炎在症状及组织学形态等方面表现相似；实验重复率高，模型持续时间较长，可体现出急性向慢性转化的动态过程。

作为优选，溃疡性结肠炎模型为DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型。DSS的主要作用为抑制肠道上皮细胞的增殖，损伤肠道黏膜屏障，从而引发肠道菌群的紊乱和免疫功能的丧失。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，肠道调节剂在治疗溃疡性结肠炎方面的用途。

作为优选，肠道调节剂在辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的用途。M3寡肽及SASP摄入可以降低DSS诱导的炎症细胞因子IL-6和TNF-α在血液中的表达，同时提高抗炎型细胞因子IL-10在血清中的表达，且M3寡肽及SASP可以不同程度降低对机体有害菌的含量，同时提高有益菌含量，这些结果提示M3寡肽对溃疡性结肠炎具有一定的治疗功能，辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的功效更优，因此本发明肠道调节剂能辅助SASP治疗溃疡性结肠炎。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，包括如下步骤：

原料预处理：将水产加工下脚料绞碎，备用；

酶解：向绞碎的水产加工下脚料中加入水和胃蛋白酶，搅拌均匀后调节PH为1.8-2.2，而后在40-50℃下酶解4-6h，取出并置于100℃的水浴锅中灭酶8-12min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节PH为7后，加入风味酶搅拌至充分溶解，在50-60℃下酶解2-4h，取出并置于100℃水浴锅中灭酶10min，调节pH为2，即得酶解液；

脱色：向酶解液中加入活性炭，置于40-50℃下震荡2-4h，倒出溶液于4000-6000rpm条件下离心4-6min，上清液备用；

脱盐：将脱色后的上清液倒入半透膜中脱盐，脱盐后经截留分子量为2000Da的超滤膜超滤，于50℃进行旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得高F值寡肽，即为肠道调节剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明肠道调节剂为高F值寡肽，高F值寡肽能增加肠道中有益菌的增值并成为优势菌的同时减少肠道有害菌，从而改善了肠道的菌群结构，保持健康的肠道微生态环境；2)本发明构建的溃疡性结肠炎模型具有以下优点：与人类溃疡性结肠炎在症状及组织学形态等方面表现相似；实验重复率高，模型持续时间较长，可体现出急性向慢性转化的动态过程；3)本发明肠道调节剂对溃疡性结肠炎具有一定的治疗功能，辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的功效更优，能辅助SASP治疗溃疡性结肠炎。

附图说明

图1为本发明实施例DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠建模方法；

图2为本发明实施例1中各组小鼠肠道菌群Anosim分析；

图3为本发明实施例1中各组小鼠肠道内OTU Venn图分析；

图4为本发明实施例1中小鼠每日体重变化；

图5为本发明实施例1中各组小鼠血清中IL-10的水平；

图6为本发明实施例1中各组小鼠血清中TNF-α的水平；

图7为本发明实施例1中各组小鼠血清中IL-6的水平。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂，肠道调节剂为高F值寡肽。肠道菌群与人体同时进化，为宿主提供自身所不具备的生化代谢通路与酶，为抵御外界因素所导致的机体异常构建了重要屏障，肠道菌群影响宿主着的能量代谢、免疫系统和炎症反应，与人体代谢密切相关，肠道微生物在与宿主相互作用时，宿主本身的基因型、年龄和饮食结构和营养的摄入等环境因素，会从不同方面影响着肠道菌群的形成及多样性组成，高F值寡肽具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收，而高F值寡肽的生物消化吸收率会受到肠道菌群的影响，反过来其也会改变生物体内肠道菌群的构成，增加肠道中有益菌的增值并成为优势菌的同时减少肠道有害菌，从而改善了肠道的菌群结构，保持健康的肠道微生态环境。

上述高F值寡肽选自M1:Leu-Leu-Tyr-Ala-Ala-Gly-Ala、

M2:Leu-Leu-Asp-Val-Tyr、M3:Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln、

M4:Leu-Leu-Tyr-Val-Tyr-Gln或P1:Tyr-Val-Ser-Trp-Lys-Leu。

本发明实施例中，为了得到肠道调节效果，作为优选实施例，高F值寡肽为M3。寡肽M3可使肠道益生菌增殖，并且组成肽链的亮氨酸与改善中肠和后肠的免疫状态和物理屏障功能、调控细胞因子的基因转录有关，苏氨酸与肠道黏液素成分的改变有关。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的验证方法，将40只小鼠进行一周的适应性喂养后，挑选身高、体重相近、精力旺盛的小鼠，按每组十只随机分为三组，分别为M2组、M3组与空白组，在正常饮食的基础上，每天的18:00对各组小鼠均进行一次灌胃，灌胃量为每只小鼠0.1mL对应组别样品，具体灌胃方案如表1所示。一周后处死小鼠，收集肠道内容物并进行肠道菌群DNA提取，提取的DNA使用nano drop2000进行浓度检测，抽取每组浓度最高的五个样品进行16s rRNA测序。所有动物按照浙江海洋大学动物伦理委员会有关关规定进行。使用高F值寡肽液灌胃后小鼠的肠道菌群出现了大量对机体有益的益生菌，而对照组肠道内菌群多为条件致病菌，说明高F值寡肽对于改善小鼠肠道菌群具有积极作用。

表1小鼠分组以及给药方案

实验分组	动物数	灌胃药物
			空白组	10	生理盐水
M2寡肽组	10	1g/100mLM2寡肽溶液
			M3寡肽组	10	1g/100mLM3寡肽溶液

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂抗的溃疡性结肠炎模型的构建，包括如下步骤：

S1.实验动物：选择清洁级Balb/c小鼠，七周龄，雄性，体重约18-23g，饲养于清洁级实验动物房中，温度为24℃，12h光照/黑暗循环，动物饲养使用标准鼠粮和水；

S2.造模方法、实验分组以及给药方案：实验小鼠首先进行适应性喂养7天，正常给予食物与水源，确认小鼠健康后进行后续实验，将小鼠按每组10只随机分为6组：空白组、病理模型组、低浓度寡肽组、高浓度寡肽组，阳性对照组SASP、SASP+寡肽组，其中具体给药方案如表2和图1所示。该溃疡性结肠炎模型具有以下优点：与人类溃疡性结肠炎在症状及组织学形态等方面表现相似；实验重复率高，模型持续时间较长，可体现出急性向慢性转化的动态过程。

表2小鼠分组以及给药方案

实验分组	动物数	建模药物	灌胃药物
				空白组	10	饮用水	生理盐水
建模组	10	3％DSS	生理盐水
				低浓度寡肽组	10	3％DSS	1g/100mL肽溶液
高浓度寡肽组	10	3％DSS	3g/100mL肽溶液
				SASP组	10	3％DSS	2g/100mLSASP溶液
SASP+寡肽组	10	3％DSS	2g/100mLSASP+3g肽溶液

备注：柳氮磺吡啶(SASP)作为阳性对照药物，在临床上用于治疗对溃疡性结肠炎。

上述溃疡性结肠炎模型为DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型。DSS的主要作用为抑制肠道上皮细胞的增殖，损伤肠道黏膜屏障，从而引发肠道菌群的紊乱和免疫功能的丧失。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，肠道调节剂在治疗溃疡性结肠炎方面的用途。

上述肠道调节剂在辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的用途。M3寡肽及SASP摄入可以降低DSS诱导的炎症细胞因子IL-6和TNF-α在血液中的表达，同时提高抗炎型细胞因子IL-10在血清中的表达，且M3寡肽及SASP可以不同程度降低对机体有害菌的含量，同时提高有益菌含量，这些结果提示M3寡肽对溃疡性结肠炎具有一定的治疗功能，辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的功效更优，因此本发明肠道调节剂能辅助SASP治疗溃疡性结肠炎。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，包括如下步骤：

1)原料预处理：将水产加工下脚料绞碎，备用；

2)酶解：向绞碎的水产加工下脚料中加入水和胃蛋白酶，搅拌均匀后调节PH为1.8-2.2，而后在40-50℃下酶解4-6h，取出并置于100℃的水浴锅中灭酶8-12min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节PH为7后，加入风味酶搅拌至充分溶解，在50-60℃下酶解2-4h，取出并置于100℃水浴锅中灭酶10min，调节pH为2，即得酶解液；

3)脱色：向酶解液中加入活性炭，置于40-50℃下震荡2-4h，倒出溶液于4000-6000rpm条件下离心4-6min，上清液备用；

4)脱盐：将脱色后的上清液倒入半透膜中脱盐，脱盐后经截留分子量为2000Da的超滤膜超滤，于50℃进行旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得高F值寡肽，即为肠道调节剂。

实施例1：

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂，肠道调节剂为高F值寡肽。

上述高F值寡肽为M3:Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的验证方法，挑选身高、体重相近、精力旺盛的小鼠，在正常饮食的基础上，按灌胃量为0.1mL灌胃1g/100mL高F值寡肽水解液，一周后处死小鼠，收集肠道内容物并进行肠道菌群DNA提取，提取的DNA使用nano drop2000进行浓度检测，并进行16s rRNA测序。其检测结果为：

1)Anosim分析

本实施例样品的Anosim分析如图2所示，图中A代表M2寡肽组、B代表M3寡肽组、C代表空白组，R值为0.491＞0，而p值为0.001，远小于0.05，说明三组小鼠肠道菌群组成差异极其显著，且组间差异远大于组内差异，分组是成功的。

2)OTU Venn图分析

三个组的15个样品共得到个931个OTU，OTU的代表序列混合聚类结果如图3所示，图中A代表M2寡肽组、B代表M3寡肽组、C代表空白组，A组有456个OTU，6个OTU为特有；B组450个OTU，4个OTU为特有；C组889个OTU，430个OTU为特有，三组共享OTU为373个，占总OTU中的40.1％。说明灌胃寡肽液后，小鼠肠道内的特有菌群减少，肠道菌群的多样性降低。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂抗的溃疡性结肠炎模型的构建，溃疡性结肠炎模型为DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，包括如下步骤：

S1.实验动物：选择清洁级Balb/c小鼠，七周龄，雄性，体重约18-23g，饲养于清洁级实验动物房中，温度为24℃，12h光照/黑暗循环，动物饲养使用标准鼠粮和水；

S2.造模方法、实验分组以及给药方案：实验小鼠首先进行适应性喂养7天，正常给予食物与水源，确认小鼠健康后进行后续实验，将小鼠按每组10只随机分为6组：空白组、病理模型组、低浓度寡肽组、高浓度寡肽组，阳性对照组SASP、SASP+寡肽组；

S3.DNA的提取，血浆及结肠采集：给药的第十日中午12:00采血，采血前前禁食12h，采血前1h禁水，每组任意选取三只小鼠使用眼球取血法采血，摘取眼球后将血液立即收集到ep管中并放置于冰中，在4℃下使用8000转速离心10分钟，取上层清液后于-80℃保存备用，采血结束后使用脱臼法处死小鼠，收集结肠部位的肠道内容物和结肠，结肠放置于PBS缓冲液中备用，提取肠道内容物包含的肠道菌群DNA，使用Nano Drop2000进行上机检测，每组取一个DNA浓度高的样品进行送检，确定样品肠道菌群的组成分布情况。

结果为：

1)寡肽M3对溃疡性结肠炎小鼠体重和体态的影响

根据对试验期间小鼠的观察发现，构建病理模型期间的小鼠于第4天开始出现小面积的便血，腹泻等状况，第六天时出现大面积的便血并伴随食欲下降，懒动蜷缩，脱毛等情况，而空白组小鼠较为活跃，未出现上述情况。使用各组药品分别进行灌胃后，低浓度寡肽组小鼠便血、腹泻情况有一定程度缓解，具体表现为垫料中血液含量少于建模组，腹泻量减少；高浓度寡肽组小鼠便血情况基本得到缓解，腹泻量进一步减少，但依然存在；SASP组与SASP+寡肽组小鼠便血、腹泻等情况基本消失，且行为活跃程度明显高于低、高浓度寡肽组小鼠。

六组小鼠实验期间的体重变化如图4所示，DSS建模组小鼠的体重在第六天出现明显下降，空白组和建模组小鼠体重具有显著性差异。当使分别使用低、高浓度肽以及SASP和SASP的肽溶液进行灌胃后，小鼠体重下降程度有所缓解。提示寡肽M3对缓解溃疡性结肠炎所导致的体重下降有一定缓解作用，但纯肽疗效不如SASP药物治疗，其中SASP与M3肽段结合使用对缓解体重下降效果最为明显。

2)寡肽M3对溃疡性结肠炎小鼠血清IL-10水平的影响

IL-10主要由单核巨噬细胞所产生，它具有多向性生物活性抑制作用，主要免疫活性为抑制激活的单核巨噬细胞及细胞因子。有研究表明溃疡性结肠炎患者中IL-10的表达水平显著提高^[87]，从而调节肠道细胞达到免疫平衡，有效抑制单核细胞的活化，以及实现对各种促炎症细胞因子(如IL-6)的抑制。IL-10还可以维持肠道环境的动态平衡，这表明其在维持肠道粘膜生态平衡中具有重要作用。最近有研究表明^[88]，将正常人体肠道菌群移植到患有溃疡性结肠炎患者体内后，IL-10的水平明显提高，从而使得溃疡性结肠炎患者炎症得到缓解。

通过检测确定空白组、病理模型组、低浓度寡肽组、高浓度寡肽组、SASP组和SASP+寡肽组小鼠血清中IL-10含量，如图5所示。由图可见，小鼠建模组相比空白组血液中IL-10的表达显著下降，分别使用低、高浓度寡肽M3灌胃后的小鼠血清中的IL-10水平比建模组显著升高，使用特效治疗药物SASP后，血清中IL-10较高浓度肽组有显著提升，SASP与高浓度肽混合后较SASP相比可显著提升血清中IL-10含量。

3)寡肽M3对溃疡性结肠炎小鼠血清TNF-α水平的影响

TNF-α是一种非糖蛋白，当机体受到超抗原或内毒素的刺激后，主要由巨噬细胞，T细胞和单核细胞诱导产生，TNF-α水平的增加与组织损伤，如细胞凋亡，炎症和代谢等有关，同时TNF-α可以诱导炎细胞集合，进而提高IL-6及黏附分子的表达。有研究表明，TNF-α是生物免疫防御和内环境稳定的重要介质，其含量与溃疡性结肠炎所导致的粘膜损伤有着密切联系。

通过检测确定空白组、病理模型组、低浓度寡肽组、高浓度寡肽组、SASP组和SASP+寡肽组小鼠血清中TNF-α含量，如图6所示。由图可见，建模组小鼠血清中的TNF-α表达显著高于空白组，分别使用低，高浓度寡肽M3灌胃后的小鼠血清中TNF-α的表达显著降低建模组，使用药物SAS P治疗后，TNF-α的表达水平比高浓度肽组有显著降低，SASP与高浓度肽联合治疗后的小鼠血清TNF-α的表达水平比SASP组进一步下降。

4)寡肽M3对溃疡性结肠炎小鼠血清IL-6水平的影响

IL-6为分子量22-28KDa的一种糖蛋白，并且具有广泛的促炎功效，有研究表明，当溃疡性结肠炎发生时，IL-6水平的水平会显著升高，IL-6与TNF-α相互反应，导致溃疡性结肠炎活动期中的一系列炎症反应。

采用IL-6ELISA试剂盒检测空白组、建模组、低浓度肽组、高浓度肽组、SASP组和SASP+肽组小鼠血清中IL-6含量，结果如图7所示。由图可见，建模组小鼠血液中IL-6的表达显著高于空白组；与建模组相比，分别使用低，高浓度寡肽M3灌胃后小鼠血清中IL-6的表达显著降低，使用特效药物SASP治疗后，IL-6的表达水平比高浓度肽组有显著降低，SASP与高浓度肽联合治疗后的小鼠血清IL-6的表达水平进一步下降。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，肠道调节剂在辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的用途。

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，包括如下步骤：

1)原料预处理：将水产加工下脚料绞碎，备用；

2)酶解：向绞碎的水产加工下脚料中加入水和胃蛋白酶，搅拌均匀后调节PH为1.8，而后在40℃下酶解4h，取出并置于100℃的水浴锅中灭酶8min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节PH为7后，加入风味酶搅拌至充分溶解，在50℃下酶解2h，取出并置于100℃水浴锅中灭酶10min，调节pH为2，即得酶解液；

3)脱色：向酶解液中加入活性炭，置于40℃下震荡2h，倒出溶液于4000rpm条件下离心4min，上清液备用；

4)脱盐：将脱色后的上清液倒入半透膜中脱盐，脱盐后经截留分子量为2000Da的超滤膜超滤，于50℃进行旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得高F值寡肽，即为肠道调节剂。

实施例2：

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，包括如下步骤：

1)原料预处理：将水产加工下脚料绞碎，备用；

2)酶解：向绞碎的水产加工下脚料中加入水和胃蛋白酶，搅拌均匀后调节PH为2.2，而后在50℃下酶解6h，取出并置于100℃的水浴锅中灭酶12min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节PH为7后，加入风味酶搅拌至充分溶解，在60℃下酶解4h，取出并置于100℃水浴锅中灭酶10min，调节pH为2，即得酶解液；

3)脱色：向酶解液中加入活性炭，置于50℃下震荡4h，倒出溶液于6000rpm条件下离心6min，上清液备用；

4)脱盐：将脱色后的上清液倒入半透膜中脱盐，脱盐后经截留分子量为2000Da的超滤膜超滤，于50℃进行旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得高F值寡肽，即为肠道调节剂。

实施例3：

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，包括如下步骤：

称取60g鱿鱼碎肉并置于料理机中均质，均质后加入300mL蒸馏水溶解后置于烧杯中，加入6g胃蛋白酶搅拌至充分溶解后，使用浓盐酸调节PH为2，而后置于45℃恒温震荡水浴锅中震荡5h，取出并置于100℃的水浴锅中灭酶10min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节PH为7后，加入2.84g风味酶搅拌至充分溶解，放置于55℃恒温震荡水浴锅中震荡3h，取出并置于100℃水浴锅中灭酶10min，调节pH为2并加入10g活性炭置于45℃恒温震荡水浴锅中震荡3h，倒出溶液于离心管中离心5min，取上清液倒入半透膜中脱盐，脱盐完成后将均溶液分为两份，一份待用另一份进行超滤，超滤膜节流分子量为2000Da。随后将两份溶液于50℃进行旋蒸，最后冷冻干燥制得高F值寡肽粉末和高F值寡肽超滤液粉末，待用。

实施例4：

一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的制备方法，进一步优化步骤为：

原料预处理步骤中将水水产加工下脚料、蓖麻油和淀粉醚混合后绞碎，搅拌均匀，备用。其中蓖麻油和淀粉醚的添加量分别为水产加工下脚料重量的3.2-4.5％和0.3-0.6％。蓖麻油和淀粉醚能够在绞碎过程中起到润滑和缓释绞碎压力的作用，保护水产加工下脚料细胞不被破裂和水解，且绞碎后将下脚料颗粒包裹住，防止环境中的微生物会趁机侵袭，造成水产加工下脚料的腐败变质，保证水水产加工下脚料的新鲜度，从而制得优质的肠道调节剂。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的验证方法，所述肠道调节剂为高F值寡肽，其序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln，所述验证方法为：挑选身高、体重相近、精力旺盛的小鼠，在正常饮食的基础上，灌胃1g/100mL高F值寡肽水解液，一周后处死小鼠，收集肠道内容物并进行肠道菌群DNA提取，提取的DNA使用nano drop2000进行浓度检测，并进行16s rRNA测序。

2.根据权利要求1所述的一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的验证方法，其特征在于：所述灌胃量为0.1mL。

3.一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，其特征在于：所述肠道调节剂用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物，所述肠道调节剂为高F值寡肽，其序列为Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln。

4.根据权利要求3所述的一种利用水产加工下脚料制备的肠道调节剂的用途，其特征在于：所述肠道调节剂用于 制备辅助SASP治疗溃疡性结肠炎的药物。

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