CN101886107A - 一种酶法制备马氏珠母贝高f值寡肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,涉及酶催化水解马氏珠母贝肉蛋白以及采用有效分离手段脱除酶解液中的芳香族氨基酸,提供了一种采用酶催化水解马氏珠母贝肉蛋白再经过吸附剂吸附和分离脱除作用,制备分子量在2000Da以下,F值(支链氨基酸与芳香族氨基酸摩尔比值)大于20的寡肽混合物的方法。本发明首次以水产动物蛋白为原料制备高F值寡肽;制备过程中先对原料进行热水抽提,抽提液可进行牛磺酸的提取,沉淀蛋白作为酶解底物,充分有效利用了资源;选择出单一酶——胰酶作为最适作用酶种类;采用活性炭静态吸附与凝胶过滤层析相结合方法脱除芳香族氨基酸制备得到高F值寡肽制品。
Description
技术领域
本发明属于一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法。
背景技术
活性肽是功能保健食品中的一类重要的功能性因子。目前市场上的活性肽大多是用大豆分离蛋白、乳蛋白等价格较贵的蛋白源。采用这些种类的原料作为底物蛋白,产品的成本高且售价昂贵。
马氏珠母贝(Pinctada martensii)又名合浦珠母贝,是我国南方海水珍珠养殖的主要品种。主要分布于我国广东、广西、海南和台湾沿海,日本沿海以及比利亚沿岸海域也有分布。随着珍珠养殖业的发展,广东省的海水珍珠养殖面积已超过5万亩,年产原珠20多万吨。如加上海南、广西两省采珠后的珍珠贝肉,珍珠贝肉的数量则相当可观。但目前,珍珠贝肉除一部分以鲜销供食用之外,相当量的资源因缺乏有效的加工手段而未能得到充分利用。珍珠自古以来就是中医的名贵药材,具有清热解毒、安神定惊、平肝明目、收敛生肌等功效。研究显示产珠的马氏珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪、低糖、营养价值很高的海产品,富含牛磺酸、多不饱和脂肪酸(EPA、DHA)、多种矿物质、微量元素和维生素,并具有清热解毒、镇静镇惊、平肝潜阳和治疗妇女血崩等功效,其有效成份含量比珍珠层粉还高。高F值寡肽是一类含有高支链氨基酸和低芳香族氨基酸的特殊生物活性寡肽混合物,其不仅具有治疗肝性脑病,改善肝昏迷程度和精神状态,对于酒精、药物等所引起的急慢性肝损伤也起到了积极的保肝护肝作用。F值是支链氨基酸(即缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)与芳香族氨基酸(即酪氨酸、苯丙氨酸)含量的摩尔比值。大量的研究表明:肝病患者血浆F值比正常人血浆F值低得多,而补充高支低芳的高F值制品可以使患者血浆F值及血氨浓度恢复正常水平,从而减轻肝病患者的症状以及直接纠正体内的代谢异常。马氏珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪的海产品,并具有清热解毒、平肝潜阳等功效,将其开发成马氏珠母贝高F值寡肽制品是一种合理利用此资源提高其经济价值的重要途径。由于酶具有作用条件温和、专一性强、催化效率高等特点,因此,利用可控酶技术作用马氏珠母贝肉蛋白,然后,将酶解产物中的游离芳香族氨基酸去除得到高F值寡肽制品是一种经济可行的方法。
不同来源的蛋白质其氨基酸组成,蛋白质结构存在差异。自20世纪70年代后期,首次报道以鱼蛋白和大豆分离蛋白为原料制得高F值寡肽后,相继30多年来报道了以鱼蛋白、乳清蛋白、玉米醇溶蛋白、葵花籽浓缩蛋白、酪蛋白为原料,经酶解制得高F值寡肽。众所周知,作为原料,一般选择原则是资源丰富,蛋白含量高,可提高附加值,而作为高F值寡肽产品对原料蛋白的氨基酸组成更有特殊要求,在有效开发利用资源的基础上应尽量选择支链氨基酸含量相对较高而芳香族氨基酸含量相对较低的原料蛋白。然而,从蛋白原料的开发利用来看,采用水产蛋白原料用于制备高F值寡肽的研究比较少,特别是贝类蛋白的研究基本是空白。所以,开发利用此类蛋白资源具有重要的现实意义。
酶种类的选择和芳香族氨基酸的去除是制备高F值的寡肽的关键步骤,已有的专利特点多采用两种酶进行酶解,本专利采用单一的酶种类胰酶,并且胰酶是商业用酶,价格相对较低,可用于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,采用单一的酶种类胰酶,胰酶是商业用酶,价格相对较低,可用于工业化生产。
本发明将马氏珠母贝清洗干净,去壳取全脏器,然后去足丝,采用匀浆机进行匀浆3-5分钟,然后按1∶8-1∶5比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10-20分钟,冷却至室温,离心力6000×g离心20min,去除漂浮于上部的脂肪及上清液,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀,上清液用于提取牛磺酸;然后将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4pH8.0的缓冲溶液,高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入0.5%-1.5%的胰酶,在温度40-55℃条件下水解5-7小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液;取上清液50mL,采用1~2mol/L HCl调整pH值在2-5之间,在温度为25℃-35℃条件下,按料液比1∶10-1∶30加入食品级活性炭,吸附3-5h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液;取上清液2-5mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300-1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
所述的马氏珠母贝肉蛋白是由珍珠养殖场收购的马氏珠母贝去壳取全脏器,然后去足丝,将马氏珠母贝全脏器采用匀浆机进行匀浆3分钟,然后按1∶8-1∶5比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10-20分钟,冷却至室温,离心力6000×g离心20min,去除漂浮于上部的脂肪及上清液,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀,上清液可用于提取牛磺酸。
所述的复合酶为胰酶,酶解产物的制备如下:将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH7-9的缓冲溶液,在进行水解前,先将底物蛋白采用高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入0.5%-1.5%的胰酶,在温度40-55℃条件下水解5-7小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液。
所述的酶解液中芳香族氨基酸的去除,其步骤如下,首先将上述得到的马氏珠母贝胰酶酶解产物(蛋白质利用率>80%,水解度>25%)置于容器中,采用1~2mol/L HCl调整pH值在2-5之间,在温度为25-35℃条件下,按料液比1∶10~1∶30之间加入食品级活性炭,吸附3-6h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液。取上清液2-5mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300~1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
本发明首次以海洋贝类资源马氏珠母贝肉为原料制备高F值寡肽,该发明具有以下几个优点和特点。
1.首次以水产动物蛋白为原料制备高F值寡肽;
2.制备过程中先对原料进行热水抽提,抽提液可进行牛磺酸的提取,沉淀蛋白作为酶解底物,充分有效利用了资源;
3.选择出单一酶——胰酶作为最适作用酶种类;
4.采用活性炭静态吸附与凝胶过滤层析相结合方法脱除芳香族氨基酸制备得到高F值寡肽制品。
附图说明
图1是本发明的马氏珠母贝胰酶酶解产物活性炭吸附后凝胶过滤层析图谱;
图2是本发明马氏珠母贝高F值寡肽分子量分布质谱图;
图3是本发明马氏珠母贝高F值寡肽的氨基酸分析图谱。
具体实施实例
本发明的技术方案按如下所述实现:
首先,将由珍珠养殖场收购的马氏珠母贝去壳取全脏器,然后去足丝,将马氏珠母贝全脏器采用匀浆机进行匀浆3分钟,然后按1∶8比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10分钟,冷却至室温,离心力6000×g离心20min,去除漂浮于上部的脂肪及上清液,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀,上清液可用于提取牛磺酸。
本发明使用的复合酶为胰酶,酶解产物的制备如下:将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH7-9的缓冲溶液,在进行水解前,先将底物蛋白采用高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入0.5%-1.5%的胰酶,在温度40-55℃条件下水解5-7小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液。
本发明所得酶解液蛋白质回收率达到80%以上,水解度达到25%以上。蛋白质回收率定义为酶解产物中的蛋白占底物原料蛋白的百分含量,采用凯氏定氮法分别测定酶解原料及酶解液中总氮含量,并按下式计算:
蛋白质水解度的测定采用甲醛滴定法,具体的方法如下:首先采用甲醛滴定法测定样品中的α-氨态氮含量,然后根据下式计算水解度。
本发明的第二个关键技术点是酶解液中芳香族氨基酸的去除,其步骤如下,首先将上述得到的马氏珠母贝胰酶酶解产物(蛋白质利用率>80%,水解度>25%)置于容器中,采用1~2mol/L HCl调整pH值在2-5之间,在温度为25-35℃条件下,按料液比1∶10~1∶30之间加入食品级活性炭,吸附3-6h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液。取上清液2-5mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300~1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
高F值寡肽制品的分子量确定在收集组分时候先上标准品,根据寡肽要求的分子量分布确定洗脱收集时间,流动相采用可挥发的0.05~0.1mol/LNH2HCO3,分子量标准品:Glu-Cys-Gly(307Da),酪氨酸(181Da),抑肽酶(6500Da),杆菌肽(1400Da)。采用AKTA purify仪器测定及收集,根据标准品的洗脱时间以及280nm吸收值低,214nm吸收值高的目标组分。
实施例1
将马氏珠母贝清洗干净,去壳取全脏器,然后去足丝,采用匀浆机进行匀浆3分钟,然后按1∶8比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10分钟,冷却至室温,离心力6000×g离心20min,去除漂浮于上部的脂肪及上清液,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀,上清液用于提取牛磺酸。然后将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4 pH8.0的缓冲溶液,高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入1.0%的胰酶,在温度50℃条件下水解6小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液。取上清液50mL,采用1mol/L HCl调整pH值在2.5之间,在温度为25℃条件下,按料液比1∶30加入食品级活性炭,吸附3h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液。取上清液2mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300-1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
Claims (4)
1.一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,将马氏珠母贝清洗干净,去壳取全脏器,然后去足丝,采用匀浆机进行匀浆3分钟,然后按一定比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10分钟,冷却至室温,离心20min,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀;然后将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4pH8.0的缓冲溶液,高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入0.5%-1.5%的胰酶,在温度40-55℃条件下水解5-7小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液;取上清液50mL,采用1~2mol/L HCl调整pH值在2-5之间,在温度为25℃-35℃条件下,按料液比1∶10-1∶30加入食品级活性炭,吸附3-5h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液;取上清液2-5mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300-1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
2.据权利要求1所述的一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,其特征是所述的马氏珠母贝肉蛋白是由珍珠养殖场收购的马氏珠母贝去壳取全脏器,然后去足丝,将马氏珠母贝全脏器采用匀浆机进行匀浆3分钟,然后按1∶8比例(w/v)加入蒸馏水,煮沸10分钟,冷却至室温,离心力6000×g离心20min,去除漂浮于上部的脂肪及上清液,收集马氏珠母贝肉蛋白沉淀,上清液可用于提取牛磺酸。
3.据权利要求1所述的一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,其特征是所述的复合酶为胰酶,酶解产物的制备如下:将马氏珠母贝肉蛋白置于反应容器中,然后加入0.1mol/L Na2HPO4-NaH2PO4pH7-9的缓冲溶液,在进行水解前,先将底物蛋白采用高速均质机进行均质,然后将反应混合物置于恒温水浴锅中预热5分钟,加入0.5%-1.5%的胰酶,在温度40-55℃条件下水解5-7小时,当水解结束后,将反应混合物置于95℃水浴锅中灭酶10min,冷却至室温后于10℃,10000r/min离心20min,收集上清液。
4.据权利要求1所述的一种酶法制备马氏珠母贝高F值寡肽的方法,其特征是所述的酶解液中芳香族氨基酸的去除,其步骤如下,首先将上述得到的马氏珠母贝胰酶酶解产物(蛋白质利用率>80%,水解度>25%)置于容器中,采用1~2mol/L HCl调整pH值在2-5之间,在温度为25-35℃条件下,按料液比1∶10~1∶30之间加入食品级活性炭,吸附3-6h,然后4000rmp离心20min,过滤得上清液。取上清液2-5mL,上Bio-gel P2凝胶柱,收集280nm吸收值低,214nm吸收值高,分子量范围在300~1800Da的组分即为马氏珠母贝高F值寡肽制品。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101117 |