CN104004087B - 一种水蛭高f值寡肽及其酶解制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括：（1）水蛭干体初步清洗除杂，高速粉碎；（2）原料碱预浸泡；（3）碱性蛋白酶Alcalase AF 2.4L结合木瓜蛋白酶双酶水解；（4）采用活性炭粉静态吸附脱除芳香族氨基酸；（5）以凝胶过滤层析柱进一步分离纯化，收集分离产物，冷冻干燥，获得分子量低于2000Da，F值（Fischer ratio，即支链氨基酸与芳香族氨基酸摩尔含量的比值）高于20的水蛭寡肽粉。本发明公开的制备过程简单，选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶两种商业用酶，易于工业生产，产率较高，具有一定的抗凝血效果，并为高F值类产品增加了新来源。

Description

一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用。
背景技术
高F值寡肽是一种支链氨基酸和芳香族氨基酸摩尔数比值大于20的生物活性寡肽混合物。它不仅能减轻肝性脑病症状、改善肝功能和肝昏迷程度，还对蛋白质营养失常患者有积极作用。在实际生产中，高F值寡肽可以广泛应用在治疗肝脏疾病的药品、护肝食品、外科手术病人的蛋白营养食品、消化酶缺乏患者的肠道营养剂和高强度劳动者的食品营养强化剂等方面。高F寡肽混合物较支链氨基酸配方更具有实际效用，其独特生理功能已受到多方人士的高度关注，具有良好的发展前景。
水蛭俗称蚂蝗，是中国传统的药用水生动物，具有治疗中风、淤血肿痛、高血压、闭经等疾病的功效，其中以宽体金线蛭最为常见。宽体金线蛭(WhitmaniaPigra)，隶属于真蛭亚纲(Euhirdinea)、无吻蛭目(Arhynchobdelliada)、黄蛭科(Haemopidae)、金线蛭属(Whimania)，《中国药典》2010年版中记载为“蚂蝗W.pigra Whitman”，广泛分布于我国大部分地区的湖泊、池塘及水田，其干体的蛋白含量在70％～80％之间，是目前我国中药材市场中主流的水蛭品种。国内中药材市场上的主流药用水蛭品种。好几个世纪以前，人类就已经成功利用水蛭进行相关疾病预防和治疗，但是，随着医疗技术的不断发展，能起相同疗效的药物如阿司匹林、硝酸甘油等的相继出现，水蛭的作用渐渐被被世人所遗忘。目前，市面上的水蛭产品主要以抗凝血、抗血栓为主，产品种类较为单一，因此探索水蛭更丰富的应用潜能，开发一种方法简便、成本较低、容易吸收的水蛭高F值寡肽具有一定的市场价值。本发明以水蛭干粉作为原料，利用酶工程技术和现代分离纯化技术，生产一种纯天然、易吸收的高F值生物活性寡肽混合物，这一研究为宽体金线蛭资源的合理运用开发提供依据，为进一步提高其附加值提供重要的运用途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用。本方法所采用的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶为商业用酶，价格相对低廉，易于实现工业化。
本发明的目的由以下方案实现：
(1)将水蛭干燥体用清水洗净，并于去离子水中浸泡8～24h，再于分析纯乙醇中浸泡8～24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4～-20℃冷藏备用；
(2)称步骤(1)得到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉与水重量比为1～8：100配制悬浊液，调整pH至8～11，浸泡10～60min，再调节pH至7.5～11，加入碱性蛋白酶，反应温度保持在30～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，灭酶活，冷却，4000～10000r/min离心5～20min，收集上清液，调节pH至7～10，加入木瓜蛋白酶，反应温度保持在25～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，灭酶活，冷却，4000～10000r/min离心5～20min，收集上清液，调整pH至2～7，按活性炭重量与上清液体积比0.2～20g：100mL加入活性炭，在25～60℃下吸附30～100min，4000～10000r/min离心5～30min，收集上清液；
(3)装柱：根据层析柱体积称量适量Sephadex G-15凝胶填料进行溶胀处理，排除破碎颗粒，按照1.6×120cm的规格填层析柱，以去离子水冲柱稳定；
(4)Sephadex G-15凝胶过滤：加入经活性炭静态吸附的酶解液，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥，得到水蛭高F值寡肽粉。
优选地，所述的水蛭为宽体金线蛭Whitmania Pigra。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述pH调至以8～11，调节pH至7.5～11，调节pH至7～10具体为：用0.1-2mol/L NaOH将pH调至所述pH值；所述收集上清液，调整pH至2～7具体为：用0.1-2mol/L的HCl将pH调至2～7。
优选地，所添加的碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶活力3.9323×105U/mL，所添加的木瓜蛋白酶为Papain，酶活力0.8231×105U/g。
优选地，所述碱性蛋白酶添加量为4000～15000U/g pro，优选6000～13000U/gpro；所述木瓜蛋白酶添加量为按2000～10000U/g pro，优选2000～8000U/g pro。
优选地，所添加的活性炭为针剂型活性炭，用于吸附酶解液中的芳香族氨基酸，添加活性炭重量与上清液体积比为0.5～10g：100mL。
优选的，步骤(3)中所述凝胶填料为Sephadex G-15。
一种水蛭高F值寡肽，所述水蛭高F值寡肽的分子量在300—1500Da；所述F值为20.0—30.0。
一种水蛭高F值寡肽应用于制备高F值寡肽功能性食品，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1.首次以水蛭作为原料制备高F值寡肽；
2.制备过程简单，选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶两种商业用酶，易于工业生产；
3.采用活性炭结合凝胶层析结合方法脱出芳香族氨基酸，芳香族氨基酸消除率在90％以上，并获得F值大于20的寡肽产品；
4.分子量在300-1500Da，易于肠道吸收。
附图说明
图1是本发明Sephadex G-15凝胶层析柱标准品图谱；
图2是本发明活性炭吸附后水蛭酶解产物Sephadex G-15凝胶层析图谱；
图3是本发明水蛭高F值寡肽质谱图。
具体实施实例
下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
以下实施例中的蛋白回收率和水解度按照下列公式得出：
1.蛋白回收率。
采用凯氏定氮法测定酶解产物中蛋白质含量占总蛋白质含量的百分比，计算公式如下：
R ( % ) = m 1 m 0 × 100 %
式中：m1——酶解产物中蛋白质含量；
m0——总蛋白质含量。
2.蛋白质水解度。
水解度采用pH-stat法，以酶解过程中消耗经标定的NaOH的用量进行计算，公式如下：
式中：B——滴定过程中消耗的碱液体积；
Nb——碱液的浓度，mol/L；
α——氨基酸的解离度，[10(pH-pK)]/[1+10(pH-pK)]，pK按7.0计算；
MP——底物中蛋白的总量，g；
htot——单位质量底物中蛋白质肽键的总数，mmol/g，宽体金线蛭蛋白ht，7.94mmol/g。
实施例1
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡12h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为5：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至10，浸泡20min；再将pH调为9，按8000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心5min，收集上清液，调整pH至7.0，按4000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心5min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到83％，水解度达到30％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至5.0，按照活性炭重量和上清液体积比2g：100mL加入活性炭，在30℃下吸附90min，10000r/min离心10min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为21.15的水蛭高F值寡肽粉。
实施例2
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡10h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为8：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至11，浸泡50min；再将pH调为10，按6000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在50℃，酶解3h；煮沸20min，灭酶活，冷却，6000r/min离心10min，收集上清液，调整pH至8.0，按6000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解3h；煮沸15min，灭酶活，冷却，6000r/min离心10min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到80％，水解度达到28％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至6.0，按照活性炭重量和上清液体积比3g：100mL加入活性炭，在40℃下吸附60min，8000r/min离心15min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.05的水蛭高F值寡肽粉。
实施例3
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡15h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为2：100配制悬浊液，，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至8，浸泡60min；再将pH调为8.5，按6000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，5000r/min离心20min，收集上清液，调整pH至7.0，按5000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在55℃，酶解2.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心10min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到81％，水解度达到29％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至5.5，按照活性炭重量和上清液体积比4g：100mL加入活性炭，在35℃下吸附80min，9000r/min离心15min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.85的水蛭高F值寡肽粉。
实施例4
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡15h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为7：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至9，浸泡30min；再将pH调为8.5，按9000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4h；煮沸15min，灭酶活，冷却，7000r/min离心20min，收集上清液，调整pH至8.0，按6000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心15min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到78.2％，水解度达到28.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至4，按照活性炭重量和上清液体积比5g：100mL加入活性炭，在40℃下吸附50min，8000r/min离心15min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.15的水蛭高F值寡肽粉。
实施例5
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡10h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为8：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至11，浸泡30min；再将pH调为9，按10000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3h；煮沸10min，灭酶活，冷却，6000r/min离心20min，收集上清液，调整pH至7.5，按5000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解3.5h；煮沸20min，灭酶活，冷却，7000r/min离心15min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到84.2％，水解度达到32.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至4.5，按照活性炭重量和上清液体积比0.8g：100mL加入活性炭，在30℃下吸附55min，10000r/min离心10min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为21.10的水蛭高F值寡肽粉。
实施例6
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡8h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为4：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至10，浸泡40min；再将pH调为8.5，按7000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在55℃，酶解3.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心15min，收集上清液，调整pH至7.0，按5500U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解2.5h；煮沸20min，灭酶活，冷却，9000r/min离心15min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到83.2％，水解度达到31.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至4，按照活性炭重量和上清液体积比0.6g：100mL加入活性炭，在30℃下吸附80min，9000r/min离心15min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.07的水蛭高F值寡肽粉。
实施例7
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡14h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为5：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至10.5，浸泡30min；再将pH调为9，按9000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3h；煮沸15min，灭酶活，冷却，9000r/min离心10min，收集上清液，调整pH至8.0，按3500U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在50℃，酶解4.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心10min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到79.2％，水解度达到27.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至5，按照活性炭重量和上清液体积比0.5g：100mL加入活性炭，在40℃下吸附65min，8000r/min离心10min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.12的水蛭高F值寡肽粉。
实施例8
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡9h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为7：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至9.5，浸泡35min；再将pH调为9.5，按6000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，7000r/min离心20min，收集上清液，调整pH至6.5，按4500U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4h；煮沸15min，灭酶活，冷却，7000r/min离心15min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到81.22％，水解度达到30.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至4.5，按照活性炭重量和上清液体积比1.5g：100mL加入活性炭，在40℃下吸附80min，6500r/min离心15min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.79的水蛭高F值寡肽粉。
实施例9
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡12h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为6：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至11，浸泡30min；再将pH调为8.5，按8000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4h；煮沸15min，灭酶活，冷却，9000r/min离心10min，收集上清液，调整pH至7.0，按5000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在65℃，酶解3.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，10000r/min离心8min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到86.22％，水解度达到33.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至5.5，按照活性炭重量和上清液体积比2g：100mL加入活性炭，在30℃下吸附70min，7500r/min离心20min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为21.05的水蛭高F值寡肽粉。
实施例10
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡11h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为8：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至10.5，浸泡25min；再将pH调为9.0，按8500U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4.5h；煮沸15min，灭酶活，冷却，7500r/min离心15min，收集上清液，调整pH至7，按5000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在55℃，酶解3.5h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心15min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到82.22％，水解度达到31.6％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整PH至5.5，按照活性炭重量和上清液体积比2.5g：100mL加入活性炭，在35℃下吸附85min，8000r/min离心10min，收集上清液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥得F值为20.38的水蛭高F值寡肽粉。
实施例11
取500g水蛭干体清洗干净，并以去离子水和乙醇分别浸泡12h，置于45℃烘箱烘至含水量小于3％，高速粉碎成细粉，加水溶解，按干粉与水重量比为5：100配制悬浊液，并以高速均质机进行均质，然后以1mol/LNaOH调整pH至10，浸泡30min；再将pH调为9.0，按8000U/g pro加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4.0h；煮沸15min，灭酶活，冷却，8000r/min离心10min，收集上清液，调整pH至8.0，按4000U/g pro加入木瓜蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，反应温度保持在60℃，酶解4.0h；煮沸10min，灭酶活，冷却，8000r/min离心10min，收集上清液，制得酶解液。其中蛋白质回收率达到30％，水解度达到28％。然后以1mol/L的盐酸(HCl)调整pH至5，按照活性炭重量和上清液体积比2.0g：100mL加入活性炭，在30℃下吸附90min，8000r/min离心10min，收集上清液。将0.20g杆菌肽和0.25g谷胱甘肽的50mL混合标准品溶液，过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，在紫外214nm检测吸光值，出峰情况见图1，第一个峰为杆菌肽的出峰，第二个为谷胱甘肽的出峰。再将上清液过Sephadex G-15凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，出峰情况如图2，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，即图2中最大组分FP，富集浓缩，冷冻干燥得F值为21.15的水蛭高F值寡肽粉。将10μL组分FP注入飞行时间质谱仪，进行ESI-MS检测，检测结果如图3，多肽的分布范围较广，主要集中在200-874m/z范围。
上述实施例为本发明较佳的方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将水蛭干燥体用清水洗净，并于去离子水中浸泡8~24h，再于分析纯乙醇中浸泡8~24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4~-20℃冷藏备用；
（2）称步骤（1）得到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉与水重量比为1~8：100配制悬浊液，调整pH 至8~11，浸泡10~60min，再调节pH至7.5~11，加入碱性蛋白酶，反应温度保持在30~80℃，酶解1~6h；煮沸5~30min，灭酶活，冷却，4000~10000r/min离心5~20min，收集上清液，调节pH至7~10，加入木瓜蛋白酶，反应温度保持在25~80℃，酶解1~6h；煮沸5~30min，灭酶活，冷却，4000~10000r/min离心5~20min，收集上清液，调整pH至2~7，按活性炭重量与上清液体积比0.2~20g：100mL加入活性炭，在25~60℃下吸附30~100min，4000~10000r/min离心5~30min，收集上清液，过凝胶过滤层析，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥，得到水蛭高F值寡肽。
2.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：所述的水蛭为宽体金线蛭Whitmania Pigra。
3.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述pH调至8~11，调节pH至7.5~11，调节pH至7~10具体为：用0.1-2mol/L NaOH将pH调至所述pH值；所述收集上清液，调整pH至2~7具体为：用0.1-2mol/L的HCl将pH调至2~7。
4.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：所添加的碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶活力3.9323×105U/mL，所添加的木瓜蛋白酶为Papain，酶活力0.8231×105U/g。
5.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶添加量为4000~15000U/g pro，所述木瓜蛋白酶添加量为2000~10000U/g pro。
6.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶添加量为6000~13000U/g pro，所述木瓜蛋白酶添加量为2000~8000U/g pro。
7.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：所添加的活性炭为针剂型活性炭，添加活性炭重量与上清液体积比为0.5~10g：100mL。
8.根据权利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述凝胶填料为Sephadex G-15。
9.由权利要求1-8任意一项所述的制备方法制备得到的水蛭高F值寡肽，其特征在于：所述水蛭高F值寡肽的分子量在300—1500Da；所述F值为20.0—30.0。
10.权利要求9所述的水蛭高F值寡肽应用于制备高F值寡肽功能性食品的用途，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349601A (zh) * 2015-11-17 2016-02-24 常熟理工学院 一种具有抗菌活性的水蛭多肽锌螯合物的制备方法
CN105418741B (zh) * 2016-01-21 2018-10-26 山东大学（威海） 一种水蛭多肽的分离纯化方法
CN105646694A (zh) * 2016-02-23 2016-06-08 浙江海洋学院 一种鲨鱼鱼肉高f值寡肽
CN105707905A (zh) * 2016-02-23 2016-06-29 浙江海洋学院 一种鲨鱼鱼肉高f值寡肽的用途
CN105648009A (zh) * 2016-02-23 2016-06-08 浙江海洋学院 一种鲨鱼鱼肉高f值寡肽的制备方法
CN105685978A (zh) * 2016-02-23 2016-06-22 浙江海洋学院 一种鲨鱼鱼肉高f值寡肽片剂
CN107177651A (zh) * 2017-05-11 2017-09-19 浙江海洋大学 双酶水解法制备高f值寡肽粗液
CN107164440A (zh) * 2017-05-11 2017-09-15 浙江海洋大学 高f值寡肽粗液分离纯化方法
CN107348092A (zh) * 2017-07-11 2017-11-17 浙江丰宇海洋生物制品有限公司 一种利用鱼溶浆生产蛋白粉产品的方法
CN109620847B (zh) * 2018-12-11 2022-07-26 山东沃华医药科技股份有限公司 一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法
CN109731547B (zh) * 2019-01-29 2020-12-29 江南大学 一种高效吸附脱芳的改性活性炭及其制备方法
CN110468174A (zh) * 2019-08-21 2019-11-19 北京中医药大学 一种水蛭活性寡肽的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101012472A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 东北农业大学 高f值蛋清寡肽的制备方法
CN101886107A (zh) * 2010-07-02 2010-11-17 广东海洋大学 一种酶法制备马氏珠母贝高f值寡肽的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080280019A1 (en) * 2006-04-11 2008-11-13 W.I. System Co., Ltd. Powdered health food

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101012472A (zh) * 2007-02-07 2007-08-08 东北农业大学 高f值蛋清寡肽的制备方法
CN101886107A (zh) * 2010-07-02 2010-11-17 广东海洋大学 一种酶法制备马氏珠母贝高f值寡肽的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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蛋清高F值寡肽可控酶解条件的筛选及其制备技术的研究;赵法利;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》;20070915(第03期);全文 *

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