CN108486203A - 一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，该方法将松花粉粕经过粉碎和超高压均质后，在恒温恒pH条件下进行蛋白酶酶解，并且用乙醇沉淀除杂，进而通过减压浓缩和喷雾干燥，得到易保存、有抗疲劳活性的松花粉肽。按照本发明方法得到的具有抗疲劳活性的松花粉肽平均分子量为500‑2000Da，且通过动物实验证实其抗疲劳活性显著提高。本发明制备方法简单，安全性高，具有显著的抗疲劳活性，不仅解决了松花粉生产过程中造成的环境压力，也降低了抗疲劳肽的生产成本，实现了资源的高效利用，可用于开发优质的天然抗疲劳食品。

Description

一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用松花粉粕制备具有抗疲劳活性的松花粉肽的方法，属于活性肽的制备技术领域。
背景技术
疲劳已成为了当今社会普遍存在的社会问题。长期疲劳无法缓解会严重影响居民健康，甚至危及生命。据WHO调查，全球有至少35％居民处于疲劳状态，其中中年男性占比更高达60％。促进疲劳恢复和延缓疲劳已成为了运动医学、军事医学和食品科学等领域学者们致力解决的重大问题。抗疲劳功能性食品是近年来发展较快的一类缓解疲劳物质，既包括牛磺酸、辣椒素、蒜素等物质，也包括大豆低聚肽等抗疲劳活性多肽。抗疲劳肽主要是由2～10个氨基酸形成的直链寡肽或小肽，不仅可以提供人体所需的氨基酸，同时又是人体活动需要的能源物质，能增强机体的抗氧化能力、维持内环境稳定及酶活性，还具有防止神经递质失衡等功能，这是其他抗疲劳因子所无法比拟的。
马尾松等松树的花粉经人工采集和干燥等步骤加工后获得的花粉，即为松花粉。松花粉含有丰富的蛋白质、微量元素、黄酮及必需脂肪酸等营养成分及生物活性物质，具有抗衰老、抗氧化、抗疲劳、促进生长发育、调整机体代谢等多种功效。目前松花粉水提物的制备技术已相对成熟，并形成了国珍松花粉等一系列在售产品。但在松花粉水提物的制备过程中，却产生了大量的松花粉粕残渣，这些残渣中还存在着大量优质的蛋白质资源尚未得到充分利用。简单的丢弃松花粉粕不仅会带来环境的压力，也造成了大量营养物质的浪费。
因此，开发一种安全高效的从松花粉粕中制备具有抗疲劳活性的松花粉肽的方法，成了亟待解决的问题。目前国内关于利用蛋白酶水解松花粉粕制备抗疲劳肽的研究未见报道。利用松花粉粕开发具有缓解疲劳作用的活性肽具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明针对松花粉粕得不到充分利用的现状，提供一种从松花粉粕中制备具有抗疲劳活性的松花粉肽的方法。
一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)均质：将松花粉粕粉碎，向其中加入蒸馏水混合，后在20-80Mpa的均质压力下均质1-3次，得到松花粉粕均质液；
(2)酶解：调节松花粉粕均质液的pH为8.0-10.0，后向其中加入蛋白酶2000-6000U/g，置于45-65℃的条件下水解，保持温度和pH恒定，当水解120-240min时停止酶解，于90-100℃水浴中灭活蛋白酶5-20min，冷却至室温后得到松花粉粕酶解液；
(3)醇沉：将步骤(2)中所得的松花粉粕酶解液离心，后收集上清液，按照1:4(w:v)的比例向上清液中加入无水乙醇，后于4℃静置8-16h，得到醇沉后的松花粉肽溶液；
(4)浓缩、干燥：将步骤(3)中所得的醇沉后的松花粉肽溶液离心，后收集上清液，上清液浓缩后得浓缩液，浓缩液经喷雾干燥得到具有抗疲劳活性的松花粉肽产品。
进一步，步骤(1)中松花粉粕与蒸馏水的混合比例为1:10(w:v)。
进一步，步骤(2)中使用的所述蛋白酶为胰蛋白酶。
进一步，步骤(2)中所述的酶解在震荡水浴锅中进行。
进一步，步骤(3)和步骤(4)中离心的转速为2000-4000r/min。
进一步，步骤(4)中喷雾干燥的具体操作参数为：进风温度180℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min。
本发明的有益效果是：
1)该制备方法以松花粉产品加工的副产物松花粉粕为原料，成本低廉，在避免松花粉粕造成环境压力的同时，提高了优质蛋白的利用率；
2)本发明所提供的制备方法工艺简单、反应温度低，在最佳工艺条件下所得到的松花粉肽具有显著的抗疲劳活性；
3)本发明的方法制备的松花粉肽具有安全性高以及氨基酸配比合理等特点，并具有显著的抗疲劳活性，在食品领域有着广阔的市场前景。
附图说明
图1：不同蛋白酶酶解松花粉粕的结果；
图2：松花粉肽对小鼠负重游泳结果的影响结果；
图3：松花粉肽对小鼠血清尿素氮含量的影响结果；
图4：松花粉肽对小鼠肝糖原含量的影响结果；
图2～4中，**表示p<0.05差异极显著；*表示p<0.5差异显著。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
首先，我们选择了六种蛋白酶来分析其对松花粉粕酶解水解度的影响，测试不同蛋白酶对松花粉粕的酶解效果，进而筛选出最适合用于松花粉粕酶解的蛋白酶。如图1所示，随着酶解时间的延长，六种蛋白酶的水解度均逐渐升高，但水解度的增加趋势逐渐减缓。六种蛋白酶中酶解效果最好的是胰蛋白酶，当水解时间超过4h后，水解度已超过20％，因此选择胰蛋白酶来水解松花粉粕。
实施例1：
一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，步骤如下：
(1)均质：将松花粉粕用粉碎机粉碎，按照1:10(w:v)的比例加入蒸馏水混合后，利用超高压均质机在80MPa的均质压力下均质1次，得到松花粉粕均质液；
(2)酶解：将松花粉粕均质液的pH通过氢氧化钠溶液调节到8.5，然后加入胰蛋白酶4000U/g，在55℃的震荡水浴锅中水解，保持温度和pH恒定，当水解180min时停止酶解，于95℃水浴灭活蛋白酶10min，冷却至室温后，得到松花粉粕酶解液；
(3)醇沉：将冷却的松花粉粕酶解液于4000r/min的转速下离心20min，收集上清液，按照1:4(w:v)的比例加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，于4℃下静置16h，得到醇沉后的松花粉肽溶液；
(4)浓缩、干燥：取醇沉后的松花粉肽溶液，在4000r/min的转速下离心30min，收集上清液，在压力0.1MPa下浓缩至原体积的30％后，浓缩液在进风温度180℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min条件下喷雾干燥，得到具有抗疲劳活性的松花粉肽。
实施例2：
一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，步骤如下：
(1)均质：将松花粉粕用粉碎机粉碎，按照1:10(w:v)的比例加入蒸馏水混合后，利用超高压均质机在60MPa的均质压力下均质3次，得到松花粉粕均质液；
(2)酶解：将松花粉粕均质液的pH通过碱性溶液调节到9.2，然后加入胰蛋白酶6000U/g，在65℃的震荡水浴锅中水解，保持温度和pH恒定，当水解240min时停止酶解，于100℃水浴灭活蛋白酶5min，冷却至室温后，得到松花粉粕酶解液；
(3)醇沉：将冷却的松花粉粕酶解液，在2000r/min的转速下离心30min，收集上清液，按照1:4(w:v)的比例加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，于4℃静置12h，得到醇沉后的松花粉肽溶液；
(4)浓缩、干燥：取醇沉后的松花粉肽溶液，在2000r/min的转速下离心30min，收集上清液，在压力0.1MPa下浓缩至原体积的30％后，浓缩液在进风温度180℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min条件下喷雾干燥，得到具有抗疲劳活性的松花粉肽。
实施例3：
一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，步骤如下：
(1)均质：将松花粉粕用粉碎机粉碎，按照1:10(w:v)的比例加入蒸馏水混合后，利用超高压均质机在20MPa的均质压力下均质3次，得到松花粉粕均质液；
(2)酶解：将松花粉粕均质液的pH通过碱性溶液调节到10，然后加入胰蛋白酶2000U/g，在45℃的震荡水浴锅中水解，保持温度和pH恒定，当水解120min时停止酶解，于90℃水浴灭活蛋白酶20min，冷却至室温后，得到松花粉粕酶解液；
(3)醇沉：将冷却的松花粉粕酶解液，在3000r/min的转速下离心20min，收集上清液，按照1:4(w:v)的比例加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，于4℃静置8h，得到醇沉后的松花粉肽溶液；
(4)浓缩、干燥：取醇沉后的松花粉肽溶液，在3000r/min的转速下离心20min，收集上清液，在压力0.1MPa下浓缩至原体积的30％后，浓缩液在进风温度180℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min条件下喷雾干燥，得到具有抗疲劳活性的松花粉肽。
我们将实施例1和实施例2的工艺制备得到的松花粉肽的分子量分布通过GPC软件进行了分析。结果如表1所示，当酶解180min时，得到的平均分子量为1645Da；当酶解240min时，平均分子量为681Da。
表1：实施例1和实施例2制备得到的松花粉肽的分子量分布
表2显示了两种不同分子量范围的抗疲劳松花粉肽的氨基酸组成表。
表2 抗疲劳松花肽的氨基酸组成表
最后我们通过小鼠负重游泳实验、小鼠血清尿素氮含量和肝糖原含量验证了实施例1和实施例2所得的不同分子量范围的松花粉肽的抗疲劳活性。连续灌胃30d后，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮置小鼠在水深不少于30cm，25±0.5℃游泳箱中。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，以游泳时间为计量资料方差分析，结果如图2所示。松花粉肽对小鼠血清尿素氮含量和肝糖原含量的影响分别如图3和图4所示。结果显示<1kDa松花粉肽低剂量组、<1kDa松花粉肽中剂量组和1-3kDa松花粉肽高剂量组的负重游泳时间与阴性对照相比极显著增加，血清尿素氮含量与阴性对照相比极显著降低，松花粉肽的三个剂量组以及阳性对照的肝糖原含量均显著增加。综合三个实验，说明实施例1和实施例2方法制备的松花粉肽均具有抗疲劳活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)均质：将松花粉粕粉碎，向其中加入蒸馏水混合，后在20-80Mpa的均质压力下均质1-3次，得到松花粉粕均质液；
(2)酶解：调节松花粉粕均质液的pH为8.0-10.0，后向其中加入蛋白酶2000-6000U/g，置于45-65℃的条件下水解，保持温度和pH恒定，当水解120-240min时停止酶解，于90-100℃水浴中灭活蛋白酶5-20min，冷却至室温后得到松花粉粕酶解液；
(3)醇沉：将步骤(2)中所得的松花粉粕酶解液离心，后收集上清液，按照1:4(w:v)的比例向上清液中加入无水乙醇，后于4℃静置8-16h，得到醇沉后的松花粉肽溶液；
(4)浓缩、干燥：将步骤(3)中所得的醇沉后的松花粉肽溶液离心，后收集上清液，上清液浓缩得浓缩液，浓缩液经喷雾干燥得到具有抗疲劳活性的松花粉肽产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中松花粉粕与蒸馏水的混合比例为1:10(w:v)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的所述蛋白酶为胰蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的酶解在震荡水浴锅中进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)中离心的转速为2000-4000r/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中喷雾干燥的具体操作参数为：进风温度180℃，进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为20000r/min。
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