CN103333940B

CN103333940B - 利用带鱼制备二肽基肽酶iv抑制肽的方法

Info

Publication number: CN103333940B
Application number: CN201310290233.5A
Authority: CN
Inventors: 靳挺; 武玉学
Original assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Current assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103333940A

Abstract

本发明公开一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，其特征在于：步骤包括：将带鱼加水绞碎成均匀的鱼肉浆；鱼肉浆放入酶解罐中，添加内切蛋白酶，搅拌水解4～12h，得水解液；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，搅拌水解2～8h；升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；将上述所得灭酶后的水解液离心取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽。本发明具有工艺简便、生产成本低、生产周期短的优点。

Description

利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种以带鱼为原料，通过复合酶水解带鱼蛋白质，利用超滤、亲和层析等技术制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法。

技术背景

带鱼又名刀鱼、牙带鱼，是鱼纲鲈形目带鱼科动物，是我国沿海产量较高的一种经济鱼类，味道鲜美，深受国内外消费者的青睐。带鱼蛋白质是一种全价蛋白质，含有人体必需的八种氨基酸，还含有钙、铁、磷、镁、锌、硒等微量元素以及多种维生素，营养丰富。中医认为带鱼具有和中开胃、暖胃补虚、润泽肌肤及美容等功效，并且对病后体虚、产后乳汁不足和外伤出血等症具有一定食疗作用。目前，带鱼的食用方法单一，主要是直接食用。然而，随着捕捞强度的增大，海洋捕捞的小带鱼产量呈逐年上升趋势；小带鱼由于体型小，直接食用的价值较低；现在主要用来生产鱼粉等低值产品，更有作为废弃物直接丢弃，导致资源未得到充分利用，经济效益低下，甚至污染环境。

糖尿病是一类严重威胁人类健康的疾病，我国2008年糖尿病患者约为4000万，II型糖尿病占93.7%，2025年预计将达到6000万。抗糖尿病药物的研究一直是受到关注的重要问题。二肽基肽酶IV（DPP-IV，EC3.4.14.5）已成为研究治疗糖尿病的新靶点。DPP-IV抑制剂通过竞争性结合DPP-IV活性部位，降低酶的催化活性，从而抑制胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖促胰岛素多肽（GIP）的降解，从而达到治疗糖尿病的目的。目前，通过化学合成的方法获得的DPP-IV抑制剂，如Sitagliptin、Vildagliptin，临床试验显示该类药物存在的问题是毒副作用较大，如血小板减少，腹泻，降低T细胞的活性，影响机体免疫功能等；而从天然产物中获取DPP-IV抑制剂正在成为新的研究方向。天然海洋蛋白质，基于生长环境的特异性，其多肽链中存在功能、结构新颖的活性片段；采用酶工程的技术手段水解蛋白质已成为制备生物活性肽的一种重要方法。生物活性肽的活性与其结构密切相关，而结构取决于氨基酸序列和分子量大小。一般来说，分子量低于3000Da的肽类具有更高的生物活性。

目前，尚还未有人通过酶解带鱼蛋白质制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的报道。由于带鱼蛋白水解液中DPP-IV抑制肽的含量较低，其分离制备颇为艰难，因而建立和发展微量水平上DPP-IV抑制肽的分离制备新方法是本发明要解决的关键问题。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种以带鱼为原料，制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的方法，制备步骤包括：

（1）将带鱼去头、尾和内脏，洗净称重，加入1～3倍带鱼质量的水，绞碎成均匀的鱼肉浆；

（2）将步骤（1）制备的鱼肉浆放入酶解罐中，添加带鱼质量0.1%～1.0%的内切蛋白酶，调温至40～70℃，调pH至5.0～8.5，搅拌水解4～12h，得水解液；

（3）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；

（4）将步骤（3）灭酶后的水解液冷却至40～60℃，添加带鱼质量0.1%～1.0%的外切蛋白酶，调pH至5.0～7.5，搅拌水解2～8h；

（5）搅拌水解结束后，升温至95～100℃，保持10～15分钟灭酶；

（6）将步骤（5）所得灭酶后的水解液离心：3600～4000rpm、1～5℃、10～15分钟，取上清液；

（7）将步骤（6）的上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.05～0.1MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；

（8）采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽；将二肽基肽酶IV固定化在CNBr-activated Sepharose4Fast Flow层析介质上；层析介质装柱后将层析柱用缓冲液平衡2～6柱体积（CV），然后将步骤（7）收集的滤膜透过液即超滤液上柱，采用缓冲液清洗2～5柱体积，然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜(8-24h)；

（9）将透析后的溶液在-20～-24℃预冻16～24h，然后在-60～-65℃、0.005～0.0054毫巴（mbar）冷冻干燥25～36h，即得到二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽。

本发明上述的带鱼质量均以步骤（1）去头、尾和内脏，洗净称重后的带鱼质量计算。

采用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物的发色底物法检测本发明最终制得的二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽，本发明制备的二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的IC₅₀值为0.108～0.526mg/mL。

步骤（2）所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中的一种；酶解过程中保持温度和pH的恒定。

步骤（4）所述外切蛋白酶为Flavourzyme风味蛋白酶；酶解过程中保持温度和pH的恒定。

步骤（8）所述缓冲液为20mmol/LPBS+0.15mol/LNaCl,pH7.0的缓冲液；步骤（8）所述洗脱液为20mmol/LPBS+1.0mol/LNaCl,pH7.0的洗脱液；

本发明具有以下显著优点和有益效果：

（1）本发明先使用内切蛋白酶将蛋白质水解为分子量较大、肽链较长的多肽，再使用外切蛋白酶将多肽进一步水解为低分子量的小肽。由于内切蛋白酶和外切蛋白酶的作用位点不同，使得蛋白质水解更彻底，更加有利于低分子量的DPP-IV抑制肽的释放。

（2）本发明超滤膜分离器采用的膜截留分子量为3000Da，进一步保证了低分子量的DPP-IV抑制肽的制备，该过程可富集DPP-IV抑制肽的微量成分。

（3）本发明采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽，亲和层析是利用偶联DPP-IV的亲和吸附介质为固定相亲和吸附DPP-IV抑制肽，使DPP-IV抑制肽得到分离纯化的液相层析法，具有高选择性、高回收率和高纯度的特点，大大提高了分离的效率。

（4）本发明是首次利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，该方法具有工艺简便、生产成本低、生产周期短的优点。带鱼DPP-IV抑制肽可广泛用于医药、保健食品等领域，为低值小带鱼的深加工生产高附加值产品提供了一条有效途径。

具体实施方式

下面给出3个优选实施例，但本发明不仅局限于以下实施例。

实施例1：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取1.0kg带鱼，加入2.0kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至45℃，调pH至7.2，以带鱼质量计，添加0.3%的Neutrase中性蛋白酶，搅拌水解6h；升温至95℃，保持15分钟灭酶；将水解液迅速冷却至50℃，添加带鱼质量0.5%的Flavourzyme风味蛋白酶，调pH至7.5，搅拌水解6h；升温至95℃，保持15分钟灭酶；将所得水解液离心：4000rpm、4℃、13分钟，取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.09MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；将二肽基肽酶IV（市售或从猪肾中提取，实施例2-3亦同）固定化在CNBr-activatedSepharose4FastFlow层析介质上；将装有层析介质的层析柱用缓冲液（20mmol/LPBS+0.15mol/LNaCl,pH7.0）平衡6CV（6个柱体积），然后将超滤液上柱，采用缓冲液清洗3CV，然后用洗脱液（20mmol/LPBS+1.0mol/LNaCl,pH7.0）进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜（透析袋的截留分子量为3000Da）。将透析后的洗脱液，-24℃预冻18h，-60℃、0.005mbar（毫巴）冷冻干燥30h，即得到二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽，产品得率为3.6%。采用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物的发色底物法检测，二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的IC₅₀值为0.136mg/mL。

实施例2：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取1.5kg带鱼，加入3.5kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至50℃，调pH至6.2，以带鱼质量计，添加0.5%的木瓜蛋白酶，搅拌水解5h；升温至98℃，保持14分钟灭酶；将水解液迅速冷却至45℃，添加带鱼质量0.8%的Flavourzyme风味蛋白酶，调pH至7.2，搅拌水解4h；升温至98℃，保持14分钟灭酶；将所得水解液离心：3800rpm、5℃、15分钟，取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.08MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；将二肽基肽酶IV固定化在CNBr-activated Sepharose4Fast Flow层析介质上；将装有层析介质的上述层析柱用缓冲液（20mmol/LPBS+0.15mol/LNaCl,pH7.0）平衡5CV（柱体积），然后将超滤液液上柱，采用缓冲液清洗4CV，然后用洗脱液（20mmol/LPBS+1.0mol/LNaCl,pH7.0）进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜（透析袋的截留分子量为3000Da）。将透析后的洗脱液，-22℃预冻20h，-62℃、0.0052mbar（毫巴）冷冻干燥32h，即得到二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽,产品得率为4.2%。采用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物的发色底物法检测，二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的IC₅₀值为0.358mg/mL。

实施例3：

将带鱼去头、尾和内脏，洗净并称取2.0kg带鱼，加入5.0kg水，绞碎成均匀的鱼肉浆；将鱼肉浆放入酶解罐中，调温至55℃，调pH至8.0，以带鱼质量计，添加0.8%的Alcalase碱性蛋白酶，搅拌水解10h；升温至99℃，保持13分钟灭酶；将水解液迅速冷却至55℃，添加带鱼质量0.4%的Flavourzyme风味蛋白酶，调pH至7.0，搅拌水解8h；升温至99℃，保持13分钟灭酶；将所得水解液离心：3900rpm、3℃、14分钟，取上清液；将上清液加入到超滤膜分离器中，调节超滤膜的压力为0.07MPa，超滤膜的截留分子量为3000Da，收集超滤膜透过液；将二肽基肽酶IV固定化在CNBr-activatedSepharose4FastFlow层析介质上；将装有上述层析柱用缓冲液（20mmol/LPBS+0.15mol/LNaCl,pH7.0）平衡4CV（柱体积），然后将超滤液液上柱，采用缓冲液清洗5CV，然后用洗脱液（20mmol/LPBS+1.0mol/LNaCl,pH7.0）进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜（透析袋的截留分子量为3000Da）。将透析后的洗脱液，-20℃预冻24h，-65℃、0.0054mbar（毫巴）冷冻干燥28h，即得到二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽,产品得率为3.2%。采用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物的发色底物法检测，二肽基肽酶IV（DPP-IV）抑制肽的IC₅₀值为0.269mg/mL。

Claims

1.一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，其特征在于：步骤包括：

（6）将步骤（5）所得灭酶后的水解液离心：3600～4000rpm、1~5℃、10～15分钟，取上清液；

（8）采用亲和层析方法分离纯化DPP-IV抑制肽：将二肽基肽酶IV固定化在CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow层析介质上；层析介质装柱后将层析柱用缓冲液平衡2～6柱体积，然后将步骤（7）收集的滤膜透过液即超滤液上柱，采用缓冲液清洗2～5柱体积，然后用洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，并透析过夜；

（9）将透析后的溶液在-20~-24℃预冻16～24h，然后在-60~-65℃、0.005~0.0054 毫巴冷冻干燥25~36h，即得到二肽基肽酶IV抑制肽；

步骤（8）所述缓冲液为20mmol/L PBS + 0.15 mol/L NaCl, pH 7.0的缓冲液；步骤（8）所述洗脱液为20mmol/L PBS + 1.0 mol/L NaCl, pH 7.0的洗脱液;

步骤（2）所述的内切蛋白酶为木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶中的一种;

步骤（4）所述的外切蛋白酶为Flavourzyme风味蛋白酶。