CN104531663A - 鱿鱼碎肉制备高f值寡肽固定化酶水解方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，包括固定化胃蛋白酶制备步骤、固定化风味酶制备步骤、动态串联酶处理步骤、吸附脱芳处理等步骤。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。因而本发明有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好、F值高、水解度高的优点。

Description

鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法

技术领域

本发明涉及一种高F值的肽水解方法，尤其涉及鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法。

背景技术

鱿鱼(Squid)属软体动物门头足纲，具有较显著的品种特征：个体大，胴体长，肉质嫩而多汁 。鱿鱼肉质风味近似鲍鱼，价格低廉，可食部分近80%。在我国鱿鱼的大规模捕获和加工是近十多年来才发展起来的，随着我国北太平洋鱿钓业规模形成，鱿鱼产量不断扩大。据FAO渔业统计年检报道，1998年我国鱿鱼年捕获量达2314万吨，约占世界总量（260万吨）的9%。但是鱿鱼精深加工技术匮乏，在处理过程会有碎肉等副产物产生，但主要作为鱼粉或饲料的低值粗放利用，不仅原料利用效率低下，而且污染环境。因此鱿鱼碎肉的高值绿色开发不仅能够提高现有资源的利用效率、提升经济效益、保护环境，也为增加水产加工的附加值提供了新的方向。

高F值寡肽（F值＞20）是由3～9 个氨基酸残基所组成的小肽混合物，F值是指混合物中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，简称BCAA）与芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，简称AAA）的物质的量比值，是为了纪念德国著名学者Fischer在20世纪70 年代提出的“伪神经传递质假说”而命名的。高F值寡肽为小分子短肽，与游离氨基酸相比具有渗透压低、抗原性低等优点，所以更容易被吸收，可以作为运动员的营养补充剂，帮助术后病人复原。更有研究表明高F值寡肽产品在肝脏保护、肝性脑病以及苯丙酮尿症治疗等方面具有显著功效，而且不断被应用于新的技术领域。已有文献表明制备高F值寡肽选用的原料主要是一些植物性蛋白和乳源性蛋白，利用水产品作为原料制备高F值寡肽除本课题组外未见报道。

高F值寡肽制备通常有直接提取法、化学合成法、酸碱水解法以及生物酶解法。直接提取分离法是采用利用各种分离纯化技术，从生物体中直接提取其体内所固有的生物活性肽，但由于天然生物体中活性肽的含量很低，故要想获得高纯度的活性肽是需要多次分离的，造成制备成本高，工艺复杂，难以产业化。化学合成法是利用已知的活性肽序列，将氨基酸片段脱水缩合得到所需活性肽。但是在合成过程中为了避免副反应的发生破坏肽活性侧链，需用大量的化学试剂对侧链进行保护，因此该法难以用于实际生产。酸碱水解法的原理是蛋白质在酸性或碱性条件下能够被水解成肽和氨基酸。此法虽然工艺简单成本低，但反应条件剧烈，对蛋白质空间结构改变严重，氨基酸受损厉害，甚至产生有毒物质，故实际应用中较少采用。酶解法因反应过程容易控制、反应条件温和，且水解过程中并不添加化学试剂等特点而被实际生产所采用。酶（enzyme）是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，它具有高效性、专一性、温和性、活性可调节等特点，在生产中得到广泛的应用。但是由于酶具有易变性，酸碱盐等不利条件易使蛋白质的四级结构乃至三级结构发生变化，从而降低甚至丧失生物活性。实际生产中酶多数以游离态存在，难以实现酶的回收利用，造成成本高、效率低的局面，因此难以实现工业的连续化和全自动化的发展。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能发挥其特有的催化作用，并可回收重复使用的技术。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术提供一种原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好、F值高、水解度高的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，包括如下步骤：

①固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为0.1%至8%的HAc溶液，并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静置；再将静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将微球放入乳酸缓冲溶液中混合均匀待用；固定化液含有NaOH和酒精；

②固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液制成酶液；将酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3.0%的                                               溶液中得到凝胶珠，并在继续溶液中固定化；将凝胶珠抽滤后得到硬化的凝胶珠，洗去表面的，即得到球状固定化风味酶；

③动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成匀浆，调pH至3，加入步骤①处理制得的微球，在45至55℃条件下恒温水解1至5小时后制得第一步酶解多肽液；在第一步酶解多肽液中按每克加入1000至1900U的球状固定化风味酶进行第二步酶解；

④吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3，流速为1BV/h进行脱芳处理后得到高F值寡肽。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水产加工副产物的高值利用提供了一种新的思路。

为优化上述技术方案，采取的措施还包括如下步骤：

①固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为0.1%至8%的HAc溶液，并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静置；再将静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将微球放入乳酸缓冲溶液中混合均匀待用；固定化液含有NaOH和酒精；

②固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液制成酶液；将酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3.0%的溶液中得到凝胶珠，并在继续溶液中固定化；将凝胶珠抽滤后得到硬化的凝胶珠，洗去表面的，即得到球状固定化风味酶；

③动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成匀浆，调pH至3，加入步骤①处理制得的微球，在45至55℃条件下恒温水解1至5小时后制得第一步酶解多肽液；在第一步酶解多肽液中按每克加入1000至1900U的球状固定化风味酶进行第二步酶解；

④吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3，流速为1BV/h进行脱芳处理后得到高F值寡肽。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水产加工副产物的高值利用提供了一种新的思路。步骤①中搅拌温度为20℃至30℃；步骤①中，固定化液按体积份数含有4份10%NaOH、1份95%酒精。步骤①中乳酸缓冲溶液按体积份数含有2至4份浓度为5%的戊二醛、5至10份胃蛋白酶液和6至8份乳酸。步骤①中乳酸缓冲溶液中混合的处理温度为35℃。步骤②中海藻酸钠溶液的浓度为2.5%，酶液体积/海藻酸钠体积为1:2，溶液中固定化的时间为3小时。步骤③中第二次酶解的处理温度是40至55℃，pH为7，处理时间为3至5小时。采用上述温度，能在达到较好效果的同时，最大程度的节省能源。

由于本发明采用了固定化胃蛋白酶制备步骤、固定化风味酶制备步骤、动态串联酶处理步骤、吸附脱芳处理步骤，其动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水产加工副产物的高值利用提供了一种新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例料水比对水解度的影响示意图；

图2为本发明实施例加酶量对水解度的影响示意图；

图3为本发明实施例水解时间对水解度的影响示意图；

图4为本发明实施例水解温度对水解度的影响示意图。

具体实施方式

以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：参照图1至图4，鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，包括如下步骤：

①固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为0.1%至8%的HAc溶液，并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静置；再将静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将微球放入乳酸缓冲溶液中混合均匀待用；固定化液含有NaOH和酒精；

②固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液制成酶液；将酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3.0%的溶液中得到凝胶珠，并在继续溶液中固定化；将凝胶珠抽滤后得到硬化的凝胶珠，洗去表面的，即得到球状固定化风味酶；

③动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成匀浆，调pH至3，加入步骤①处理制得的微球，在45至55℃条件下恒温水解1至5小时后制得第一步酶解多肽液；在第一步酶解多肽液中按每克加入1000至1900U的球状固定化风味酶进行第二步酶解；

④吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3，流速为1BV/h进行脱芳处理后得到高F值寡肽。本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点，为水产加工副产物的高值利用提供了一种新的思路。步骤①中搅拌温度为20℃至30℃；步骤①中，固定化液按体积份数含有4份10%NaOH、1份95%酒精。步骤①中乳酸缓冲溶液按体积份数含有2至4份浓度为5%的戊二醛、5至10份胃蛋白酶液和6至8份乳酸。步骤①中乳酸缓冲溶液中混合的处理温度为35℃。步骤②中海藻酸钠溶液的浓度为2.5%，酶液体积/海藻酸钠体积为1:2，溶液中固定化的时间为3小时。步骤③中第二次酶解的处理温度是40至55℃，pH为7，处理时间为3至5小时。采用上述温度，能在达到较好效果的同时，最大程度的节省能源。

具体步骤如下，供进一步参考：

鱿鱼碎肉由舟山富丹旅游食品有限公司提供。固定化胃蛋白酶、风味酶由本实验室自制。

胃蛋白酶1000U/g,风味酶10563U/g购置于广西南宁庞博生物工程有限公司；酪蛋白购置于北京奥博星生物技术有限责任公司；三氯醋酸购置于国药集团化学试剂有限公司；福林酚购置于上海荔达生物科技有限公司；试验用水为二次蒸馏水；其它试剂均为国产分析纯级。本实施例的主要仪器与设备如下：SHA-C型（数显）水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司； TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂； 奥豪斯 CP214-JY19 精密电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司； 721G可见分光光度计，PHB-4型便携式PH计，上海仪电分析仪器有限公司。

本实施例工艺流程为：鱿鱼碎肉→固定化胃蛋白酶处理→多肽→固定化风味酶处理→酶解液→吸附脱芳→高F值寡肽。

其中，吸附脱芳的条件为：取一定量酶解液，调节pH为3，按1：20（w/v）加入颗粒活性炭，40℃恒温水浴吸附5h，离心取上清液，再进行同条件下的两次吸附，最终的上清液即为高F值寡肽液，本发明的动态串联吸附脱芳现有技术没有见到报道，具有很大的创造性。

胃蛋白酶的固定化

壳聚糖微球的制备

称取一定量壳聚糖粉末，溶于100 mL、质量分数为1%的HAc溶液，于25 ℃磁力搅拌2 h，完全溶解后静置20 min直到气泡消失。将上述溶液用5 mL的注射器逐滴加入到250 mL混合液（10%NaOH与95%酒精，体积比为4:1）中，得到粒度均匀、富有弹性的壳聚糖微球，在4 ℃冰箱中放置过夜，使微球硬化。用蒸馏水浸泡洗涤至中性，抽滤，用吸水纸吸干表面水分，转移到培养皿中，置于35 ℃烘箱中干燥，收集微球。

胃蛋白酶的固定化方法

    称取壳聚糖微球0.40 g放入100 mL具塞锥形瓶中，加入2 mL浓度为5%的戊二醛、5 mL胃蛋白酶液和6 mL乳酸缓冲溶液，在一定温度下摇床振荡固定化一段时间，过滤，干燥，收集胃蛋白酶微球。

胃蛋白酶的最优固定化工艺

壳聚糖浓度2.50%，固定化时间3.40 h，固定化温度35 ℃。

固定化胃蛋白酶水解工艺的预选

取10g鱿鱼碎肉加入 50ml水制成匀浆液，在设定的条件下，以蛋白质水解度为指标，分别考察料水比1：4至1：6、酶用量6至12克、水解时间4至6小时、水解温度45至55℃。对固定化胃蛋白酶水解鱿鱼碎肉蛋白的影响。

风味酶的固定化

风味酶液的配制

取2.00g风味酶粉，用0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释至50ml，取10ml稀释液，再用磷酸盐缓冲溶液稀释至100ml，配成浓度为4g/L的酶液，置于4℃冰箱中备用。

风味酶的固定化

取一定量的风味酶液加入到一定量的海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀。用注射器吸入上述混合液，注入150ml 3.0%的溶液中得到颗粒均匀、形状规则的小球。将形成的凝胶珠在0~4℃的溶液中固定一段时间，使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的凝胶珠，用双蒸水洗涤3~5次，以洗去表面的溶液，即得到球状固定化风味酶。

风味酶的最优固定化工艺

海藻酸钠浓度2.50%，酶液体积/海藻酸钠体积1:2，固定化时间3.0h。

    固定化风味酶酶解工艺的预选

单因素试验：取10g至50g鱿鱼碎肉（本实施例优选30g），加入100～250ml水制成匀浆（本实施例优选150ml），调pH至3，加入固定化胃蛋白酶27g，在55℃条件下恒温水解5h后制得第一步酶解多肽液。在设定的条件下，以蛋白质水解度为指标，分别考察加酶量、pH、水解时间、水解温度对固定化风味酶水解多肽的影响。

优选技术方案：

料水比对蛋白水解度的影响

按料水比1:3至1:7分别制备鱿鱼碎肉匀浆液，加入胃蛋白酶6g，保持温度40℃水解4h，考察不同料水比对鱿鱼碎肉蛋白水解度的影响，结果如图1所示。

由图1可知，固定化胃蛋白酶对鱿鱼碎肉蛋白的水解度随料水比的增加呈现先升后降的趋势，当料水比为1：5时，水解度达到最高为8.25 %。当酶的添加量相同时，料水比决定了酶与底物的作用浓度，当料水比小于1：5时，底物过量，而酶不足，故随料水比的增加，底物浓度下降，故水解度增大。当料水比大于1：5后，酶过量，随料水比的增加，底物浓度减小，故水解度下降。

加酶量对蛋白水解度的影响

取10g碎肉，按料水比1:5进行匀浆后，保持温度40℃，水解时间4h，分别考察加酶量为3g、6g、9g、12g时对鱿鱼碎肉蛋白水解度的影响，结果如图2所示。

由图2可知，固定化胃蛋白酶对鱿鱼碎肉蛋白的水解度随加酶量的增加呈现先升后降的趋势，当加酶量为9.0g，水解度达到最高为7.95%。当料水比一定时，加酶量决定了酶与底物的作用浓度，当加酶量小于9.0 g时，底物过量，而酶不足，故随加酶量的增加，水解度逐渐增大。而当加酶量大于9.0 g后，过量的酶，导致蛋白的水解产物肽的扩散存在空间位阻，导致酶的催化反应受阻，速率降低，故水解度反而递减。

水解时间对蛋白水解度的影响

取10g碎肉，按料水比1:5进行匀浆后，加入9g胃蛋白酶，设定水解温度40℃，分别考察水解时间为2h、3h、4h、5h、6h时对水解度的影响，结果如图3所示。

由图3可知，随着水解时间的延长，蛋白水解度逐渐升高，直至水解时间达到5h时，水解度为最高10.62 %，之后水解度变化平缓。当酶的添加量、料水比一定时，水解时间即为胃蛋白酶的催化作用时间，所以随着水解时间的增加，水解度将逐渐增大。然而当水解5小时以后继续进行，底物逐渐被消耗殆尽，酶活不断下降；此外生成的产物最初是与酶以结合的形式存在，占据酶分子上的特殊位点，加之产物浓度不断增加，都对酶与底物的作用产生竞争性抑制，所以水解速度最终必然随之减慢，水解度不再增加。

水解温度对蛋白水解度的影响

取10g碎肉，按料水比1:5进行匀浆后，加入9g胃蛋白酶，设定水解时间5h，分别考察水解温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时对水解度的影响，结果如图4所示。

由图4可知，固定化胃蛋白酶对鱿鱼碎肉蛋白的水解度随水解温度的增加同样呈现先升后降的趋势。当水解时间为50℃时，水解度达到最高为8.86%。当酶的添加量、料水比、水解时间一定时，水解温度决定了酶的活力，当温度低于50℃时，酶结构完整，但酶活力不足，故随着温度的增加，酶活力上升，水解度增大。当温度高于50℃后，酶因高温变性，结构破坏，酶活力受到抑制，同时底物蛋白也会因高温变性，结构变异后导致酶的催化水解作用下降，且温度越高对酶和底物蛋白的结构破坏越严重，故水解度随之下降。

    固定化胃蛋白酶水解工艺

试验表明上述因素对水解度的影响程度的大小顺序依次为料水比>时间>加酶量>温度，料水比、加酶量以及水解时间对水解度影响显著(P<0.05)，而水解温度影响不显著（P>0.05）。固定化胃蛋白酶水解鱿鱼碎肉的的最佳工艺条件为料水比1:5，加酶量9g，水解时间5h，水解温度55℃。在此条件下进行验证试验，三次平行试验得到的水解度平均值为14.70% ±0.37 %，说明此工艺是可行。考虑温度对水解度的影响不显著，实际操作时可将温度设为45～50℃，以降低能耗。

    固定化风味酶水解工艺

通过单因素试验，明确了加酶量、pH值、水解温度和时间为影响固定化风味酶进一步水解胃蛋白酶解液效果的主要因素，并确定了各因素的考查范围。因为此步水解的目的是切掉胃蛋白酶解液中暴露在端基的芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在波长280nm处有特征吸收峰，所以工艺效果的考查指标为水解液的OD₂₈₀和水解度。试验表明，各因素对水解液的OD₂₈₀和水解度的影响是一致的，也就是说水解度的增加与风味酶切掉肽端的芳香族氨基酸是密切相关的，由此也说明风味酶对水解端基的芳香族氨基酸的高度选择性。四个因素对OD₂₈₀和水解度的影响程度的大小顺序均依次为D>C>A>B，由方差分析可知，加酶量、水解温度和水解时间对OD₂₈₀和水解度的影响均显著(P<0.05)，而pH值的影响均不显著（P>0.05）。pH值对OD₂₈₀和水解度的影响都不显著，故选择pH7中性溶液为优选条件，可能会降低pH8碱性条件下蛋白变性的风险。由此确定固定化风味酶水解的最佳工艺条件为在制备的胃蛋白酶水解液中加入固定化风味酶的量为1692 U·g^-1鱿鱼碎肉，在pH7、55℃下恒温水解3h，三次平行测定的水解度平均值为32.09% ± 0.58%，OD₂₈₀为0.238 ± 0.001。说明此优选工艺是可行的。

活性炭吸附脱芳的条件及高F值的测定结果

选用玻璃吸附柱Φ=1.0×40cm，填充一定量颗粒活性炭，使柱高为36cm，调节酶解液pH为3，流速为1BV/h，吸附体积为150ml时，活性炭达到饱和。经过多级（目前采用两级即可达到F值大于20的要求）活性炭柱的串联吸附，酶解液的F值可以达到20以上。

本发明采用固定化双酶分步水解、活性碳多级串联动态吸附脱芳来制备高F值寡肽。优选的最佳酶解工艺为：第一步固定化胃蛋白酶的水解条件为料水比1:5、加酶量为26.83U·g^-1鱿鱼碎肉、水解时间5h、水解温度55℃，第二步固定化风味酶的水解条件为加酶量1692 U·g^-1鱿鱼碎肉、pH 7.0、水解温度55℃，两步酶解后水解度达到32.09%±0.58%，OD₂₈₀为0.238 ± 0.001。酶解液经多级活性炭串联吸附脱除芳香族氨基酸后，支链氨基酸和芳香族氨基酸的比值（F值）大于20。

本发明采用鱿鱼碎肉作为制备高F寡肽的原料，不仅使这些低值资源得到了高值化利用，而且减少了环境污染，目前国内尚未见到类似研究报道。目前国内外制备高F值寡肽的原料多采用牛乳酪蛋白、玉米醇溶蛋白、猪血等，需要通过脱苦、脱色处理才能得到品质较好的产品，产品的F值大多在21-35之间。本试验所用原料为鱿鱼加工的副产物，采用的风味蛋白酶在脱芳的同时，还能切掉肽链端的部分疏水性氨基酸，达到脱苦的效果。因此本法制备的高F值寡肽具有原料充分、成本低廉、工艺简单、产品风味好的特点。

尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

Claims (6)

1.鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是包括如下步骤：

①固定化胃蛋白酶制备步骤：取壳聚糖粉末溶解于质量分数为0.1%至8%的HAc溶液，并且搅拌1小时至5小时后得到壳聚糖溶液；将所述的壳聚糖溶液加入到固定化液浸泡后低温静置；再将所述的静置处理后的固定化液干燥处理，并收集微球；将所述的微球放入乳酸缓冲溶液中混合均匀待用；所述的固定化液含有NaOH和酒精；

②固定化风味酶制备步骤：取风味酶粉溶解于0.02mol/L，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液制成酶液；将所述的酶液加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌均匀；注射器吸入上述混合液，注入3.0%的                                               溶液中得到凝胶珠，并在继续溶液中固定化；将所述的凝胶珠抽滤后得到硬化的凝胶珠，洗去表面的，即得到球状固定化风味酶；

③动态串联酶处理步骤：按重量份数取10至50份鱿鱼碎肉加入100至250份水制成匀浆，调pH至3，加入步骤①处理制得的微球，在45至55℃条件下恒温水解1至5小时后制得第一步酶解多肽液；在所述的第一步酶解多肽液中按每克加入1000至1900U的所述的球状固定化风味酶进行第二步酶解；

④吸附脱芳处理步骤：将步骤③处理得到的第二步酶解的产物在pH为3，流速为1BV/h进行脱芳处理后得到高F值寡肽。

2.根据权利要求1所述的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是：步骤①中搅拌温度为20℃至30℃；步骤①中，所述的固定化液按体积份数含有4份10%NaOH、1份95%酒精。

3.根据权利要求1所述的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是：步骤①中所述的乳酸缓冲溶液按体积份数含有2至4份浓度为5%的戊二醛、5至10份胃蛋白酶液和6 至8份乳酸。

4.根据权利要求1所述的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是：步骤①中乳酸缓冲溶液中混合的处理温度为35℃。

5.根据权利要求1所述的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是：步骤②中所述的海藻酸钠溶液的浓度为2.5%，酶液体积/海藻酸钠体积为1:2，溶液中固定化的时间为3小时。

6.根据权利要求1所述的鱿鱼碎肉制备高F值寡肽固定化酶水解方法，其特征是：步骤③中所述的第二次酶解的处理温度是40至55℃，pH为7，处理时间为3至5小时。