CN104774255A - 海蜇来源的生物活性肽及其制备方法 - Google Patents

海蜇来源的生物活性肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种海蜇来源的生物活性肽及其制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明从海蜇的蛋白酶解产物中分离纯化制备得到1个新的含有4个氨基酸序列的短肽，其序列鉴定为Val-Gly-Pro-Tyr，体外活性显示具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。本发明旨在为海蜇资源的开发和利用提供理论依据。

Description

海蜇来源的生物活性肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及从海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)的蛋白酶解产物中分离纯化具有1个新的生物活性肽，属于海洋生物技术领域。
背景技术
生物活性肽(biologically active peptide)是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。生物活性肽的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面，其生理功能主要有类吗啡样活性、激素和调节激素的作用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，免疫调节，抗血栓，抗高血压，降低胆固醇，抑制细菌、病毒，抗癌等作用，抗氧化和清除自由基作用，改善元素吸收和矿物质运输，促进生长，调节食品风味、口味和硬度等。因此，生物活性肽是药物筛选、制备疫苗和食品添加剂的天然资源宝库。
海蜇(Rhopilema esculentum Kishinouye)属于根口水母目(Rhizostomeae)，腔肠动物，作为一种药食同源的大型水母，在我国有广阔的资源分布和悠久的应用历史，早在一千六百多年前就已经开始为世人所食用。海蜇除食用外，全身均可入药，祖国医学认为其性味咸平，入肺、肝两经，有润肺、化痰、止咳、清热、消食、润肠等功效。据李时珍《本草纲目》所述，海蜇“气味咸温无毒、主治妇，入劳损、积血带下，小儿风疾丹毒，烫火伤”等，对气管炎、哮喘、高血压、胃溃疡、单纯性甲状腺肿大等症均有疗效。近年来我国医卫部门关于海蜇的药用价值也有许多报道。认为对治疗高血压、慢性气管炎、哮喘、热痰咳嗽、胃溃疡，单纯性甲状腺肿和颈淋巴结肿等，有一定疗效。尤其是海蜇的降压作用比较显著，药理研究证明：海蜇蛋白酶解产物对肾动脉狭窄高血压模型动物具有明显的降压作用。海蜇主要是由水，蛋白质、灰分、碳水化合物、脂肪等物质组成。近代研究分析表明：每100 g海蜇食部中，含水分65.0 g，灰分18.7 g，蛋白质12.3 g，碳水化合物3.9 g，脂肪0.1 g，钙182 mg，铁9.5 mg，硫胺素0.01 mg，核黄素0.04 mg，尼克酸0.2 mg，胆固醇16 mg。海蜇的许多药理活性都与其所含蛋白有关，由此推测海蜇的蛋白酶解产物中可能存在一定数量的生物活性肽。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法。
本发明从海蜇蛋白的酶解产物中分离纯化出1个新的生物活性肽，其序列分别为Val-Gly-Pro-Tyr，药理学活性研究显示其体外具有较高的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，其IC50为8.40±0.58 μM，但不限于此：
1.      海蜇蛋白酶解产物的制备
将三矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5―6小时，用清水洗涤后，重复上述操作三次，沥干后加适量水打浆，加水至10倍量，加入4% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解专用酶(南宁东恒华道生物科技有限公司)调整pH 至8.0，温度55℃水解4.5 h，100℃加热10 min灭酶后，4000转/分离心15 min，取上清液。
采用分子量为5000 Da的超滤膜对上清液进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件：分子量为150―300截留膜，进膜压力11Bar，出膜压力11Bar。截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度控制条件：0―50 min，0℃升至20℃；50―300 min，20℃；300―350 min，20℃升至40℃；350―750 min，40℃；750―800 min，40℃降至20℃；真空度为40 pa，温度-30℃，最终得到海蜇蛋白酶解产物。
2.      生物活性肽的分离纯化
2.1  Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析
取1中海蜇蛋白酶解产物蒸馏水溶解成200 mg/ml溶液，Sephadex LH-20凝胶色谱柱(2.0 cm×60 cm)进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.6 ml/min，220 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用。
2.2  高效液相色谱的分离纯化
用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Waters Atlantis, T3, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1。流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为220 nm和280 nm。收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。
表1 高效液相色谱分离条件
序列测定利用氨基酸序列分析仪及质谱仪，对收集所得的组分进行氨基酸序列分析。
3.      ACE抑制活性的测定
将Cushman-Cheung(1971)方法略作修改。原理是37 ℃、pH 8.3 条件下，ACE催化水解血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸(Hip)，它在紫外228 nm 处具有特征吸收峰，通过生成物Hip的变化计算ACE抑制率。具体操作如下：用1.5 ml离心管，空白对照组加入100 μl 5 mmol/l HHL，用硼酸缓冲液(pH 8.3)补足至120 μl，37 ℃恒温水浴保温5 min，加入5 μl 0.1 U/ml ACE启动反应；样品组加入100 μl 5 mmol/l HHL和20 μl水解液后，37 ℃恒温水浴保温5 min，加入5 μl 0.1 U/mlACE启动反应。之后两组均37 ℃恒温保持30 min后，加入1 mol/L HCl 200 μl 中止反应，补加175 μl硼酸缓冲液。用高效液相色谱法测定Hip含量。对应的峰面积分别为S对照和S样品。
ACE抑制率 (%)= (S对照－S样品) /S对照×100
本发明分离得到的1个新的生物活性肽，具有较好的ACE抑制活性，其IC50为8.40±0.58 μg/ml。本发明的所得的生物活性肽为白色粉末，易溶于水。
   本发明的有益效果是：采用了酶-膜耦联技术对海蜇进行了深层次开发，具体体现在：1. 以海蜇作为酶解原料；2. 采用凝胶色谱法和高效液相色谱法从海蜇蛋白酶解产物中分离纯化生物活性肽。3. 该肽具有较好的体外ACE抑制活性。
附图说明
图1是海蜇蛋白酶解产物的Sephadex LH-20凝胶色谱分离图(Sephadex LH-20洗脱曲线)；图2是组分3高效液相分析图谱(检测波长 220 nm)；图3是氨基酸序列化学式；图4是生物活性肽的质谱分析图(m/z: 435, [M+H])。
具体实施方式
1.      海蜇蛋白酶解产物的制备
将三矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5―6小时，用清水洗涤后，重复上述操作三次，沥干后加适量水打浆，加水10倍量水，加入4% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解专用酶(南宁东恒华道生物科技有限公司)，调整pH 至8.0，温度55℃水解4.5 h，100℃加热10 min灭酶后，4000转/分离心15 min，取上清液。
采用分子量为5000 Da的超滤膜将上清液过滤，收集超滤分子量小于5000 Da的部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件：分子量为150―300截留膜，进膜压力11 Bar，出膜压力11 Bar。截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度控制条件：0―50 min，0℃升至20℃；50―300 min，20℃；300―350 min，20℃升至40℃；350―750 min，40℃；750―800 min，40℃降至20℃；真空度为40 pa，温度－30℃，得到海蜇蛋白酶解产物。
2.      生物活性肽的分离纯化及结构鉴定
2.1 Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离纯化
海蜇蛋白酶解产物经Sephadex LH-20凝胶柱分离后，可得到5个峰。如附图1所示。
2.2 高效液相色谱分析
组分3经过高效液相进一步分离纯化如附图2，收集活性肽3-1冷冻干燥后，进行氨基酸序列分析。
2.3 氨基酸序列分析
利用Edman降解法和质谱分析，对所制备的活性肽段进行氨基酸序列分析和分子量测定，其结构序列为Val-Gly-Pro-Tyr，其ACE抑制活性IC50为8.40±0.58 μM。结构详见附图3和附图4。
本发明所涉及的生物活性肽是以海蜇为原料，经过酶-膜耦联技术，色谱技术制备得到的具有新序列的四肽，体外活性实验显示该肽具有较好的ACE抑制活性。目前大量研究显示，来源于食品蛋白的ACE抑制肽具有降压稳定，毒副作用小的优点，是辅助降血压功能食品的良好来源。本发明集酶-膜耦联技术于一体，对海蜇这一量大而至今未被有效利用的海洋蛋白资源进行深入的开发利用，发现了1个具有体外ACE抑制活性的新肽，为以后降血压药物或保健食品的研发奠定了理论基础。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  山东省科学院生物研究所
 
<120>  海蜇来源的生物活性肽及其制备方法
 
<130>  qzb15-4-14生物所发1
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  4
<212>  PRT
<213>  海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）
 
<400>  1
Val Gly Pro Tyr
1  
 

Claims (4)

1. 一种海蜇来源的生物活性肽，其特征是具有如下序列的短肽：Val-Gly-Pro-Tyr。
2.根据权利要求1所述的一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法，其特征是它包括如下步骤：（1）海蜇蛋白酶解产物的制备；海蜇用海产品水解专用酶酶解，经超滤和纳滤脱盐冻干得海蜇蛋白酶解产物；（2）生物活性肽的分离纯化；将海蜇蛋白酶解产物采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到一个新的四肽，体外活性显示其具有较好的ACE抑制活性。
3.根据权利要求2所述，其特征是所述海蜇蛋白酶解产物的制备包括如下步骤：将三矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5―6小时，用清水洗涤后，重复上述操作三次，沥干后加适量水打浆，加水至10倍量，加入4% (以底物蛋白含量计，w/w%)海产品水解专用酶(南宁东恒华道生物科技有限公司)调整pH 至8.0，温度55℃水解4.5 h，100℃加热10 min灭酶后，4000转/分离心15 min，取上清液；
采用分子量为5000 Da的超滤膜对上清液进行超滤处理，收集分子量小于5000 Da的部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件：分子量为150―300截留膜，进膜压力11 Bar，出膜压力11 Bar；截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度控制条件：0―50 min，0℃升至20℃；50―300 min，20℃；300―350 min，20℃升至40℃；350―750 min，40℃；750―800 min，40℃降至20℃；真空度为40 pa，温度-30℃，最终得到海蜇蛋白酶解产物。
4.根据权利要求2所述的一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法，其特征是生物活性肽的分离纯化包括如下步骤：
（1） Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析；
取海蜇蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成200 mg/ml溶液，Sephadex LH-20凝胶色谱柱2.0 cm×60 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.6 ml/min，220 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用；
（2）高效液相色谱的分离纯化；
用高效液相色谱进一步分离纯化；
色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Waters Atlantis, T3, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为220 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。
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