CN105175500B - 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途，属于海洋生物技术领域。本发明从单环刺螠内脏的蛋白酶解产物中分离纯化制备得到1个新的含有5个氨基酸序列的短肽，其序列鉴定为Gln‑Pro‑Met‑Thr‑Phe，ESI‑MS检测分子量为552.72 Da。体外活性显示具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性，可用于制备防高血压保健食品。

Description

采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途

技术领域

本发明涉及一种海洋生物活性多肽及其应用，尤其涉及采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途。

背景技术

单环刺螠( Urechis unicinctus)，俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科。体粗大，长约100-300 mm，宽约25-27 mm，长200mm-250 mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛1对，粗大；肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛。分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。它个体肥大, 肉味鲜美, 体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来, 在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品,有较高的经济价值。人们的传统做法只食用其体壁，而废弃内脏，菜肴俗称海肠子。

单环刺螠提取的多肽有一定的抗肿瘤及提高小鼠免疫功能的作用, 肿瘤的发生是多种原因作用的结果，但最终都要涉及到癌基因的表达调控。不同的肿瘤产生时所需要的酶等调控因子不同，选择特异性小肽作小于肿瘤发生时所需的调控因子等，封闭其活性位点，可防止肿瘤发生。现在已发现很多肿瘤相关基因及肿瘤产生调控因子，筛选与这些靶点特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点，值得一提的是，传统的抗肿瘤药物由于缺乏对癌细胞的选择性，往往在治疗的同时产生不良反应。抗肿瘤活性多肽与此不同，在杀伤肿瘤细胞的同时对免疫系统起保护作用。已有实验证明单环刺螠多肽在体外抑制人肝癌细胞生长,并可以增强小鼠免疫力,抑制小鼠S180肉瘤的生长。但由于近几年由于捕捞强度过大，野生资源已显不足。现今，我国也陆续开展了单环刺螠人工培育苗种的生产性研究。本发明专利涉及到对单环刺螠内脏进行酶解获得降压活性多肽，为单环刺螠多肽类活性物质的开发提供重要参考。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种具有较好的ACE抑制活性的、源自单环刺螠的采用高效液相色谱制备的活性多肽。该采用高效液相色谱制备的活性多肽的氨基酸序列为Gln-Pro-Met-Thr-Phe，ESI-MS检测分子量为552.72 Da。该活性多肽有用于制备防高血压保健食品的用途。

附图说明

图1是本发明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的质谱（ESI-MS）图；

图2是本发明Gln-Pro-Met-Thr-Phe的结构式；

图3是本发明凝胶纯化图；

图4是本发明液相纯化图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例：单环刺螠内脏来源的生物活性肽，具体为具有如下序列的短肽：Gln-Pro-Met-Thr-Phe。

其制备步骤如下：（1）内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40℃的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎。取单环刺螠内脏粉按1:20（质量体积比，50 g：1000 mL）加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终得到的上清液为实验样品，浓缩。将样品按1：5（质量体积比，10 g：50mL）加入蒸馏水，然后调节pH 6.8，加入2%（质量分数）木瓜蛋白酶在60 ℃水浴中加热4 h，后用100℃水浴加热15 min灭酶, 在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4 h，提取温度60 ℃，pH：10，加酶量0.5%（质量分数）。提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 ℃冰箱中放置过夜。上清浓缩冷冻干燥。

（2）生物活性肽的分离纯化；将单环刺螠蛋白酶解产物采用Sephadex G-15凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到一个新的五肽，体外活性显示其具有较好的ACE抑制活性。

生物活性肽的分离纯化包括如下步骤：

（1） Sephadex G-15凝胶色谱柱层析；

取单环刺螠内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色谱柱2.0 cm×100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用。

（2）高效液相色谱的分离纯化；

用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Zorbax C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。液相纯化图中的折线为流速示意，供参考。

表1 高效液相色谱分离条件

4.序列测定

利用氨基酸序列分析仪及质谱仪，对收集所得的组分进行氨基酸序列分析。

5.ACE抑制活性的测定

将Cushman-Cheung(1971)方法略作修改。原理是37 ℃、pH 8.3 条件下，ACE催化水解血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸(Hip)，它在紫外228nm 处具有特征吸收峰，通过生成物Hip的变化计算ACE抑制率。具体操作如下：用1.5 ml离心管，空白对照组加入100 μl 5 mmol/l HHL，用硼酸缓冲液(pH 8.3)补足至120 μl，37 ℃恒温水浴保温5 min，加入5 μl 0.1 U/ml ACE启动反应；样品组加入100 μl 5 mmol/l HHL和20 μl水解液后，37 ℃恒温水浴保温5 min，加入5 μl 0.1 U/mlACE启动反应。之后两组均37 ℃恒温保持30 min后，加入1 mol/L HCl 200 μl 中止反应，补加175 μl硼酸缓冲液。用高效液相色谱法测定Hip含量。对应的峰面积分别为S_对照和S_样品。

ACE抑制率 (%)= (S_对照－S_样品) /S_对照×100

本发明分离得到的1个新的生物活性肽，具有较好的ACE抑制活性，其IC₅₀为8.80±0.52 μg/ml。本发明的所得的生物活性肽为白色粉末，易溶于水。

本发明的有益效果是：采用了酶解-柱色谱联技术对海蜇进行了深层次开发，具体体现在：1. 以单环刺螠内脏作为酶解原料；2. 采用凝胶色谱法和高效液相色谱法从单环刺螠酶解产物中分离纯化生物活性肽。3. 该肽具有较好的体外ACE抑制活性，可用于制备防高血压保健食品。

尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。

Claims (2)

1.采用高效液相色谱制备的活性多肽，其特征是：所述的活性多肽的氨基酸序列为Gln-Pro-Met-Thr-Phe，ESI-MS 检测分子量为 552.72 Da。

2.权利要求1所述的采用高效液相色谱制备的活性多肽的用途，其特征是：所述的活性多肽用于制备防高血压保健食品的用途。