CN106086129A - 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法 - Google Patents

一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106086129A
CN106086129A CN201610239229.XA CN201610239229A CN106086129A CN 106086129 A CN106086129 A CN 106086129A CN 201610239229 A CN201610239229 A CN 201610239229A CN 106086129 A CN106086129 A CN 106086129A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monocycle
thorn
preparation
chelating peptide
internal organs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610239229.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李佩佩
张小军
陈思
龙举
陈荫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Original Assignee
Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Marine Fisheries Research Institute filed Critical Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Priority to CN201610239229.XA priority Critical patent/CN106086129A/zh
Publication of CN106086129A publication Critical patent/CN106086129A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法，该锌螯合肽以单环刺螠内脏作为原料，经内脏的预处理、蛋白提取、酶解、凝胶纯化和色谱制备。所制备的锌螯合肽的氨基酸序列为Phe‑Pro‑Tyr‑Lys‑His，ESI‑MS检测分子量为690.78 Da；该锌螯合肽的制备为补锌保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为单环刺螠内脏的高值化利用提供了一条新思路。

Description

一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种动物内脏活性多肽的制备方法，尤其涉及单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽。
背景技术
活性生物肽以广泛的生物活性及其在医药、保健品、食品和化妆品等应用上的独特功效被越来越多的消费者所青睐，使其成为食品行业和保健品行业、日化行业所竞相关注的焦点。锌是人体必须的微量元素, 其缺乏可导致儿童生长发育不良、智力发育落后、免疫力降低等病症。传统的锌补充剂（如葡萄糖酸锌、柠檬酸锌）吸收利用率低，肠胃刺激大，不易长期服用。而锌与金属螯合肽形成的螯合盐，即可促进微量元素的吸收，同时又能满足机体对活性肽、氨基酸等的需求，得到了国内外学者的广泛关注。
单环刺螠( Urechis unicinctus)，俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科。体粗大，长约100一300 mm，宽约25-27 mm，长200mm-250 mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛1对，粗大；肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛。分布于俄罗斯、日本、朝鲜和我国黄渤海沿岸，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。它个体肥大, 肉味鲜美, 体壁肌富含蛋白质和多种人体必需氨基酸。自古以来, 在我国、日本和朝鲜沿海均作为名贵的海鲜食品,有较高的经济价值。人们的传统做法只食用其体壁，而废弃内脏，浪费的宝贵的渔业资源。
基于此，申请人以单环刺螠内脏为原料，利用现代生物技术制备一种具有金属锌螯合活性的肽，既增加了单环刺螠资源的利用率，减少了内脏作为下脚料对环境的危害，同时也为单环刺螠内脏的高值化利用提供了一条新思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺科学合理、易于操作、提取的单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）单环刺螠内脏的预处理：将单环刺螠内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40℃的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎，得单环刺螠内脏粉。
）单环刺螠内脏蛋白的制备：取单环刺螠内脏粉按1:20（质量体积比，50 g：1000mL）加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终得到的上清液为实验样品，浓缩冻干。
）单环刺螠内脏蛋白的酶解：将样品按1：5（质量体积比，10 g：50 mL）加入蒸馏水，然后调节pH 6.8，加入2%（质量分数）木瓜蛋白酶在60 ℃水浴中加热4 h，后用100℃水浴加热15 min灭酶, 在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4 h，提取温度60 ℃，pH：10，加酶量0.5%（质量分数）。提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 ℃冰箱中放置过夜，上清浓缩冷冻干燥，得单环刺螠内脏蛋白酶解产物
4）单环刺螠内脏锌螯合肽的制备：
①Sephadex G-15凝胶色谱柱层析：
取单环刺螠内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色谱柱2.0 cm×100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用
②高效液相色谱的分离纯化：
用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Zorbax C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品；
表1 高效液相色谱分离条件
时间(min) A (水，%) B (乙腈，%)
0 100 0
4 100 0
16 70 30
17 0 100
35 0 100
，根据对Zn的螯合活性得1个高活性的锌螯合肽Phe-Pro-Tyr-Lys-His（FPYKH），ESI/MS检测分子量为690.78 Da。
本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Zn螯合物的独特功效（可同时补充多肽/氨基酸和Zn），以单环刺螠内脏为原材料，通过对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备出具有高活性的锌螯合肽。采用以上技术制备单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽，工艺科学合理、易于操作，且本发明即为补锌保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时也为单环刺螠内脏的高值化利用提供了一条新思路。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶G-15层析图。
图2是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物的RP-HPLC分析图。
图3 是本发明的多肽的质谱图。
图4 是本发明的多肽的结构式。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法，其制备工艺流程如下：单环刺螠内脏"蛋白提取"酶解"酶解物"凝胶纯化"高效液相色谱制备"锌螯合肽。
实施例：
1）单环刺螠内脏的预处理：将单环刺螠内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆。丙酮搅拌脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40℃的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎，得单环刺螠内脏粉。
）单环刺螠内脏蛋白的制备：取单环刺螠内脏粉按1:20（质量体积比，50 g：1000mL）加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终得到的上清液为实验样品，浓缩冻干。
）单环刺螠内脏蛋白的酶解：将样品按1：5（质量体积比，10 g：50 mL）加入蒸馏水，然后调节pH 6.8，加入2%（质量分数）木瓜蛋白酶在60 ℃水浴中加热4 h，后用100℃水浴加热15 min灭酶, 在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。接着采用胰蛋白酶水解4 h，提取温度60 ℃，pH：10，加酶量0.5%（质量分数）。提取完成后调pH至中性后100℃水浴加热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液。减压浓缩至原体积的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 ℃冰箱中放置过夜，上清浓缩冷冻干燥，得单环刺螠内脏蛋白酶解产物
4）单环刺螠内脏锌螯合肽的制备：
①Sephadex G-15凝胶色谱柱层析；
取单环刺螠内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色谱柱2.0 cm×100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用
③高效液相色谱的分离纯化；
用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱(Zorbax C18, 250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。
表1 高效液相色谱分离条件
时间(min) A (水，%) B (乙腈，%)
0 100 0
4 100 0
16 70 30
17 0 100
35 0 100
，根据对Zn的螯合活性得1个高活性的锌螯合肽Phe-Pro-Tyr-Lys-His（FPYKH）。
锌螯合肽对锌离子的螯合作用采用EDTA 滴定法测定：取螯合物100 mg 于100 mL小烧杯中，加水50 mL，滴入HCl（6 mol/L）数滴。摇匀后在水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至l00 mL，从中吸取l0 mL于三角瓶，平行3 份，加入pH 10的NH3-NH4Cl缓冲液l0 mL，铬黑T指示剂适量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA 液滴定至蓝色；记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
测定结果表明：纯化得到的锌螯合肽Phe-Pro-Tyr-Lys-His（FPYKH），ESI/MS检测分子量为690.78 Da，对锌离子的螯合能力为78.51 μg/mg，与蛋白酶解产物（26.32 μg/mg）相比其对Zn的螯合能力有了较大提高。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省海洋水产研究所
<120> 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法
<130> zjhysc-2016-lp0402
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Phe Pro Tyr Lys His
1 5

Claims (3)

1.一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）单环刺螠内脏的预处理：将单环刺螠内脏剪碎后用组织搅碎器搅成匀浆，丙酮搅拌脱脂过夜，离心弃去上清，沉淀在40℃的鼓风干燥箱内烘干过夜后粉碎，得单环刺螠内脏粉；
2）单环刺螠内脏蛋白的制备：取单环刺螠内脏粉按质量体积比1:20，即50 g：1000 mL加入蒸馏水，于80℃的恒温水浴锅内加热4h后，离心取上清液，重复三次上述步骤，最终得到的上清液为实验样品，浓缩冻干；
3）单环刺螠内脏蛋白的酶解：将样品按质量体积比1：5，即10 g：50 mL加入蒸馏水，然后调节pH值至6.8，加入按质量分数2%的木瓜蛋白酶在60 ℃水浴中加热4 h，后用100℃水浴加热15 min灭酶, 在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液，接着采用胰蛋白酶水解4 h，提取温度60 ℃，pH值10，加酶量为按质量分数的0.5%； 提取完成后调pH值至中性后100℃水浴加热15 min灭酶，在离心机中4500 rpm离心20 min后取上清液；减压浓缩至原体积的1/20后，使用95%乙醇沉淀，使乙醇终浓度约为80%，于4 ℃冰箱中放置过夜，上清浓缩冷冻干燥，得单环刺螠内脏蛋白酶解产物；
4）单环刺螠内脏锌螯合肽的制备：
①Sephadex G-15凝胶色谱柱层析；
取单环刺螠内脏蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成100 mg/ml溶液，Sephadex G-15凝胶色谱柱2.0 cm×100 cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.5 ml/min，自动部分收集器收集，每管收集3mL，280 nm测定吸光度，收集各峰，冻干备用；
高效液相色谱的分离纯化；
用高效液相色谱进一步分离纯化；色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱；流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1；流速：1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长为254 nm和280 nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品，根据对Zn的螯合活性得锌螯合肽Phe-Pro-Tyr-Lys-His。
2.表1 高效液相色谱分离条件
根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的反相C18键合硅胶柱是规格为250mm×4.6 mm，5 μm的 Zorbax C18。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所制备的锌螯合肽的氨基酸序列为Phe-Pro-Tyr-Lys-His，ESI-MS检测分子量为690.78 Da。
CN201610239229.XA 2016-04-18 2016-04-18 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法 Pending CN106086129A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610239229.XA CN106086129A (zh) 2016-04-18 2016-04-18 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610239229.XA CN106086129A (zh) 2016-04-18 2016-04-18 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106086129A true CN106086129A (zh) 2016-11-09

Family

ID=58702457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610239229.XA Pending CN106086129A (zh) 2016-04-18 2016-04-18 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106086129A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112457373A (zh) * 2020-12-17 2021-03-09 浙江海洋大学 具有血管紧张素转化酶抑制活性的单环刺螠多肽及其应用
CN113528605A (zh) * 2021-09-16 2021-10-22 中国农业大学 一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105175500A (zh) * 2015-11-05 2015-12-23 浙江省海洋水产研究所 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途
CN105192246A (zh) * 2015-07-09 2015-12-30 浙江海洋学院 虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法
CN105203671A (zh) * 2015-11-05 2015-12-30 浙江省海洋水产研究所 海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法
CN105192718A (zh) * 2015-07-09 2015-12-30 浙江海洋学院 虾仁下脚料锌螯合肽的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105192246A (zh) * 2015-07-09 2015-12-30 浙江海洋学院 虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法
CN105192718A (zh) * 2015-07-09 2015-12-30 浙江海洋学院 虾仁下脚料锌螯合肽的用途
CN105175500A (zh) * 2015-11-05 2015-12-23 浙江省海洋水产研究所 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途
CN105203671A (zh) * 2015-11-05 2015-12-30 浙江省海洋水产研究所 海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112457373A (zh) * 2020-12-17 2021-03-09 浙江海洋大学 具有血管紧张素转化酶抑制活性的单环刺螠多肽及其应用
CN113528605A (zh) * 2021-09-16 2021-10-22 中国农业大学 一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liang et al. Nutritional compositions of Indian Moringa oleifera seed and antioxidant activity of its polypeptides
Kazir et al. Extraction of proteins from two marine macroalgae, Ulva sp. and Gracilaria sp., for food application, and evaluating digestibility, amino acid composition and antioxidant properties of the protein concentrates
Tkaczewska et al. Identification of antioxidant peptides in enzymatic hydrolysates of carp (Cyprinus carpio) skin gelatin
De Domenico et al. Barrel jellyfish (Rhizostoma pulmo) as source of antioxidant peptides
Paiva et al. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from Ulva rigida C. Agardh protein hydrolysate
He et al. Preparation and functional evaluation of oligopeptide-enriched hydrolysate from shrimp (Acetes chinensis) treated with crude protease from Bacillus sp. SM98011
Echave et al. Seaweed protein hydrolysates and bioactive peptides: Extraction, purification, and applications
Samarakoon et al. Purification and identification of novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cultured marine microalgae (Nannochloropsis oculata) protein hydrolysate
CN103992384B (zh) 一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途
CN104710525A (zh) 一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源锌螯合胶原肽及其制备方法和用途
CN105203671B (zh) 海洋生物源多肽的高效液相色谱和凝胶渗透色谱分离纯化方法
CN103882083B (zh) 一种抗氧化胶原肽的制备方法
CN104774896A (zh) 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法
JP6893885B2 (ja) ブロス組成物およびプレバイオティクスとしてのその使用
CN109293740A (zh) 一种牡蛎来源的ace抑制及抗肿瘤活性肽
CN107573406B (zh) 一种单环刺螠生物活性肽及其制备方法
CN103230587A (zh) 一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物及其制备方法
Xie et al. Meretrix meretrix: Active components and their bioactivities
Yang et al. Roe protein hydrolysates of giant grouper (Epinephelus lanceolatus) inhibit cell proliferation of oral cancer cells involving apoptosis and oxidative stress
CN105175500B (zh) 采用高效液相色谱制备的活性多肽及其用途
CN106560518B (zh) 一种绿侧花海葵抗前列腺癌寡肽的制备方法
CN106086129A (zh) 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法
CN106084000A (zh) 一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽
CN102660615B (zh) 一种抗氧化肽及其制备方法
CN104152518A (zh) 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161109

RJ01 Rejection of invention patent application after publication